Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn bacillus spp và lactobacillus spp đối với một số nấm mốc sinh độc tố aflatoxin​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP VÀ LACTOBACILLUS SPP ĐỐI VỚI MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1515100007 : LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG Lớp: 15HSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân tơi hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm-Môi Trường trường Đại Học Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh Những kết đồ án hồn tồn khơng chép từ đồ án tốt nghiệp người khác với hình thức Các số liệu trích dẫn đồ án tốt nghiệp hồn tồn trung thực Tơi xin chịu tồn trách nhiệm đồ án TP.HCM, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên thực Lê Ngô Vũ Phượng i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người ni nấng dạy dỗ khuyến khích tạo điều kiện cho học tập để có thành ngày hơm Trong suốt khoảng thời gian học trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em thây, cô khoa Cơng Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Mơi Trường hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ em trình học tập trường trình thực đồ án tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn đến q Thầy, Cơ nhờ có thầy, trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Hương, tận tình hướng dẫn, bảo em suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương thực hiện, hoàn thành đồ án Em xin cám ơn Thầy, Cơ phịng thí nghiệm bạn bè quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, em xin cảm ơn Thầy, Cô Hội Đồng Phản Biện dành thời gian đọc nhận xét đồ án Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe TP HCM, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên thực Lê Ngô Vũ Phượng ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TÔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm: 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Độc tố nấm tiết 1.1.3 Tác hại nấm 1.1.3.1 Tác hại nấm gây cho người động vật 1.1.3.2 Tác hại nấm gây cho thực vật 1.1.4 Một số chủng nấm gây hại thực phẩm 1.2 Tổng quan hợp chất kháng nấm: 1.2.1 Hợp chất kháng nấm hóa học 10 1.2.2 Tác hại hợp chất kháng nấm hóa học 10 1.2.3 Hợp chất kháng nấm sinh học 13 1.2.3.1 Hợp chất kháng nấm từ thực vật: 13 1.2.3.2 Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: 17 a Khả kháng nấm mốc Bacillus spp 17 b Khả kháng nấm mốc Lactobacillus spp 19 1.3 Các phương pháp sàng lọc chủngVSV kháng nấm mốc: 21 1.3.1 Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy đường vi khuẩn) 21 1.3.2 Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) 23 1.3.3 Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa lớp): 25 iii Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 Địa điểm nghiên cứu: 26 2.2 Thời gian nghiên cứu: 26 2.3 Vật liệu nghiên cứu: 26 2.3.1 Giống vi sinh vật: 26 2.3.1 Hóa chất mơi trường sử dụng 26 2.3.1.1 Hóa chất: 26 2.3.1.2 Môi trường nuôi cấy: 26 2.4 Thiết bị dụng cụ: 27 2.4.1 Thiết bị: 27 2.4.2 Dụng cụ: 28 2.5 Phương pháp luận: 28 2.6 Phương pháp nghiên cứu: 29 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.6.2 Khảo sát tăng trường nấm mốc: 30 2.6.3 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp ria đường vi khuẩn chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: 30 2.6.4 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp đặt thạch khuếch tán chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc: 35 2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa lớp chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: 39 2.6.6 Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa số chủng vi khuẩn 43 2.6.6.1 Nhuộm gram 43 2.6.6.2 Nhuộm bào tử 44 2.6.6.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 44 iv Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 3.1 Định danh sơ khảo sát sinh lý - sinh hóa số chủng vi khuẩn 45 3.1.1 Nhuộm Gram: 45 3.1.2 Nhuộm bào tử: 46 3.1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa: 47 3.2 Khảo sát tăng trưởng nấm mốc: 48 3.3 Khảo sát khả đối kháng trực phương pháp ria đường vi khuẩn chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc: 50 3.4 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng trực phương pháp đặt thạch khuếch tán chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc: 66 3.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa lớp chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc 81 3.6 So sánh khả đối kháng nấm mốc 20 chủng vi khuẩn thông qua cách chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) 90 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 PHỤ LỤC v LAB L NA N NB N MT M PDA P VK V VSV V vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học sử dụng để bảo quản hạt giống Bảng 1.2.Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men (Corsetti cộng sự, 1998) 18 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái chủng Bacillus spp 45 Bảng 3.2 Một số phản ứng sinh hóa chủng Bacillus spp 47 Bảng 3.3 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp cấy đường vi khuẩn 53 Bảng 3.4 So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 54 Bảng 3.5 Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp cấy đường vi khuẩn 62 Bảng 3.6 So sánh số liệu tỉ lệ ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp cấy đường vi khuẩn 63 Bảng 3.7 Thống kê số liệu vòng ức chế chủng nấm mốccủa chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 68 Bảng 3.8 So sánh sơ liệu vịng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 69 Bảng 3.9 Thống kê số liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 76 vii Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp mạnh nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 77 Bảng 3.11 Thống kê số liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc chủng vi khuẩn Bacillus spp theo nhóm với phương pháp đỗ dĩa lớp 84 Bảng 3.12 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Bacillus spp nhóm theo phương pháp đõ dĩa lớp 85 Bảng 3.13 Sắp xếp số liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp theo nhóm với phương pháp đỗ dĩa lớp 89 Bảng 3.14 Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế chủng nấm mốc vi khuẩn Lactobacillus spp nhóm theo phương pháp đỗ dĩa lớp 90 Bảng 3.15 Thống kê điểm chủng vi khuẩn Bacillus spp theo phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 91 Bảng 3.16 Thống kê điểm chủng vi khuẩn Lactobacillus spp theo phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 92 viii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học Metalaxyl 10 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Manocozeb 11 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học Hexacoconazole 11 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học Pyrones 14 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học Viridines 15 Hình 1.6 Phương pháp cấy ria đường thể đối kháng vi khuẩn LAB nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013) 20 Hình 1.7 Sơ đồ nghiên cứu khả đối kháng vi khuẩn có lợi theo phương pháp ria đường vi khuẩn 21 Hình 1.8 Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể đối kháng vi khuẩn Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015) 22 Hình 1.9 Sơ đồ nghiên cứu khả đối kháng vi khuẩn có lợi theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 23 Hình 1.10 Phương pháp đối kháng che phủ Bacillus spp với loại nấm (trích từ Kumar cộng sự,2009) 24 Hình 1.11 Sơ đồ nghiên cứu khả đối kháng vi khuẩn có lợi theo phương pháp đỗ dĩa 25 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả dối kháng chủng vi khuẩn có lợi nấm mốc 29 Hình 2.2 Sơ đồ chi tiết khảo sát khả đối kháng chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria đường 31 ix Means with the same letter are not significantly different C C C E E E E E E E 17 HCP2: Dependent Variable: TILEKHANG Source Model Error Corrected Total 32 Source HCP2 TI LE UC CHE NAM HCP2 NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 18 Error Least Means with the same letter are not significantly different C C C C C C C C C E E E 19 CDP1: TI LE UC CHE NAM CDP1 TI LE UC CHE NAM CDP1 Dependent Variable: TILEKHANG Source Model Error Corrected Total Source CDP1 TI LE UC CHE NAM CDP1 NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 20 Means with the same letter are not significantly different B B B B B (Paenibacillus) B B F F F F F F F 21 - Chạy tương tự với Lactobacillus sp.và chủng nấm khác - Chạy tương tự chỉa theo tửng nhóm phân lập chủng PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP (ĐẶT THẠCH KHUẾCH TÁN):  Phương pháp chạy tương tự phương pháp cấy đường vi khuẩn  Chạy chia theo nhóm phân lập sau: Tỉ lệ kháng nhóm VK Lactic phân lập từ nem: DN3: Source Model Error Corrected Total Source 22 DN3 NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the 23 DN2: VONG UC CHE NAM DN2 Class Levels ONG UC CHE NAM DN2 Source Model Error Corrected Total Source DN2 27 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for VONGUCCHE 24 Means with the same letter are not significantly different t Grouping 25 CDP1: VONG UC CHE NAM CDP1 VONG UC CHE NAM CDP1 Dependent Variable: VONGUCCHE Source Model Error Corrected Total Source CDP1 36 NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 26 Means with the same letter are not significantly different 27 CDP2: VONG UC CHE NAM CDP2 VONG UC CHE NAM CDP2 Dependent Variable: VONGUCCHE Source Model Error Corrected Total Source CDP2 VONG UC CHE NAM CDP2 NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 28 Means with the same letter are not significantly different 29 HCP2: VONG UC CHE NAM HCP2 NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the 30 Means with the same letter are not significantly different B B B B B B B B B  Chạy tương tự với nhóm cơm mẻ cảu chủng Lactobacillus spp nhóm Bacillus spp với nấm khác 31 ... spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: 35 2.6.5 Thí nghiệm khảo sát khả đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa lớp chủng vi khuẩn Bacillus spp Lactobacillus spp với nấm mốc: 39 2.6.6 Một số. .. chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp với nấm mốc Aspergillus spp  Xác định khả đối kháng trực tiếp thông qua phương pháp khuếch tán chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp với. .. khảo sát khả đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa lớp chủng VK Bacillus spp Lactobacillus spp với chủng nấm mốc 81 3.6 So sánh khả đối kháng nấm mốc 20 chủng vi khuẩn thông qua cách chấm