Bài viết trình bày những phát hiện của chúng về vai trò của MLF ở vi khuẩn S.muatans và có thể ở cả những chủng vi khuẩn Streptococcus xoang miệng khác nhau trong việc bảo vệ tế bào khỏi tổn thương oxi hóa gây ra bởi các gốc oxi hoạt động (ROS).
33(4): 92-96 12-2011 T¹p chÝ Sinh häc L£N MEN MALOLACTIC CủA Streptococcus mutans Và VAI TRò BảO Vệ VI KHUẩN KHỏI TổN THƯƠNG OXI Hóa NGUYễN THị MAI PHƯƠNG Viện Công nghệ sinh học ROBERT E MARQUIS Đại học Rochester, Hoa Kú Lªn men malolactic (malolactic fermentation - MLF) vi khuẩn Oenococcus oeni thực đ đợc nghiên cứu chi tiết vai trò quan trọng công nghiệp sản xuất rợu [5] Đây trình lên men thứ cấp sau trình lên men rợu nấm men thực Trong trình lên men này, axit L-malic dicarboxylic đợc chuyển hóa thành axit monocarboxylic L-lactic giải phóng CO2, giúp làm tăng hơng vị làm giảm độ axit rợu Sự lên men đợc phát nhiều chủng vi khuẩn lactic (LAB) khác nh thành viên chi Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus [1-3] Quá trình decarboxyl hóa L-malic đợc thực nhờ enzim malolactic (MLE) với có mặt NAD+ Mn2+ [11] Sự lên men kèm với trình sinh tổng hợp ATP đợc xúc tác enzim F(H+)-ATPase màng, trình lên men dẫn đến kiềm hóa tế bào chất L-lactic hình thành có độ axit thấp L-malic Điều cho phép proton đợc vận chuyển từ bên vào tế bào chất thông qua hoạt động enzim FATPase theo chế synthetase Kết ATP đợc hình thành Mặt khác, sinh tổng hợp ATP liên quan đến hệ thống vận chuyển đối ngợc malate/lactate (antiport) có tham gia F(H+)-ATPase [9] Gần đây, Sheng Marquis [10] đ ph¸t hiƯn thÊy chđng Streptococcus mutans UA159 cã mang c¸c gene m hoá cho trình lên men malolactic ®ã cã SMu 0121 m hãa cho MLE cã tr×nh tự base tơng tự nh trình tự enzim chủng LAB [1, 4] Khi nghiên cứu sinh lý trình này, tác giả đ phát thấy MLF có vai trò làm kiềm hóa mảng bám (dental plaque), làm tăng khả chịu stress axit vi khuẩn S mutans Bài báo 92 trình bày phát vai trò MLF vi khuẩn S mutans chủng vi khuẩn Streptococcus xoang miệng khác việc bảo vệ tế bào khỏi tổn thơng oxi hóa gây gốc oxi hoạt động (ROS) O2-, H2O2 OH- I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Chủng vi khuẩn điều kiện nuôi cấy Streptococcus mutans UA159 đợc nuôi giữ cấy chuyển hàng tuần môi trờng thạch chứa bovine heart infusion - BHI agar (Difco Laboratories, Detroit, MI) TÕ bào đợc nuôi cấy môi trờng TYM chứa 3% tryptone, 0,5% cao nÊm men, 25 mM glucose vµ 50 mM L-malic để cảm ứng hoạt tính enzim malolactic (MLE) Đo lên men L-malic Tế bào đợc thu hoạch giai đoạn đầu phase ổn định đợc rửa lần cách ly tâm tốc ®é 6000 g 15 ë 4oC víi dung dịch muối có chứa 50 mM KCl mM MgCl2 Tế bào sau đợc hòa trở lại với dung dịch muối mật độ tế bào khoảng 1,1 mg trọng lợng khô/ml Axit L-malic pH 4,0 đợc thêm vào nồng độ cuối 10 mM để bắt đầu phản ứng Sự tiếp nhận L-malic thời điểm định đợc đo việc xác định hàm lợng L-malic đ đợc chuyển hóa thành axit L-lactic sư dơng kÝt cđa h ng Boehringer Mannheim (Darmstadt, Germany) có chứa enzim L-malic dehydrogenase Đây phơng pháp đặc hiệu để xác định axit L-malic Khả tiếp nhận L-malic tế bào từ trình MLF đợc biểu diễn đơn vị nanomole L-malic decarboxylated/phút/mg trọng lợng khô tế bào II KếT QUả Và THảO LUậN Tác dụng bảo vệ tế bào Xác định hàm lợng ATP có tế bào chất mmole L-malate đợc tiếp nhận/giờ/mgTLK Hàm lợng ATP tế bào chất S mutans đợc xác định theo phơng pháp đo ATP huỳnh quang (bioluminescence) đ đợc Sheng & Marquis mô tả (2006) ATP đợc chiết từ tế bào ®Öm Tris-HCl 20 mM nãng cã chøa EDTA mM, pH 7,75 Hàm lợng ATP dịch chiết sau đợc xác định sử dụng kit Luciferase/Luciferin h ng Promega (Madison, WI) máy đo huỳnh quang Luminometer Turner Designs (Sunnyvale, CA), Model DT-20/20 12 11 10 3.0 3,0 3.5 3,5 4.0 4,0 pH 5.0 5,0 6.0 6,0 H×nh MLF S mutans giá trị pH khác 7.0 7,0 MLF khả tiếp nhËn L-malic ë vi khn S mutans HƯ thèng lªn men L-malolactic đợc phát nghiên cứu S mutans gần [10] Hệ thống đợc xem có vai trò bảo vệ tế bào S mutans khỏi tổn thơng stress axit gây MLF đợc bắt đầu việc tiếp nhận L-malic nhờ enzim permease nằm màng (Smu 0125) sau chất đợc chuyển hóa thành axit L-lactic CO2 nhờ MLE nằm tế bào chất chủng vi khuẩn có MLF đ biết nh LAB, MLF xảy mạnh giá trị pH thấp 3,0 [5, 11] Để tìm hiểu khả tiếp nhận L-malic S mutans, đ tiến hành xác định khả đồng hóa L-malic giá trị pH khác để tìm điều kiện pH tối thích cho trình lên men S mutans Kết trình bày hình cho thấy, MLF S mutans diễn giá trị pH khác từ 3,0 đến 7,0 Tuy nhiên, giá trị pH 4,0 thích hợp cho hoạt động MLF cđa S mutans, ®ång nghÜa víi viƯc vi khn có khả tiếp nhận L-malic tốt MLF pH 4,0 đạt tới 10,2 mmole/phút/mg trọng lợng khô (TLK) tế bào so với giá trị 3,2 pH 3,0; 7,8 ë pH 5,0; 4,0 ë pH 6,0 vµ 1,6 pH 7,0 Động học trình tiếp nhận L-malic pH 4,0 đ đợc xác định (hình 2) cho thấy, giá trị pH 4,0, trình tiếp nhận đạt mức độ tuyến tính khoảng thời gian 60 phút sau tiến dần đến giá trị b o hòa Những kết thu đợc sở để lựa chọn điều kiện thích hợp cho nghiên cứu MLF mmole L-malate đợc tiếp nhận/giờ/mgTLK Các gốc oxi hoạt động (ROS) đợc nghiên cứu bao gồm H2O2 (Sigma), OH- (tạo thành từ phản ứng Fenton H2O2 kết hợp với ion kim loại có khả chuyển đổi Cu2+) O2- (tạo thành từ hệ thống xanthine-xanthine oxidase) Cụ thể, tế bào S mutans sau nuôi cấy môi trờng TYM đợc thu hoạch, rửa hòa lại dung dịch muối có chứa 50 mM KCl mM MgCl2 nồng độ 0,4 mg trọng lợng khô tế bào L-malic pH 4,0 đợc thêm vào dung dịch tế bào để đạt nồng độ cuối 30 mM Sau đó, H2O2, tổ hợp chất H2O2/CuCl2 (để tạo OH-) hay tổ hợp chất xanthine/xanthine oxidase (để tạo O2-) đợc tiếp tục thêm vào thời điểm định, 100 àL mẫu đợc lấy ra, pha lo ng 10 lần liên tiếp với dung dịch peptone 1% (Difco Laboratories, Detroit, MI) pH 7,0 đợc cấy trải đĩa thạch BHI Các đĩa đợc ủ tủ ấm 37oC vòng 48 khuẩn lạc hình thành rõ rệt, đếm đợc b»ng m¾t th−êng [8] 0 40 80 120 160 200 Phút Hình Động học trình tiếp nhận L-malic S mutans giá trị pH 4,0 93 A 0,5 Đối chứng 58 mM H2O2 58 mM H2O2+ 30 mM L-malic Log N/No -0,5 -1,5 -2,5 -3,5 -4,5 -5,5 B 10 20 30 40 50 60 70 Phót §èi chøng 49 mM H2O2 + 29 mM CuCl2 Log N/No -2 30 mM L-malic +49 mM H2O2 + 29 mM CuCl2 49 mM H2O2 -4 29 mM CuCl2 -6 -8 -10 Log N/No C 10 20 30 40 50 60 70 Phót 0,5 -0,5 §èi chøng 1,25 mM xanthine + 50 mU/ml xanthine oxidase (XO) -1,5 30 mM L-malic +1,25 mM xanthine + 50 mU/ml XO -2,5 1,25 mM xanthine 50 mU/ml XO -3,5 -4,5 -5,5 -6,5 10 20 30 40 50 60 70 Phút Hình LMF bảo vệ S mutans khỏi tác dụng gây chết gốc tự A H2O2; B OH-; C O22 MLF b¶o vƯ S mutans khỏi tác dụng gây chết gốc tự MLF đợc phát có vai trò bảo vƯ S mutans khái tỉn th−¬ng axit [10], nh−ng cha có công bố đề cập đến vai trò trình sinh lý khác tế bào có stress oxi hãa, cïng víi stress axit lµ hai stress rÊt phỉ biến mảng bám Các vi khuẩn xoang miệng có S mutans mảng bám phải thờng xuyên tiếp xúc với gốc ROS [7] Các gốc 94 ROS có khả công đại phân tử sinh học tế bào nh protein, ADN lipid, gây chết tế bào [6] Vậy hệ thống MLF có vai trò nh việc bảo vệ tế bào khỏi tác dụng gây tổn thơng oxi hóa ROS gây ra? Để tìm hiểu vấn đề này, đ tiến hành nghiên cứu tác dụng gây chết tế bào S mutans có mặt gốc tự L-malic (cơ chất trình lên men MLF) Kết thu đợc hình 3A cho thấy rằng, mặt L-malic, H2O2 có tác dụng gây chết mạnh tế bào với giá trị D (thời gian gây chết 90% quần thể tế bào) khoảng 15 phút Tuy nhiên, có mặt L-malic trình MLF diễn ra, giá trị D tăng lên đến 27 phút, đồng nghĩa với việc tế bào đ đợc bảo vệ phần khỏi tác dụng ROS Một tranh tơng tự đợc tìm thấy tế bào đợc xử lý với OH- (tạo từ phản ứng H2O2 CuCl2) O2- (tạo từ phản ứng xanthine xanthine oxidase) Đặc biệt, trờng hợp có mặt OH-, tác dụng bảo vệ MLF rõ rệt với giá trị D lần lợt đạt 10 26 phút (hình 3B) Tơng tự nh vậy, tác dụng bảo vệ MLF rõ ràng trờng hợp O2- với giá trị D = 13 phút (hình 3C) Nh thấy rằng, MLF có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi tác dụng công gốc ROS Đây phát mối liên quan MLF stress oxi hóa vi khuẩn nói chung S mutans nói riêng Sinh tổng hợp ATP trình MLF nmole ATP/ mg TLK Hàm lợng ATP tế bào chất S mutans trình MLF pH 4,0 đ đợc xác định để tìm hiểu mối liên quan tác dụng bảo vệ tế bào khỏi tổn thơng oxi hóa ROS MLF trình sinh tổng hợp ATP Kết trình bày hình cho thấy, hàm lợng ATP nội sinh đ tăng lên rõ rệt trình lên men so với đối chứng Tế bào sinh tổng hợp ATP mạnh khoảng 10 phút đầu trình tiếp nhận L-malic trì hàm lợng ATP cao suốt thời gian 60 phút thí nghiệm Trong đó, hàm lợng ATP mẫu đối chứng lại bị giảm dần đợc sử dụng vào hoạt động sống sinh lý tế bào môi trờng bị đói chất gần nh biến sau 60 phút Phát đ đợc Sheng Marquis [10] mô tả tế bào đợc xử lý với stress axit điều kiện có mặt L-malic Nh vậy, số liệu thu đợc nghiên cứu đ cho thấy tăng cờng sinh tổng hợp ATP MLF có vai trò bảo vệ tổn thơng oxi hóa vi khuẩn S mutans thành phần quan trọng đáp ứng với tổn thơng oxi hóa vi khuẩn 3,5 Đối chứng 25 mM L- malic 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 10 20 30 40 50 60 70 Phút Hình Hàm lợng ATP trình MLF pH 4,0 III KếT LUËN Lªn men malolactic ë vi khuÈn S mutans cã vai trò việc bảo vệ vi khuẩn khỏi tác dụng gây chết gốc oxi hoạt động gây thông qua việc tăng cờng sinh tổng hợp ATP trình lên men TàI LIệU THAM KHảO Arthurs C E & Lloyd D., 1999: Kinetics, steroespecificity, and expression of the malolactic enzyme Appl Environ Microbiol, 65: 3360-3363 Battermann G & Radler F., 1991: A comparative study of malolactic enzyme and malic enzyme of different lactic acid bacteria Can J Microbiol, 37: 211-217 Denayrolles M., Aigle M and Lonvaud1 Ansanay V., Dequin S., Blondin B & Barre P., 1993: Cloning, sequence and expression of the gene encoding the malolactic enzyme from Lactococcus lactis FEBS Lett, 332: 74-80 Funel A., 1994: Cloning and sequence analysis of the gene encoding Lactobacillus lactis malolactic enzyme: relationships with malic enzymes FEMS Microbiol Lett, 116: 79-86 95 Herrero M., GarcÝa L A and DÝaz M., 2003: Malolactic bioconversion using a Oenococcusoeni strain for cider production: effect of yeast extract supplementation J Ind Microbiol Biotechnol, 30: 699-704 Arch Microbiol, 174: 248-255 Poolman B., Molenaar D., Smid E D., damage Annu Rev Microbiol, 57: 395418 Ubbink T., Abee T., Renault P P & Konings W N., 1991: Malolactic fermentation: electrogenic malate uptake and malate/lactate antiport generate metabolic energy J Bacteriol, 173: 60306037 Marquis R E., 2004: Applied and 10 Sheng J & Marquis R E., 2006: Imlay J A., 2003: Pathways of oxidative ecological aspects of oxidative-stress damage to bacterial spores and to oral microbes Sci Prog, 87: 153-177 Phan T N., Reidmiller J S and Marquis R E., 2000: Sensitization of Actinomyces naeslundii and Streptococcus sanguis biofilms and suspensons to acid damage by fluoride and other weak acids Enhanced acid resistance of oral streptococci at lethal pH values associated with acid-tolerant catabolism and with ATP synthase activity FEMS Microbiol Lett, 262: 93-98 11 Strasser de Saad A M., Pesce de Ruiz Holgado A A and Oliver G., 1988: Malolactic enzyme in Lactobacillus murinus Biochimie, 70: 357-365 MALOLACTIC FERMENTATION BY Streptoccocus mutans AND PROTECTION AGAINST OXIDATIVE DAMAGE NGUYEN THI MAI PHUONG, ROBERT E MARQUIS SUMMARY Streptococcus mutans is the primary etiological agent of human dental caries The extraordinary ability of S mutans to adapt and survive the environmental stresses in human mouth, particularly oxidative stress even though it does not have catalase, a key protective enzyme against oxidative damage, make it be an attractive subject for dental research In the oral cavity, S mutans is routinely exposed to reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide (H2O2), superoxide (O2•−) and hydroxyl radical (OH•) generated by aerobic respiration, by H2O2 net secretors in plaque dental such as Streptococcus sanguis and S gordonii, or by exposure to H2O2-containing dental care products Alkali production by oral streptococci is considered important for dental plaque ecology and caries moderation Recently, malolactic fermentation (MLF) was identified as a major system for alkali production by oral streptococci, including Streptococcus mutans Malolactic fermentation is inducible by L-malate, involving decarboxylation of L-malate to yield L-lactic acid and concomitant reduction in acidity Our major objectives in the work described in this paper were to further define the physiology of MLF of S mutans and its roles in protection against oxidative stress damage For the first time, L-malic, was found to enhance the protection of S mutans against oxidative damage by reactive oxygen species including O2•− generated by xanthine-xanthine oxidase system; H2O2 and OH• produced via Fenton reaction between H2O2 and metal cations at pH values of 4.0 Protection involved L-malic uptake with the significantly enhanced production of ATP from malate fermentation, to maintain ATP pool levels for physiological activities in the cells In general, oxidative protection by malolactic fermentation against ROS damage involving catabolism of L-malic and ATP production is likely to be an important virulent trait of S mutans Key words: Streptococcus mutans, malolactic fermentation (MLF), oxidative damage Ngµy nhËn bµi: 4-5-2011 96 ... III KếT LUậN Lên men malolactic ë vi khuÈn S mutans cã vai trß vi c bảo vệ vi khuẩn khỏi tác dụng gây chết gốc oxi hoạt động gây thông qua vi c tăng cờng sinh tổng hợp ATP trình lên men TàI LIệU... nghiên cứu đ cho thấy tăng cờng sinh tổng hợp ATP MLF có vai trò bảo vệ tổn thơng oxi hóa vi khuẩn S mutans thành phần quan trọng đáp ứng với tổn thơng oxi hóa vi khuẩn 3,5 §èi chøng 25 mM L- malic... vƯ S mutans khái tác dụng gây chết gốc tự MLF đợc phát có vai trò bảo vệ S mutans khỏi tổn thơng axit [10], nhng cha có công bố đề cập đến vai trò trình sinh lý khác tế bào có stress oxi hóa,