Phân loại chủng vi khuẩn BNA5 được phân lập từ đất bị nhiễm DDT bằng phương pháp phân tích trình tự Nucleotit của gien 16S-rRNA

Results of the amplification of the nucleotide sequence with the primers 314F/907R indicated that the strain BNA5 had high homology with the species of the genus Bacillus a[r]

29(1): 76-81 T¹p chÝ Sinh häc 3-2007

Phân loại chủng vi khuẩn BNA5 đ−ợc phân lập từ đất bị nhiễm DDT ph−ơng pháp phân tích trình tự nucleotit

cđa gien 16s-rRNA

Nghiêm Ngọc Minh, Cung Thị Ngọc Mai, Đặng Thị Cẩm Hà

Viện Công nghệ sinh häc

Tr−ớc đây, giới nh− Việt Nam, việc phân loại vi sinh vật chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm ni cấy, sinh lý, sinh hóa Việc phân loại có nhiều −u điểm xong bộc lộ nh−ợc điểm định Chẳng hạn chủng vi sinh vật mặt hình thái gần với chi nh−ng phân tích mức độ phân tử lại thuộc chi khác Cùng với phát triển sinh học phân tử công nghệ gien, ph−ơng pháp phân loại học phân tử đM đời chủ yếu dựa kỹ thuật phân tích ADN Ph−ơng pháp th−ờng đ−ợc sử dụng nghiên cứu phân loại đa dạng vi sinh vật dùng kỹ thuật sinh học phân tử nh− phân tích trình tự gien 16S rRNA, kỹ thuật điện di gel biến tính nồng độ (DGGE), điện di gel biến tính nhiệt độ (TGGE) Những kỹ thuật đM đ−ợc sử dụng để phát định tên đến loài đại diện thuộc chi

Streptomyces từ môi tr−ờng nguyên thuỷ đM qua nuôi cấy cho hiệu cao nhiều so với ph−ơng pháp truyền thống [7, 2] Việc định tên loài vi sinh vật dựa cấu trúc gien 16S rRNA có nhiều thuận lợi, đặc biệt rút ngắn đ−ợc thời gian nghiên cứu Gần sử dụng kỹ thuật điện di gel biến tính nồng độ (DGGE) ng−ời ta đM có khả nghiên cứu tập đoàn xạ khuẩn mẫu tự nhiên cách dễ dàng Điều giúp hiểu sâu sắc tồn nhóm vi sinh vật chúng khơng có khả ni cấy [2, 5]

Tại phịng Cơng nghệ sinh học mơi tr−ờng thuộc Viện Cơng nghệ sinh học, ph−ơng pháp phân loại vi sinh vật dựa việc so sánh trình tự nucleotit gien mM hóa 16S rRNA đM đ−ợc áp dụng thu đ−ợc nhiều kết có giá trị [1, 4, 5] Để phục vụ cho việc giảm thiểu DDT gây ô nhiễm đất, tập đoàn vi sinh vật số chủng vi

sinh vật đM đ−ợc nghiên cứu Trong báo này, chúng tơi trình bày kết phân loại hình thái phân tử chủng vi khuẩn BNA5 đ−ợc phân lập từ vùng đất bị ô nhiễm 1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-chlrophenyl) ethane (DDT) khu vc Bc Trung B, Vit Nam

I phơng pháp nghiªn cøu

1. Nguyªn liƯu

Chủng vi khuẩn, có ký hiệu BNA5, đ−ợc phân lập từ đất bị nhiễm DDT khu vực huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An theo ph−ơng pháp làm giàu nhiều lần mơi tr−ờng khống dịch đ−ợc bảo quản glyxêrin 75% -80oC

Hãa chÊt tinh khiÕt cđa c¸c hMng Sigma, Invitrogien, Fermentas, Prolabo, Merk Sư dơng bé Kit TA cloning Kit cđa hMng InvitrogienTM

Các trang thiết bị đại, xác thuộc Phịng Cơng nghệ sinh học mơi tr−ờng Phịng thí nghiệm trọng điểm quốc gia Công nghệ gien thuộc Viện Công nghệ sinh học

Cặp mồi 341F (5’ - CCT ACG GGA GGC AGC AG - 3’) 907R (5’ - CCG TGA ATT CCT TTT AGT TT - 3’) đ−ợc thiết kế dựa trình tự nucleotit gien mM hóa 16S rRNA Esherichia coli để nhân đoạn gien có kích th−ớc khoảng 550 bp

2. Phơng pháp

a. Quan sát hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào

hiển vi điện tử quét JSML 5410, với hợp tác Viện 69

b. Phân loại vi khuẩn dựa vào gien m) hãa 16S rRNA

Tách chiết ADN tổng số chủng BDN5 theo ph−ơng pháp Sambrook Russell 2001 [8] ADN đ−ợc tinh tiến hành làm phản ứng PCR với cặp mồi 314F 907R Điều kiện phản ứng PCR đ−ợc tiến hành nh− sau: hỗn hợp PCR với tổng thể tích 25àl gồm: àl mồi loại (20 pmol); 0,5 àl hỗn hợp dNTPs (2,5 mM); 2,5 àl đệm PCR, àl MgCl2

(25mM); 0,2 µl Taq polymeraza (5 unit/µl), àl ADN tổng số vi khuẩn Phản ứng đợc thực máy PCR 9700 với bớc nh sau: b−íc 1: 95oC phót; b−íc 2: 95oC phót;

b−íc 3: 55oC phót; b−íc 4: 72oC

phút; b−ớc 5: lặp lại 30 chu kỳ từ b−ớc đến b−ớc 4; b−ớc 6: 72oC 10 phút; b−ớc 7: 4oC

trong nhiều (để giữ mẫu) Sản phẩm phản ứng PCR đ−ợc điện di kiểm tra gel agaroza nồng độ 0,8%, nhuộm gel êtium bromit quan sát d−ới ánh sáng đèn tử ngoại Sản phẩm PCR đ−ợc gắn trực tiếp vào vectơ

pCRR 2.1 nhê enzim T4-DNA ligaza; s¶n phÈm

lai đ−ợc biến nạp vào chủng E coli INV F' chọn lọc mơi tr−ờng LB đặc có chứa 50 mg/l ampixillin, 80 mg/l X-Gal, nuôi cấy 37oC

qua đêm Tách chiết làm ADN plasmit theo Sambrook Russell 2001 [8] Xác định trình tự nucleotit gien máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Gienetic Analyzer, sử dụng kít chuẩn BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing So sánh

trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA chủng vi khuẩn BNA5 với trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA t−ơng ứng ngân hàng gien quốc tế EMBL sử dụng phần mềm Clustal X để xây dựng phát sinh chủng loại

ii KÕt thảo luận

1. Phõn lp cỏc chủng vi sinh vật từ đất bị nhiễm DDT

Từ nguồn đất bị nhiễm DDT ban đầu, đM tiến hành phân lập thu nhận đ−ợc tập đoàn vi khuẩn phát triển mơi tr−ờng khống có chứa DDT Sau đó, loại khuẩn lạc đ−ợc làm giàu lần đồng thời mơi tr−ờng khống có bổ sung dịch chiết DDT glucoza 0,1%

Trong chủng có khả phát triển tốt mơi tr−ờng có DDT, chủng BNA5 có khả phát triển tốt cả, qua nhiều lần tuyển chọn Vì vậy, chúng tơi đM chọn chủng BNA5 để tiến hành nghiên cứu

2. Đặc điểm hình thái tế bào chủng vi

khuÈn BNA5

Chủng BNA5 có khuẩn lạc hình trịn, bề mặt lồi, trơn, màu trắng đục; đ−ờng kính khuẩn lạc khoảng từ 2-5 mm (hình 1A) Chủng vi khuẩn BNA5 thuộc nhóm vi khuẩn gram d−ơng Hình dạng tế bào chủng BNA5 đM đ−ợc quan sát kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 15000 lần Tế bào có dạng hình que ngắn, có kích th−ớc khoảng (1,80-1,87) ì (0,27- 0,53) àm (hình 1B)

A B

Việc quan sát hình dạng khuẩn lạc hình thái tế bào cho thấy, chủng vi khuẩn BNA5 có nhiều đặc điểm giống với lồi thuộc chi Bacillus Để làm rõ vị trí phân loại chủng này, đM tiến hành phân loại phân tử chủng vi khuẩn BNA5 dựa trình tự nucleotit gien mM hóa 16S rRNA

3. Ph©n loại dựa trình tự nucleotit

gien m· hãa 16S rRNA

Hiện nay, nhà phân loại vi sinh vật học đM sử dụng rộng rMi kỹ thuật xác định trình tự nucleotit gien mM hóa 16S rRNA để phân loại vi khuẩn Kết nghiên cứu gien 16S rRNA đM phản ánh xác vị trí phân loại chủng vi khuẩn Ngoài ra, liệu gien Ngân hàng gien quốc tế giúp cho việc nghiên cứu chủng loại phát sinh chúng cách dễ dàng thuận tiện Để tiến hành phân loại phân tử, chúng tơi đM tách dịng gien 16S rRNA, xác định so sánh trình tự nucleotit chủng vi khuẩn BNA5 với đại diện prokaryot khác Ngân hàng gien quốc tế

a. T¸ch chiÕt ADN tæng sè

Để tiến hành nghiên cứu phân loại phân tử, việc thu đ−ợc ADN tổng số không bị đứt gMy đạt độ tinh cao quan trọng Kết tách chiết ADN tổng số đ−ợc trình bày hình

Hình 2. Phổ điện di ADN tổng số chđng

BNA5

Ghi chó: giÕng chØ thÞ phân tử ADN cắt

HindIII E.coRI; giÕng s¶n phÈm ADN tỉng sè cđa BNA5

Kết hình cho thấy ADN tổng số chủng vi khuẩn BNA5 không bị đứt gMy, để thực nghiên cứu

b. Nhân đoạn gien 16S rRNA chủng vi khuÈn BNA5 b»ng kü thuËt PCR

Để nhân đoạn gien 16S rRNA, sử dụng ADN tổng số chủng BNA5 làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu (314F 907R) chu trình nhiệt nh− đM trình bày phần ph−ơng pháp Về mặt lý thuyết đoạn gien 16S rRNA (khoảng 550 bp) chủng đ−ợc nhân đoạn kỹ thuật PCR

Sau phản ứng, sản phẩm PCR đợc điện di kiểm tra gel agaroza 1%, kết đợc trình bày hình

Khoảng

550 bp 750 bp

500 bp

Hình Phổ điện di sản phẩm PCR

Ghi chú: giếng thị phân tư 1kb (Fermentas); giÕng s¶n phÈm PCR cđa chđng BNA5

Trên điện di đồ (hình 3), thấy sản phẩm PCR nhận đ−ợc băng ADN nhất, sắc nét có kích th−ớc khoảng 550 bp, với kích th−ớc theo nh− tính toán lý thuyết Điều chứng tỏ phản ứng PCR đM nhân đặc hiệu đoạn gien 16S rRNA có kớch thc mong mun

c. Tách dòng gien 16S rRNA vect¬ pCR 2.1

1 10 11 12

Hình 4. Điện di đồ sản phẩm DNA plasmit

Ghi chú: hai giếng 1, 12 đối chứng (vectơ pCR 2.1); giếng 2- 11: ADN plasmit dòng tế bào từ 1- 10

1

500 bp

Hình 5. Phổ điện di s¶n phÈm PCR

Ghi chó: giÕng chØ thị phân tử 100 bp (fermentas); hai giếng 2, sản phẩm PCR ADN plasmit chủng BNA5 dòng dòng

Sau thu c sn phm PCR, đM tiến hành gắn sản phẩm vào vectơ pCR 2.1 nhờ enzim T4 DNA ligaza biến nạp vào tế bào khả biến E coli (chủng INVαF') Sau nuôi tĩnh 18 37oC, đĩa biến nạp

xuất khuẩn lạc màu trắng xen kẽ với số khuẩn lạc màu xanh Một số khuẩn lạc màu trắng đM đ−ợc chọn lựa để tiến hành tách ADN plasmit Sản phẩm ADN plasmit thu đ−ợc dòng tế bào chọn lựa đ−ợc điện di kiểm tra gel agaroza 1% Kết đ−ợc trình bày hình Trên điện di đồ, nhận thấy số mẫu ADN plasmit giếng 2, 3, 5, 6, 7, 9, cao so với mẫu đối chứng vectơ pCR 2.1 (hai giếng 1, 12) Các ADN plasmit có kích th−ớc phân tử lớn nên có khả

năng mang sản phẩm mong muốn Để kiểm tra dịng plasmit đ−ợc lựa chọn có mang sản phẩm mong muốn hay không, đM tiến hành cắt dòng plasmit enzim EcoRI, sau điện di thấy băng đậm, dầy có kích th−ớc lớn 250 bp Theo chúng tơi trình tự có điểm cắt nằm gần vùng đoạn gien nên khó phân tách thành băng riêng biệt gel agaroza 1% Để kiểm tra lại t−ợng này, dòng ADN plasmit chọn lọc đ−ợc dùng làm khuôn tiến hành PCR lần hai với điều kiện phản ứng t−ơng tự nh− đM mô tả phần ph−ơng pháp Sản phẩm PCR đ−ợc kiểm tra gel agaroza 1% cho thấy xuất băng có kích th−ớc khoảng 550 bp nh− đoạn gien nghiên cứu (hình 5) Phổ điện di hình cho thấy sản phẩm PCR chủng BNA5 dòng thể băng sắc nét có kích th−ớc phân tử hợp lý dòng 2, chúng tơi định chọn dịng để tách với số l−ợng lớn để xác định trình tự chủng BNA5

d. Xác định trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA chủng BNA5

ADN plasmit mang đoạn gien có kích th−ớc phân tử mong muốn đM đ−ợc tách với số l−ợng lớn làm để xác định trình tự nucleotit Trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA chủng BNA5đ−ợc xác định ph−ơng pháp Sanger, sử dụng cặp mồi M13F M13R để PCR theo hai chiều Sau phân tích số liệu trình tự, kết đ−ợc hình

TAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTA AAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGAGTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCA CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGC GCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGA ACTTGAGTGCAGAAGAGAAAAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGGCTTTTTGGTCTGTAACTGACGCTGCGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCTAACG CATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTG

Hình Trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA chủng BNA5

Ghi chú: phần gạch dới, chữ đậm vị trí cắt enzim cắt hạn chế E coRI

Kết hình cho thấy trình tự nucleotit đoạn gien nhận đợc có kích thớc 550 bp (hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết)

So sánh trình tự đoạn gien 16S rRNA chủng BNA5với trình tự nucleotit vi sinh vật nhân sơ (prokaryote) đM đợc công bố Ngân hàng gien quốc tế EMBL phân tích

bằng phần mềm Clustal, đM xây dựng đợc phát sinh chủng loại nh h×nh

Trên phát sinh chủng loại, thấy chủng vi khuẩn BNA5 có quan hệ chặt chẽ với chủng thuộc chi Bacillus có độ t−ơng đồng cao (99,83%) với chủng Bacillus

vậy chủng BNA5 đ−ợc xếp vào chi Bacillus và tạm đ−ợc đặt tên chủng Bacillus sp BNA5 Trình tự nucleotit đoạn gien 16S rRNA chủng đM đ−ợc đăng ký Ngân hàng gien quốc tế EMBL với mM số AM398158

Hichs Corner (1972) đM chứng minh chủng Bacillus megaterium có khả phân hủy DDT [3], vËy suy chđng Bacillus sp

BNA5 có khả sử dụng DDT Điều hồn tồn xảy địa điểm phân lập đ−ợc chủng BNA5 nơi bị ô nhiễm nặng DDT Tuy nhiên, để khẳng định khả sử dụng DDT chủng Bacillus sp BNA5, cần có thêm nghiên cứu xác định mức độ chuyển hóa DDT gien chức tham gia vào trình khử độc

B a c illu s s p X L-2 0

(A Y 8 )

B a c illu s s p F a

(A Y 2 )

B a c illu s s p R-1

(A J )

B a c illu s s p B N A5

B a c illu s m e g a te riu m

s tra in (D Q )

L o w G + C g m (+ )

(A B 7 )

B a c illu s s p R S

(A Y )

B a c illu s m e g a te riu m

S tra in (A Y 5 1 )

B a c illu s s p L M G

(B S P )

B a cte riu m C W I0

(D Q 3 )

B a c illu s s p K R

(A Y 2 )

B a c illu s flex u s

(AB 1 )

H×nh Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn Bacillus sp BNA5

iii KÕt luËn

1 Chủng vi khuẩn BNA5 có khuẩn lạc hình trịn, bề mặt lồi, trơn, màu trắng đục; đ−ờng kính khuẩn lạc khoảng từ 2-5 mm Chủng BNA5 thuộc nhóm vi khuẩn gram d−ơng Quan sát d−ới kính hiển vi điện tử quét với độ phóng

đại 15.000 lần, tế bào chủng BNA5 có dạng hình que ngắn, có kích th−ớc khoảng (1,80-1,87) ì (0,27-0,53) àm

gần gũi với loài thuộc chi Bacillus. Đặc biệt, trình tự nucleotit đoạn gien mM hóa 16S rRNA chủng có độ t−ơng đồng cao với lồi Bacillus megaterium (DQ267829) với chủng Bacillus sp R-16769 (AJ748259), tới 99,83% Vì vậy, chủng BNA5 tạm đ−ợc đặt tên chủng Bacillus sp BNA5 Trình tự nucleotit đoạn gien mM hóa 16S rRNA chủng đM đ−ợc đăng ký Ngân hàng gien quốc tế EMBL vi mM s AM398158

Tài liệu tham khảo

1 Đặng Thị Cẩm Hà et al., 2003: Tạp chí

Công nghệ sinh học, 1(3): 377-386

2 Heuer H et al., 1997: Appl Environ

Microbiol., 63: 3233-3241

3 Hicks J R et al., 1972: Location and

Consequences of 1,1,1-Trichloro-2,2-bis (p Chlorophenyl) Ethane Uptake by Bacillus megaterium: 381-387

4 Hoàng Thị Mỹ Hạnh et al., 2004: Tạp chí

Công nghệ Sinh học, 1(2): 255-264

5 Nghiêm Ngọc Minh và Nguyễn Thành

Đức, 2004: Tạp chí Công nghệ sinh häc, 2(2): 245-252

6 Nghiªm Ngäc Minh, 2004: Tạp chí Công

nghệ sinh học, 2(4): 397-406

7 Rintala H et al., 2001: Molecular and

Cellular Probes, 15: 337–347

8 Sambrook J and Russell D W., 2001:

Molecular Cloning A Laboratory Manual

3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY

Taxonomy of the bacterial strain bna5 isolated from ddt contaminated soil by analysing the nucleotide sequence of

the 16s-rRNA gene

Nghiem Ngoc Minh, Cung Thi Ngoc Mai, Dang thi cam

Summary

The bacterial strain BNA5 was isolated from the DDT contaminated soil of heavy polluted sites Belonging to positive gram bacteria, this strain had round and smooth colony with 2-5 mm diameter The cell morphology of the strain BNA5 observed under the Scaning Electron Microscopy (SEM) showed that it was a short rod with 1.80-1.87 µm in length and 0.27-0.53 µm in wide

In this paper, the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene had been used for taxonomy of the strain BNA5 Results of the amplification of the nucleotide sequence with the primers 314F/907R indicated that the strain BNA5 had high homology with the species of the genus Bacillus and was close to the Bacillus megaterium strain (DQ267829) and the strain Bacillus sp R-16769 (AJ748259) at 99.83% Based on the morphology and the 16S rRNA gene nucleotide sequence this strain was classified in the genus Bacillus and named Bacillus sp BNA5 The nucleotide sequence of the 16S rRNA gene (550bp) was of the strain Bacillus

sp BNA5 deposited in the EMBL genbank database (with assession number AM398158)