Bài viết trình bày phân loại chủng vi khuẩn BNA5 được phân lập từ đất bị nhiễm DDT bằng phương pháp phân tích trình tự Nucleotit của gien 16S-rRNA thông qua quan sát hình thái của khuẩn lạc và hình thái của tế bào; phân lập các chủng vi sinh vật từ đất bị nhiễm DDT...
29(1): 76-81 3-2007 Tạp chí Sinh học Phân loại chủng vi khuẩn BNA5 đợc phân lập từ đất bị nhiễm DDT phơng pháp phân tích trình tự nucleotit gien 16s-rRNA Nghiêm Ngọc Minh, Cung Thị Ngọc Mai, Đặng Thị Cẩm Hà Viện Công nghệ sinh học Trớc đây, giới nh Việt Nam, việc phân loại vi sinh vật chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy, sinh lý, sinh hóa Việc phân loại có nhiều u điểm xong bộc lộ nhợc điểm định Chẳng hạn chủng vi sinh vật mặt hình thái gần với chi nhng phân tích mức độ phân tử lại thuộc chi khác Cùng với phát triển sinh học phân tử công nghệ gien, phơng pháp phân loại học phân tử đ đời chủ yếu dựa kỹ thuật phân tích ADN Phơng pháp thờng đợc sử dụng nghiên cứu phân loại đa dạng vi sinh vật dùng kỹ thuật sinh học phân tử nh phân tích trình tự gien 16S rRNA, kỹ thuật điện di gel biến tính nồng độ (DGGE), điện di gel biến tính nhiệt độ (TGGE) Những kỹ thuật đ đợc sử dụng để phát định tên đến loài đại diện thuộc chi Streptomyces từ môi trờng nguyên thuỷ đ qua nuôi cấy cho hiệu cao nhiều so với phơng pháp truyền thống [7, 2] Việc định tên loài vi sinh vật dựa cấu trúc gien 16S rRNA có nhiều thuận lợi, đặc biệt rút ngắn đợc thời gian nghiên cứu Gần sử dụng kỹ thuật điện di gel biến tính nồng độ (DGGE) ngời ta đ có khả nghiên cứu tập đoàn xạ khuẩn mẫu tự nhiên cách dễ dàng Điều giúp hiểu sâu sắc tồn nhóm vi sinh vật chúng khả nuôi cấy [2, 5] Tại phòng Công nghệ sinh học môi trờng thuộc Viện Công nghệ sinh học, phơng pháp phân loại vi sinh vật dựa việc so sánh trình tự nucleotit gien m hóa 16S rRNA đ đợc áp dụng thu đợc nhiều kết có giá trị [1, 4, 5] Để phục vụ cho việc giảm thiểu DDT gây ô nhiễm đất, tập đoàn vi sinh vật số chủng vi 76 sinh vật đ đợc nghiên cứu Trong báo này, trình bày kết phân loại hình thái phân tử chủng vi khuẩn BNA5 đợc phân lập từ vùng đất bị ô nhiễm 1,1,1-trichloro2,2-bis (p-chlrophenyl) ethane (DDT) khu vực Bắc Trung Bộ, Việt Nam I phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Chủng vi khuẩn, có ký hiệu BNA5, đợc phân lập từ đất bị nhiễm DDT khu vực huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An theo phơng pháp làm giàu nhiều lần môi trờng khoáng dịch đợc bảo quản glyxêrin 75% ë -80oC Hãa chÊt tinh khiÕt cđa c¸c h ng Sigma, Invitrogien, Fermentas, Prolabo, Merk Sư dơng bé Kit TA cloning Kit cđa h ng InvitrogienTM C¸c trang thiÕt bị đại, xác thuộc Phòng Công nghệ sinh học môi trờng Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia vỊ C«ng nghƯ gien thc ViƯn C«ng nghƯ sinh häc CỈp måi 341F (5’ - CCT ACG GGA GGC AGC AG - 3’) vµ 907R (5’ - CCG TGA ATT CCT TTT AGT TT - 3) đợc thiết kế dựa trình tự nucleotit gien m hóa 16S rRNA Esherichia coli để nhân đoạn gien có kích thớc khoảng 550 bp Phơng pháp a Quan sát hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào Hình thái khuẩn lạc chủng BNA5 đợc quan sát phơng pháp cấy gạt môi trờng hiếu khí tổng số Hình thái tế bào chủng BNA5 đợc quan sát dới kính hiển vi điện tử quét JSML 5410, với hợp tác Viện 69 b Phân loại vi khuẩn dựa vào gien m hãa 16S rRNA T¸ch chiÕt ADN tỉng sè cđa chđng BDN5 theo phơng pháp Sambrook Russell 2001 [8] ADN đợc tinh tiến hành làm phản ứng PCR với cặp mồi 314F 907R Điều kiện phản ứng PCR đợc tiến hành nh sau: hỗn hợp PCR víi tỉng thĨ tÝch lµ 25µl gåm: µl mồi loại (20 pmol); 0,5 àl hỗn hợp dNTPs (2,5 mM); 2,5 àl đệm PCR, àl MgCl2 (25mM); 0,2 µl Taq polymeraza (5 unit/µl), µl ADN tỉng số vi khuẩn Phản ứng đợc thực máy PCR 9700 víi c¸c b−íc nh− sau: b−íc 1: 95oC phót; b−íc 2: 95oC phót; b−íc 3: 55oC phót; b−íc 4: 72oC phút; bớc 5: lặp lại 30 chu kỳ từ bớc ®Õn b−íc 4; b−íc 6: 72oC 10 phót; bớc 7: 4oC nhiều (để giữ mẫu) Sản phẩm phản ứng PCR đợc điện di kiểm tra gel agaroza nồng độ 0,8%, nhuộm gel êtium bromit quan sát dới ánh sáng đèn tử ngoại Sản phẩm PCR đợc gắn trực tiếp vào vectơ pCRR 2.1 nhờ enzim T4-DNA ligaza; sản phẩm lai đợc biến nạp vào chủng E coli INV F' chọn lọc môi trờng LB đặc có chứa 50 mg/l ampixillin, 80 mg/l X-Gal, nuôi cấy 37oC qua đêm Tách chiết làm ADN plasmit theo Sambrook Russell 2001 [8] Xác định trình tự nucleotit gien máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gienetic Analyzer, sư dơng bé kÝt chn BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing So sánh A trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA cđa chđng vi khn BNA5 víi c¸c trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA tơng ứng ngân hàng gien quốc tế EMBL sử dụng phần mềm Clustal X để xây dựng phát sinh chủng loại ii Kết thảo luận Phân lập chủng vi sinh vật từ đất bị nhiễm DDT Từ nguồn đất bị nhiễm DDT ban đầu, đ tiến hành phân lập thu nhận đợc tập đoàn vi khuẩn phát triển môi trờng khoáng có chứa DDT Sau đó, loại khuẩn lạc đợc làm giàu lần đồng thời môi trờng khoáng có bổ sung dịch chiết DDT glucoza 0,1% Trong chủng có khả phát triển tốt môi trờng có DDT, chủng BNA5 có khả phát triển tốt cả, qua nhiều lần tuyển chọn Vì vậy, đ chọn chủng BNA5 để tiến hành nghiên cứu Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi khuẩn BNA5 Chủng BNA5 có khuẩn lạc hình tròn, bề mặt lồi, trơn, màu trắng đục; đờng kính khuẩn lạc khoảng tõ 2-5 mm (h×nh 1A) Chđng vi khn BNA5 thc nhóm vi khuẩn gram dơng Hình dạng tế bào chủng BNA5 đ đợc quan sát kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 15000 lần Tế bào có dạng hình que ngắn, có kích thớc khoảng (1,80-1,87) ì (0,270,53) àm (hình 1B) B Hình Hình dạng khuẩn lạc (A) hình thái tế bào chủng BNA5 (B) 77 Việc quan sát hình dạng khuẩn lạc hình thái tế bào cho thấy, chủng vi khuẩn BNA5 có nhiều đặc điểm giống với loài thuộc chi Bacillus Để làm rõ vị trí phân loại chủng này, đ tiến hành phân loại phân tử chủng vi khuẩn BNA5 dựa trình tự nucleotit gien m hóa 16S rRNA Phân loại dựa trình tự nucleotit gien mã hóa 16S rRNA Hiện nay, nhà phân loại vi sinh vật học đ sử dụng rộng r i kỹ thuật xác định trình tự nucleotit gien m hóa 16S rRNA để phân loại vi khuẩn Kết nghiên cứu gien 16S rRNA đ phản ánh xác vị trí phân loại chủng vi khuẩn Ngoài ra, liệu gien Ngân hàng gien quốc tế giúp cho việc nghiên cứu chủng loại phát sinh chúng cách dễ dàng thuận tiện Để tiến hành phân loại phân tử, đ tách dòng gien 16S rRNA, xác định so sánh trình tự nucleotit chủng vi khuẩn BNA5 với đại diện prokaryot khác Ngân hàng gien quốc tế a Tách chiết ADN tổng số Để tiến hành nghiên cứu phân loại phân tử, việc thu đợc ADN tổng số không bị đứt g y đạt độ tinh cao quan trọng Kết tách chiết ADN tổng số đợc trình bày hình 2 b Nhân đoạn gien 16S rRNA chủng vi khuẩn BNA5 kỹ thuật PCR Để nhân đoạn gien 16S rRNA, chóng t«i sư dơng ADN tỉng sè cđa chủng BNA5 làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu (314F 907R) chu trình nhiệt nh đ trình bày phần phơng pháp Về mặt lý thuyết đoạn gien 16S rRNA (khoảng 550 bp) chủng đợc nhân đoạn kỹ thuật PCR Sau phản ứng, sản phẩm PCR đợc điện di kiểm tra gel agaroza 1%, kết đợc trình bày hình 750 bp Khoảng 550 bp 500 bp Hình Phổ điện di sản phẩm PCR Ghi chú: giếng thị phân tử 1kb (Fermentas); giếng sản phẩm PCR chủng BNA5 Trên điện di đồ (hình 3), chóng ta cã thĨ thÊy s¶n phÈm PCR nhËn đợc băng ADN nhất, sắc nét có kích thớc khoảng 550 bp, với kích thớc theo nh tính toán lý thuyết Điều chứng tỏ phản ứng PCR đ nhân đặc hiệu đoạn gien 16S rRNA có kích thớc mong muốn c Tách dòng gien 16S rRNA vect¬ pCR 2.1 10 11 12 H×nh Phỉ ®iƯn di ADN tỉng sè cđa chđng BNA5 Ghi chú: giếng thị phân tử ADN cắt HindIII E.coRI; giếng sản phẩm ADN tổng số BNA5 Kết hình cho thÊy ADN tỉng sè cđa chđng vi khn BNA5 kh«ng bị đứt g y, để thực nghiên cứu 78 Hình Điện di ®å s¶n phÈm DNA plasmit Ghi chó: hai giÕng 1, 12 đối chứng (vectơ pCR 2.1); giếng 2- 11: ADN plasmit dòng tế bào từ 1- 10 1 500 bp Hình Phổ điện di sản phẩm PCR Ghi chú: giếng thị phân tư 100 bp (fermentas); hai giÕng 2, s¶n phÈm PCR ADN plasmit chủng BNA5 dòng dòng Sau thu đợc sản phẩm PCR, đ tiến hành gắn sản phẩm vào vectơ pCR 2.1 nhờ enzim T4 DNA ligaza biến nạp vào tế bào khả biến E coli (chủng INVF') Sau nuôi tĩnh 18 37oC, đĩa biến nạp xuất khuẩn lạc màu trắng xen kẽ với số khuẩn lạc màu xanh Một số khuẩn lạc màu trắng đ đợc chọn lựa để tiến hành tách ADN plasmit Sản phẩm ADN plasmit thu đợc dòng tế bào chọn lựa đợc điện di kiểm tra gel agaroza 1% Kết đợc trình bày hình Trên điện di đồ, nhËn thÊy mét sè mÉu ADN plasmit ë c¸c giÕng 2, 3, 5, 6, 7, 9, cao h¬n so víi mẫu đối chứng vectơ pCR 2.1 (hai giếng 1, 12) Các ADN plasmit có kích thớc phân tử lớn nên có khả mang sản phẩm mong muốn Để kiểm tra dòng plasmit đợc lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn hay không, đ tiến hành cắt dòng plasmit enzim EcoRI, sau điện di thấy băng đậm, dầy có kích thớc lớn 250 bp Theo trình tự có điểm cắt nằm gần vùng đoạn gien nên khó phân tách thành băng riêng biệt gel agaroza 1% Để kiểm tra lại tợng này, dòng ADN plasmit chọn lọc đợc dùng làm khuôn tiến hành PCR lần hai với điều kiện phản ứng tơng tự nh đ mô tả phần phơng pháp Sản phẩm PCR đợc kiểm tra gel agaroza 1% cho thấy xuất băng có kích thớc khoảng 550 bp nh đoạn gien nghiên cứu (hình 5) Phổ điện di hình cho thấy sản phẩm PCR chủng BNA5 dòng thể băng sắc nét có kích thớc phân tử hợp lý dòng 2, định chọn dòng để tách với số lợng lớn để xác định trình tự chủng BNA5 d Xác định trình tự nucleotit ®o¹n gien 16S rRNA cđa chđng BNA5 ADN plasmit mang đoạn gien có kích thớc phân tử mong muốn đ đợc tách với số lợng lớn làm để xác định trình tự nucleotit Trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA chủng BNA5 đợc xác định phơng pháp Sanger, sử dụng cặp mồi M13F M13R ®Ĩ PCR theo hai chiỊu Sau ph©n tÝch sè liệu trình tự, kết đợc h×nh TAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTA AAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCA CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGC GCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGA ACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGCGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACG CATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTG Hình Trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA chủng BNA5 Ghi chú: phần gạch dới, chữ đậm vị trí cắt enzim cắt hạn chế E coRI Kết hình cho thấy trình tự nucleotit đoạn gien nhận đợc có kích thớc 550 bp (hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết) So sánh trình tự đoạn gien 16S rRNA chủng BNA5 với trình tự nucleotit vi sinh vật nhân sơ (prokaryote) đ đợc công bố Ngân hàng gien quốc tế EMBL phân tích phần mềm Clustal, đ xây dựng đợc phát sinh chủng loại nh hình Trên phát sinh chđng lo¹i, chóng ta cã thĨ thÊy chđng vi khuẩn BNA5 có quan hệ chặt chẽ với chủng thuộc chi Bacillus có độ tơng đồng cao (99,83%) víi chđng Bacillus sp R-16769 vµ víi loµi Bacillus megaterium 79 chủng BNA5 đợc xếp vào chi Bacillus tạm đợc đặt tên chủng Bacillus sp BNA5 Trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA chủng đ đợc đăng ký Ngân hàng gien qc tÕ EMBL víi m sè AM398158 Hichs vµ Corner (1972) đ chứng minh chủng Bacillus megaterium có khả phân hủy DDT [3], suy chủng Bacillus sp BNA5 có khả sử dụng DDT Điều hoàn toàn xảy địa điểm phân lập đợc chủng BNA5 nơi bị ô nhiễm nặng DDT Tuy nhiên, để khẳng định khả sử dụng DDT chủng Bacillus sp BNA5, cần có thêm nghiên cứu xác định mức độ chuyển hóa DDT gien chức tham gia vào trình khử độc B a c illu s s p X L - 0 (A Y 8 ) B a c illu s s p F a (A Y 2 ) B a c il lu s s p R - (A J ) B a c illu s s p B N A5 B a c illu s m e g a te riu m s tra in (D Q ) L o w G + C g m (+ ) (A B 7 ) B a c illu s s p R S (A Y ) B a c illu s m e g a te riu m S tra in (A Y 5 1 ) B a c illu s s p L M G (B S P ) B a cte riu m C W I0 (D Q 3 ) B a c illu s s p K R (A Y 2 ) B a c illu s flex u s (A B 1 ) Hình Cây phát sinh chđng lo¹i cđa chđng vi khn Bacillus sp BNA5 iii KÕt ln Chđng vi khn BNA5 cã khn l¹c hình tròn, bề mặt lồi, trơn, màu trắng đục; đờng kính khuẩn lạc khoảng từ 2-5 mm Chủng BNA5 thuộc nhóm vi khuẩn gram dơng Quan sát dới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng 80 đại 15.000 lần, tế bào chủng BNA5 có dạng hình que ngắn, có kích thớc khoảng (1,801,87) ì (0,27-0,53) àm Kết phân loại thông qua việc xác định trình tự nucleotit đoạn gien m hóa 16S rRNA cho thÊy chđng BNA5 cã mèi quan hƯ gÇn gòi với loài thuộc chi Bacillus Đặc biệt, trình tự nucleotit đoạn gien m hóa 16S rRNA chủng có độ tơng đồng cao với loài Bacillus megaterium (DQ267829) vµ víi chđng Bacillus sp R-16769 (AJ748259), tíi 99,83% Vì vậy, chủng BNA5 tạm đợc đặt tên chủng Bacillus sp BNA5 Trình tự nucleotit đoạn gien m hóa 16S rRNA chủng đ đợc đăng ký Ngân hàng gien quốc tế EMBL với m số AM398158 Tài liệu tham khảo Đặng Thị Cẩm Hà et al., 2003: Tạp chí Công nghệ sinh học, 1(3): 377-386 Heuer H et al., 1997: Appl Environ Microbiol., 63: 3233-3241 Hicks J R et al., 1972: Location and Consequences of 1,1,1-Trichloro-2,2-bis (p Chlorophenyl) Ethane Uptake by Bacillus megaterium: 381-387 Hoàng Thị Mỹ Hạnh et al., 2004: Tạp chí Công nghệ Sinh học, 1(2): 255-264 Nghiêm Ngọc Minh Nguyễn Thành Đức, 2004: Tạp chí Công nghƯ sinh häc, 2(2): 245-252 Nghiªm Ngäc Minh, 2004: Tạp chí Công nghệ sinh học, 2(4): 397-406 Rintala H et al., 2001: Molecular and Cellular Probes, 15: 337–347 Sambrook J and Russell D W., 2001: Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Taxonomy of the bacterial strain bna5 isolated from ddt contaminated soil by analysing the nucleotide sequence of the 16s-rRNA gene Nghiem Ngoc Minh, Cung Thi Ngoc Mai, Dang thi cam Summary The bacterial strain BNA5 was isolated from the DDT contaminated soil of heavy polluted sites Belonging to positive gram bacteria, this strain had round and smooth colony with 2-5 mm diameter The cell morphology of the strain BNA5 observed under the Scaning Electron Microscopy (SEM) showed that it was a short rod with 1.80-1.87 µm in length and 0.27-0.53 µm in wide In this paper, the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene had been used for taxonomy of the strain BNA5 Results of the amplification of the nucleotide sequence with the primers 314F/907R indicated that the strain BNA5 had high homology with the species of the genus Bacillus and was close to the Bacillus megaterium strain (DQ267829) and the strain Bacillus sp R-16769 (AJ748259) at 99.83% Based on the morphology and the 16S rRNA gene nucleotide sequence this strain was classified in the genus Bacillus and named Bacillus sp BNA5 The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene (550bp) was of the strain Bacillus sp BNA5 deposited in the EMBL genbank database (with assession number AM398158) Ngµy nhËn bµi: 11-9-2006 81 ... này, đ tiến hành phân loại phân tử chủng vi khuẩn BNA5 dựa trình tự nucleotit gien m hóa 16S rRNA Phân loại dựa tr×nh tù nucleotit cđa gien m· hãa 16S rRNA HiƯn nay, nhà phân loại vi sinh vật học... định trình tự nucleotit gien m hóa 16S rRNA để phân loại vi khuẩn Kết nghiên cứu gien 16S rRNA đ phản ánh xác vị trí phân loại chủng vi khuẩn Ngoài ra, liệu gien Ngân hàng gien quốc tế giúp cho vi c... thái tế bào chủng vi khuẩn BNA5 Chủng BNA5 có khuẩn lạc hình tròn, bề mặt lồi, trơn, màu trắng đục; đờng kính khuẩn lạc khoảng từ 2-5 mm (hình 1A) Chủng vi khuẩn BNA5 thuộc nhóm vi khuẩn gram