Bài viết trình bày sử dụng phương pháp phân loại truyền thống, các nhà khoa học còn kết hợp với phương pháp sinh học phân tử, phân tích trình tự của gien 16S-ARN.
28(1): 63-67 3-2006 Tạp chí Sinh học phân loại chủng vi khuẩn Bacillus phơng pháp phân tích trình tự nucleotit gien 16s-ARN Tăng Thị Chính Viện Công nghệ môi trờng Trớc năm 90 kỷ XX, chủng vi khuẩn(VK) đợc phân loại chủ yếu khóa phân loại vi sinh vật truyền thống (khóa phân loại Bergeys manual); ngời ta dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào, đặc điểm sinh lý sinh hóa, khả sử dụng nguồn đờng chủng VK để phân loại Tuy nhiên, việc phân loại phơng pháp không xác, đặc biệt phân loại chủng VK đến loài Vì chủng vi sinh vật nhóm thờng có nhiều đặc điểm giống Vì vậy, ngày nay, việc sử dụng phơng pháp phân loại truyền thống, nhà khoa học kết hợp với phơng pháp sinh học phân tử, phân tích trình tự gien 16S-ARN để phân loại I phơnng pháp nghiên cứu Vi sinh vật Chđng E.coli XL1-Blue, plasmit PGEM-T* vect¬ mua cđa h ng Promega, Mü Hãa chÊt ProteinazaK, lysozym, clorophỗc, phªnol, isoamyl-alcohol, propyl-alcohol, (Sigma), plasmit extraction Kit vµ DNA extraction Kit (PREMATT II) h ng Bioneer-Mỹ Phơng pháp a T¸ch chiÕt ADN tỉng sè Hai chđng VK Bacillus subtilis HA401 IBT012 đợc nuôi lắc qua đêm môi trờng LB lỏng, sau ly tâm để thu sinh khối tách chiết ADN tổng số theo phơng pháp tách chiết ADN [6] b Nhân đoạn gien 16S-ARN kỹ thuật PCR Đoạn gien 16S-ARN chủng Bacillus đợc nhân kỹ thuật PCR nhờ sử dụng cặp mồi đặc hiệu có trình tự nh sau: Mồi xuôi GF1: 5-TAACACATGGAAGTCGAACG-3 Mồi ngợc GR1: 5-GGTGTGACGGGCGGTCTGTACAAG-3 PCR đợc thực víi chu tr×nh nhiƯt nh− sau: 94°C: 5’, (94°C: 1’, 55C: 45, 72C: 1) lặp lại 30 chu kỳ; 72C: Sản phẩm PCR đợc bảo quản 4C đợc kiểm tra điện di gel agaroza 1%, nhuộm gel với ethidium bromit xem điện di ®å d−íi ¸nh s¸ng cđa ®Ìn cùc tÝm Plasmit pGEM-T* đợc mở vòng enzym EcoRI, điểm cắt enzym EcoRI mở vòng plasmit để gắn ADN Các kỹ thuật tái tổ hợp tách chiết ADN plasmit đợc tiến hành theo Sambrook cs [6] Việc xác định trình tự gien đợc tiến hành theo phơng pháp chu kỳ nhiệt h ng Macrogen-Hàn Quốc Đọc kết trình tự gien máy xác định trình tự ADN tự động ABI377DNA Trình tự gien đợc so sánh ngân hàng liệu gien NCBI số liệu đợc xử lý phần mềm Blast NCBI Tinh sản phẩm PCR Kit DNA PREMATT II h ng Bioneer c Gắn đoạn gien 16S-ARN vào plasmit pGEM-T* Sản phẩm PCR gien 16S-ARN tinh sạch: X àl Công trình đợc hỗ trợ kinh phí Chơng trình Nghiên cứu 63 Véctơ: pGEM-T: àl; T4-ADN: àl; đệm gắn: àl; n−íc khư ion trïng: X µl Tỉng sè: 10 àl, giữ 14C 16 d Biến nạp plasmit vµo chđng E.coli XL1-Blue [5] LÊy 100 µl tÕ bào khả biến chủng E.coli XL1-Blue bổ sung vào plasmit đ gắn với sản phẩm 16S-ARN, ủ 30 ë 0°C Sèc nhiƯt ë 42°C Bỉ sung ml m«i tr−êng LB ampixilin đ 37C, sau ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút; loại bỏ dịch, nhỏ 50100 àl/pêtri môi trờng thạch LB-ampixilin-Xgal Nuôi qua đêm 37C Tách khuẩn lạc màu trắng để cấy vào môi trờng LB-ampixilin nuôi lắc qua đêm, ly tâm để thu sinh khối T¸ch plasmit b»ng Plasmid Extraction Kit cđa h ng Bioneer e Đọc trình tự nucleotit đoạn gien 16SARN (3) Plasmit có gắn đoạn gien 16S-ARN đợc gửi để đọc trình tự nucleotit h ng Macrogen, Hàn II Kết nghiên cứu Phân lập Bacillus a kiềm sinh tổng hợp -amylaza Các chủng Bacillus a kiềm sinh tổng hợp -amylaza đợc phân lập từ mẫu bùn ven biển Cát Bà Hải Phòng, môi trờng tinh bột có thành phần nh sau: tinh bột tan (Sigma): 0,2%, tripton (Difco): 0,1%, cao men (Difco): 0,2%, KH2PO4: 0,2%, MgSO4.7H2O: 0,1%, CaCl2.2H2O: 0,1%, NaCl: 0,5%, Na2CO3: 1,0% (thanh trùng riêng), thạch: 1,5%, pH = 10, nuôi tủ ấm 37oC, ngày Chúng đ tuyển chọn đợc số chủng Bacillus a kiềm sinh tổng hợp -amylaza mạnh; hai chủng HA401 IBT012 đợc chọn để nghiên cứu phân loại Phân loại hai chủng Bacillus tuyển chọn theo khóa phân loại Bergeys manual 1989 [1] Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, tính chất nuôi cấy chủng HA401 IBT012 đợc trình bày bảng bảng Bảng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào chủng HA401 IBT012 Chủng VK Màu sắc khuẩn lạc Bề mặt khuẩn lạc Kích thớc tế bào (à àm) Nhuộm gram Tạo bào tử HA401 IBT012 trắng trắng khô, nhăn khô, nhăn 3,0 ì 1,0 2,3 ì 1,7 gr+ gr+ + + pH ph¸t triĨn 5,7 6,8 + + Bảng Đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng HA401 IBT012 Chủng VK HA401 IBT012 Glucô + + Hình thành axit từ: Arabino Xylo Mannitol + + + + + + So sánh với đặc điểm phân loại chủng chuẩn nhóm VK gram+ khóa phân loại chi Bacillus Bergey cho thÊy chđng VK ® tun chän ®Ịu thc chi Bacillus 64 Tinh bét + + Thđy ph©n: Gelatin Cazein + + + + T¸ch chiÕt ADN tỉng số, khuếch đại đoạn gien 16S-ARN phản ứng PCR ADN tổng số chủng HA401 IBT012 đợc tách làm phơng pháp tách chiết ADN ribôxôm chủng Bacillus Sau đó, sử dụng cặp mồi GF1 GR1 đ thiết kế để khuếch đại đoạn gien 16S-ARN chủng Bacillus phản ứng PCR víi 50 ng ADN t¸ch tõ c¸c chđng Bacillus Trên điện di đồ, sản phẩm băng ADN có phân tử lợng khoảng 1300 bp nhìn thấy gel agaroza 1% (h×nh1) A B M 2961 bp 1000 bp 500 bp Hình1 Phổ điện di sản phẩm PCR 16SARN nạp, đợc cấy trải đĩa thạch chứa môi trờng LB có bổ sung ampixilin X-gal, nuôi qua đêm 37oC sau chọn khuẩn lạc có màu trắng để cấy vào môi trờng LB ampixilin lỏng, nuôi lắc 12 37oC Ly tâm để thu sinh khối, sau tách plasmit kit Plasmid Extraction Plasmit tinh đợc cắt enzym EcoRI để kiểm tra kết biến nạp Kết biến nạp khuẩn lạc sau tách plasmit cắt enzym EcoRI đợc kiểm tra điện di agaroza 1,0% (hình 2) Kết kiểm tra khả gắn đoạn gien 16S-ARN vào plasmit chủng HA401 IBT012 (1, hình 2) Các plasmit đ gắn đợc đoạn gien 16S-ARN, nên cắt enzym EcoRI cho đoạn: đoạn có kích thớc lớn 2961 bp ADN plasmit pGEM-T* đợc mở vòng EcoRI Còn đoạn ngắn hơn, tổng kích thớc chúng tơng đơng với sản phẩm PCR đoạn gien m hóa 16S-ARN khoảng 1,3 kb Các plasmit có gắn đoạn gien 16S-ARN đợc gửi để xác định trình tự nucleotit h ng Macrogen Hµn Quèc M M thang ADN chuÈn; A, B sản phẩm PCR chủng HA401 IBT012 Tách dòng biến nạp plasmit vào chủng E.coli XL1-Blue 2961 bp Sau khuếch đại đoạn gien 16S-ARN phản ứng PCR, sản phẩm PCR đợc tinh kit DNA PREMATT II Vectơ pGEM-T* h ng Promega loại vectơ plasmit tách dòng có kích thớc khoảng 2,961 kb, vectơ dễ gắn sản phẩm ADN lạ Phản ứng ghép nối sản phẩm PCR 16S-ARN với vetơ pGEM-T* diễn 14oC, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động enzym T4-DNA ligaza gắn điểm nối sợi ADN Các khả bắt cặp xảy trình ghép nối đoạn sản phẩm PCR nối với plasmit tạo sản phẩm lai nh mong muốn, sản phẩm ADN tự nối với nhau, plasmit tự nối với Sản phẩm lai đợc biến nạp vào chủng E.coli XL1-Blue [3, 4] Các tế bào sau biến 1000 bp 500 bp Hình Plasmit gắn đoạn gien 16S-ARN cắt EcoRI chủng HA401 IBT012 1, plasmit + gien 16S-ARN bị cắt hoàn toàn; plasmit không gắn đợc gien 16S-ARN Xác định trình tự nucleotit Kết đọc trình tự đoạn gien m hóa 16S-ARN chủng HA401 IBT012 đợc đọc máy ABI377DNA phân tích số liệu phần mềm BLAST NCBI, đợc trình bày hình hình 65 BASE COUNT 356 a 336 c ORIGIN cggccgcggg aattcgattt 61 tgatgttagc ggcggacggg 121 ctccgggaaa ccggggctaa 181 ggtggcttcg gctaccactt 241 cggctcacca aggcgacgat 301 gagacacggc ccagactcct 361 gtctgacgga gcaacgccgc 421 agggaagaac aagtaccgtt 481 acggctaact acgtgccagc 541 attgggcgta aagggctcgc 601 ccggggaggg tcattggaaa 661 gtgtagcggt gaaatgcgta 721 tctgtaactg acgcttagga 781 agtccacccc ggtaaacgat 841 agctaacgca ttaagcactc 901 ttgacggggg cccgcacaag 961 cttaccaggt cttgacatcc 1021 agtgacaggt ggtgcatggt 1081 caacgagcgc aacccttgat 1141 ccggtgacaa accggaggaa 1201 ggctacacac gtgctacaat 1261 tcccacaaat ctgttctcag 1321 tcgctagtaa tcgcggatca 1381 gcccgtcaca ccaaatcact 434 g 283 t aacacatgca tgagtaacac taccggatgg acagatggac gcgtagccga acgggaggca gtgagtgatg cgaatagggc agccgcggta aggcggtttc ctggggaact aagatgtgga accgaaagcg gagtgctaag cgcctgggga cggtggagca tctgacaatc tgtcgtcagc cttagttgcc ggtggggatg ggacagaaca ttcggatcgc gcatgccgcg agtgaattc agtcgaacgg gtgggtaacc ttgtttgaac ccgcggcgca cctgagaggg gcagtaggga aaggttttcg ggtaccttga atacgtaggt ttaagtctga tgagtgcaga ggaacaccag tggggagcga tgttaggggg gtacggtcgc tgtggtttaa ctagagatag tcgtgtcgtg agcattcagt acgtcaaatc aagggcagcg agtctgcaac gtgaatacgt acagatggga tgcctgtaag cgcatggttc ttagctagtt tgatcggcca atcttccgca gatcgtaaag cggtacctaa ggcaagcgtt tgtgaaagcc agaggagagt tggcgaaggc acaggattag tttccgcccc aagactgaaa ttcgaagcaa gacgtcccct agatgttggg tgggcactct atcatgcccc aaaccgcgag tcgactgcgt tcccgggcct gcttgctccc actgggataa aaacataaaa ggtgaggtaa cactgggact atggacgaaa ctctgttgtt ccagaaagcc gtccggaatt cccggctcaa ggaattccac gactctctgg ataccctggt ttagtgctgc ctcaaaggaa cgcgaagaac tcgggggcag ttaagtcccg aaggtgactg ttatgacctg gttaagccaa gaagctggaa tgtacacacc Hình Trình tự nucleotit đoạn gien 16S-ARN cña chñng Bacillus IBT012 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 tacaaggccc cttcacgcag taacctcgcg ataaggggca ccttagagtg ttaacccaac ccgaagggga cgcgttgctt tgagtttcag ctaaggggcg ggtatctaat gagtcgcctt attccactct ccgggggctt cggacaacgc tctggttagg cagagcttta tccattgcgg cagtgtggcc tcaccaacta tgtttgaacc ccagtcttac caagctccca gggaacgtat tcgagttgca gtttcgctgc tgatgatttg cccaactaaa atctcacgac cgtcctatct cgaattaaac tcttgcgacc gnaaaccccc cctgttcgct cgccactggt cctcttctgc tcacatcaga ttgccaccta taccgtcaag cgatccgaaa aagattccct gatcaccctc gctaatgcgc atgcggttca aggcaggcta tctgtccgtt tcaccgcggc gactgcgatc cctttgttct acgtcatccc tgctggcaac acgagctgac ctaggattgt cacatgctcc gtactcccca taacacttag ccccacgctt gttcctccac actcaagttc cttaagaaac cgtattaccg gtaccgccct accttcatca actgctgcct tcaggtcggc cgcgggtcca aacaaccatc cccacgtgtt cgacttgcat atgctgatcc cgaactgaga gtccattgta caccttcctc taagatcaag gacaaccatg cagaggatgt accgcttgtg ggcggagtgc cactcatcgt tcgcttctca atctttacgc cccagtttcc cgcctgcgag cggctgctgg attcgaacgg ctcacgcggc cccgtaggag tacgcatcgt tctgtaagtg cggtattagc actcacccgt gtgttaaatc gcgattacta acagatttgt gcacgtgtgt cggtttgtca ggttgcgctc caccacctgt caagacctgg cgggcccccg ttaatgcgtt ttacggcggg gcgtcagtta atttcaccgc aatgaccctc ccctttacgc cacgtagtta tacttgttct gttgctccgt tctgggccgt cgccttggtg gtagccgaag cccggtttcc ccgccgctaa gaattcccgc gcgattccag gggattggct agcccaggtc ccggcagtca gttgcgggac cactctgccc taaggttctt tcaattcctt agctgcagca ggactaccag cagaccaaaa tacacgtgga cccggttgag ccaataattc gccgtggctt tccctaacaa cagactttcg gtctcagtcc agccgttacc ccacctttta cggagttata catcagggag ggcc H×nh Tr×nh tù nucleotit đoạn gien 16S-ARN chủng Bacillus HA401 66 Từ kết đọc trình tự gien 16S-ARN chủng Bacillus đ tuyển chọn so sánh với liệu ngân hàng gien NCBIMỹ cho thấy tr×nh tù nucleotit cđa gien 16SARN cđa chđng IBT012 cã 98% tơng đồng với trình tự nucleotit gien 16S-ARN chủng Bacillus subtilis 2633 trình tự nucleotit gien 16S-ARN chủng HA401 có 97% tơng đồng với tr×nh tù nucleotit cđa gien 16S-ARN cđa chđng Bacillus subtilis 2633 Từ kết trên, khẳng định chủng Bacillus a kiềm HA401 IBT012 phân lập đợc thuộc loài Bacillus subtilis Trình tự nucleotit gien 16S-ARN chủng Bacillus subtilis HA401 đợc công bố ngân hàng gien NCBI có m số AY279207 III KÕt ln Hai chđng VK −a kiỊm HA401 vµ IBT012 đợc phân lập từ mẫu bùn ven biển Cát Bà Hải Phòng, có khả sinh tổng hợp -amylaza kiềm Kết phân loại việc nghiên cứu đặc điểm sinh học cho thấy chúng thuộc chi VK Bacillus Kết phân tích trình tự gien 16SARN chủng đợc xử lý phần mềm Blast NCBI cho thấy trình tự nucleotit cđa gien 16S-ARN cđa chđng IBT012 cã 98% t−¬ng ®ång víi tr×nh tù nucleotit cđa gien 16S-ARN cđa chđng Bacillus subtilis 2633 trình tự nucleotit gien 16S-ARN chủng HA401 có 97% tơng đồng với trình tự nucleotit cña gien 16S-ARN cña chñng Bacillus subtilis 2633 Nh− hai chủng VK a kiềm HA401 IBT012 thuộc loài Bacillus subtilis Trình tự nucleotit gien 16S-ARN chủng Bacillus HA401 đợc công bố ngân hµng gien NCBI, cã m sè: AY279207 Tµi liƯu tham kh¶o Ara K et al., 1992: Bisci Biotechnol Biochem 56: 62-65 Horikoshi K., 1971: Agric Biol Chem., 35: 1783-1791 Igarashi K et al., 1998: J Appl and Envir Microb., 64(9): 3282-3289 Phillip Gerhardt et al., 1994: Method for genaral and molecular bacteriology American Society for Microbiology, Washington, D C USA Jeffrey H Miller, 1992: A short course in bacteriol genetics A Laboraory Manual and Handbook for E Coli and related, Cold Spring harbor laboratory press, USA Sambrook J., Fritsch E F., T Maniatis J., 1989: Molecular cloning, a laboratory manual Cold Spring Harbor Laboraory Taxonomy of alkalophilic bacillus strains by analysing the nucleotide sequence of the 16S-rNA gene Tang Thi Chinh Summary Two alkalophilic Bacillus strains HA401 and IBT012, which produced alkaline α-amylase, were isolated from the Catba and Haiphong sea sides The identification by classical method showed that they belonged to the genus Bacillus The nucleotide sequence of the 16S-RNA gene of these two strains showed that the one of the strain Bacillus IBT012 had 98% homology with the one of the strain Bacillus subtilis 2633 and the one of the strain Bacillus HA401 had 97% homology with the one of the strain Bacillus subtilis 2633 Therefore, these two isolated strains belonged to the species Bacillus subtilis The nucleotide sequence of the16S-RNA gene of the strain Bacillus HA401 was submited to the NCBI genbank database with the genbank accession number: AY279207 Ngµy nhËn bµi: 13-05-2005 67 ... đồng với trình tự nucleotit gien 16S-ARN chủng Bacillus subtilis 2633 trình tự nucleotit gien 16S-ARN chủng HA401 có 97% tơng đồng víi tr×nh tù nucleotit cđa gien 16S-ARN cđa chđng Bacillus subtilis... 16SARN chủng đợc xử lý phần mềm Blast NCBI cho thấy trình tù nucleotit cña gien 16S-ARN cña chñng IBT012 cã 98% tơng đồng với trình tự nucleotit gien 16S-ARN chủng Bacillus subtilis 2633 trình tự nucleotit. .. tù nucleotit đoạn gien 16S-ARN chủng Bacillus HA401 66 Từ kết đọc trình tự gien 16S-ARN chủng Bacillus đ tuyển chọn so sánh với liệu ngân hàng gien NCBIMỹ cho thÊy tr×nh tù nucleotit cđa gien