Thử nghiệm cố định saccharomyces cerevisiae và pichia anomala trên chất mang pva alginate và ứng dụng trong lên men thu nhận ethanol từ vỏ cacao​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CỐ ĐỊNH SACCHAROMYCES CEREVISIAE VÀ PICHIA ANOMALA TRÊN CHẤT MANG PVA – ALGINATE VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN THU NHẬN ETHANOL TỪ VỎ CACAO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS Trần Thị Tưởng An Sinh viên thực : Ngô Lê Hồng Duyên MSSV: 1211100062 Lớp: 12DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2016 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp “Thử nghiệm cố định Saccharomyces cerevisiae Pichia anomala chất mang PVA-alginate ứng dụng lên men thu nhận ethanol từ vỏ cacao” cơng trình nghiên cứu thực cá nhân tôi, thực sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức dựa sở nghiên cứu lý thuyết dựa hướng dẫn khoa học Th.S Trần Thị Tưởng An Các số liệu sử dụng đồ án trung thực có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng Nội dung đồ án có tham khảo sử dụng tài liệu thông tin đăng tải sách, tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu khóa luận Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực Ngô Lê Hồng Duyên i Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm tạo điều kiện cho em thực đồ án Em xin cảm ơn tồn thể thầy khoa Cơng nghệ sinh học – Môi trường – Thực phẩm tận tình truyền đat kiến thức kỹ để em hồn thành khóa luận Trong suốt khoảng thời gian làm khóa luận tốt nghiệp phịng thí nghiệm Năng Lượng Sinh Học Biomass – Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Cô Trần Thị Tưởng An, trường Đại học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh Cảm ơn cô gợi ý đề tài, tạo điều kiện cho em làm khóa luận đại học Bách Khoa, tận tình hướng dẫn chi tiết cơng việc, ln theo sát dẫn, động viên em, hỗ trợ kinh phí suốt q trình làm khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị làm việc phịng thí nghiệm nhiệt tình hỗ trợ em suốt thời gian làm việc Cảm ơn ba mẹ người luôn bên cạnh động viên tinh thần em lúc em cảm thấy khó khăn Cuối cùng, cảm ơn tất bạn phịng thí nghiệm người bạn ln bên cạnh giúp đỡ em việc Mặc dù cố gắng để thực đề tài cách hoàn chỉnh Song buổi đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực nghiệm máy móc đại hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên không tránh khỏi thiếu sót Em mong góp quý thầy cô bạn để kiến thức em lĩnh vực hoàn thiện Một lần em xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày 19 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực Ngô Lê Hồng Duyên ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẲT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii LỜI MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Giới thiệu bioethanol 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Các hệ bioethanol ❖ ❖ Bioethanol hệ thứ Bioethanol hệ thứ hai ❖ 1.2 Bioethanol hệ thứ ba .6 Quy trình sản xuất ethanol 1.2.1 Tiền xử lý 1.2.2 Thủy phân 10 1.2.3 Lên men .11 1.2.4 Chưng cất, thu hồi bioethanol 11 1.3 Nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol 13 1.3.1 Một số nguồn nguyên liệu sản xuất bioethanol 13 1.3.2 Sản xuất bioethanol sử dụng nguồn nguyên liệu vỏ cacao 15 1.3.2.1 Giới thiêu vỏ cacao 15 1.3.2.2 Tình hình sản xuất cacao Việt Nam 15 1.4 Cố định tế bào .17 1.4.1 Định nghĩa phương pháp cố định .17 1.4.2 Ưu điểm & nhược điểm .20 1.4.3 Chất mang 22 1.4.4 Saccharomyces & Pichia .26 1.4.5 Một số nghiên cứu cố định tế bào 28 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 32 2.1.1 Thời gian nghiên cứu 32 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 32 iii Đồ án tốt nghiệp 2.1.3 Đối tượng ngh 2.1.4 Nội dung ngh 2.2 Vật liệu thiết bị 2.2.1 Nguyên vật li 2.2.2 Hóa chất sử d 2.2.3 Thiết bị dụ 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Sơ đồ bố trí th 2.3.2 Phương pháp 2.4 Phương pháp phân tích 2.4.1 Phương pháp 2.4.2 Phương pháp 2.4.3 Xử lý số liệu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Quá trình cố định tế bào 3.1.1 Cảm quan nồn 3.1.2 Ảnh hưởng củ 3.2 Kết sử dụng chế phẩm S.cerevisia P.a men thu bioethanol từ vỏ cacao 3.2.1 Ảnh hưởng củ 3.2.2 Ảnh hưởng củ 3.2.3 Ảnh hưởng củ 3.3 Khả tái sử dụng chế phẩm lên men S.ce gel PVA để lên men CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI TÀI LIỆU TỪ INTERNET iv DNS P.anom PL PVA S cerevi SDA SDB SHF SSCF SSF TSD Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đặc tính hóa lý ethanol Bảng 1.2 Thơng số bioethanol so với xăng Bảng 1.3 Các phương pháp tiền xử lý Bảng 1.4 Các kỹ thuật lên men thu nhận bioethanol Bảng 2.1 Thông tin thiết bị sử dụng trình nguyên cứu Bảng 2.2 Các nghiệm thức khảo sát khả cố định tế bào Saccharomyces cerevisiae Bảng 2.3 Các nghiệm thức khảo sát khả cố định tế bào Pichia anomala Bảng 2.4 Bố trí nghiệm thức thí nghiệm vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo ethanol Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành bioethanol Hình 1.3 Trái cacao Hinh 1.4 Cơng thức cấu tạo phân tử polyvinyl alcohol Hinh 1.5 Công thức cấu tạo phân tử polyvinyl acetate Hình 1.6 Saccharomyces cereviciae Hình 1.7 Pichia anomala Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 3.1 Mật độ tế bào cố định PVA Hình 3.2 Hiệu suất cố định tế bào Hình 3.3 Mật độ tế bào cố định PVA Hình 3.4 Hiệu suất cố định tế bào Hình 3.5 Sự thay đổi thành phần theo thời gian lên men Hình 3.6 Sự thay đổi thành phần theo pH mơi trường lên men Hình 3.7 Sự thay đổi thành phần theo tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men Hình 3.8 Sự thay đổi thành phần qua số lần tái sử dụng vii Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Như biết, kinh tế giới tương lai phụ thuộc nhiều vào nhiên liệu hóa thạch, nguồn tài nguyên có dầu thô tác nhân gây ô nhiễm môi trường lớn báo động vào giai đoạn cạn kiệt tất yếu tài nguyên tự nhiên hữu hạn bị khai thác tối đa Bên cạnh đó, nhu cầu bảo vệ mơi trường sống trái đất dài lâu cần phát triển kinh tế với tốc độ cao quy mô rộng làm cho an ninh lượng toàn cầu ngày bị đe dọa nghiêm trọng Do đó, nhiệm vụ tìm kiếm nguồn thay cho nhiên liệu hóa thạch đặt gần nửa kỷ qua ngày trở nên cấp thiết Bioethanol nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn tương lai thay cho nguồn nhiên liệu hóa thạch, nguồn nhiên liệu tái tạo Bioethanol tồn dạng lỏng sử dụng làm nguồn nhiên liệu cho tương lai Tuy nhiên, sản phẩm bioethanol có nguồn gốc từ tinh bột dễ bị biến động tinh bột nguồn lương thực người Việc sử dụng tinh bột nguyên liệu giàu đường đẩy giá lương thực bioethanol tăng cao so với sản xuất đường hóa học Trong đó, giá vật liệu trả 40– 75% tổng chi phí sản xuất ethanol Vì vậy, việc thay nguồn nguyên liệu để sản xuất bioethanol vô cần thiết Các nguồn nguyên liệu phụ phẩm ngành nông nghiệp rơm rạ, bã mía, vỏ cacao…đang lựa chọn hàng đầu nay, việc sản xuất bioethanol từ phụ phẩm nông nghiệp giúp giảm giá thành bioethanol, hạn chế rác thải nông nghiệp, tăng suất lao động người nông dân, … Bioethanol thường sản xuất nấm men tự do, nhiên lên men nấm men tự gặp số vấn đề thời gian lên men dài, suất lên men thấp, tiêu tốn nhiều lượng để tách nấm men sau trình lên men Để khắc phục, ta dùng phương pháp cố định nấm men với nhiều ưu điểm như: tốc Đồ án tốt nghiệp độ sử dụng glucose, tốc độ sinh tổng hợp ethanol cao dù diện tích bề mặt dùng để vận chuyển chất dinh dưỡng nhỏ hơn, khả tái sử dụng nấm men cố định giúp giảm thời gian nuôi cấy thời gian lên men, ổn định hoạt tính nấm men Bên cạnh đó, vỏ cacao nguồn phế phẩm nơng nghiệp giàu lignocellulose nên sử dụng để lên men tạo bioethanol hiệu quả, tận dụng nguồn vỏ phế phẩm Với sản lượng năm khoảng 1-2 tấn/ha, lượng vỏ thải gánh nặng lớn mơi trường Bên cạnh đó, cacao cho thu hoạch gần quanh năm nên nguồn cung nguyên liệu thuận lợi Nguồn vỏ ca cao khổng lồ bị bỏ phí lâu tận dụng hiệu để thử nghiệm lên men ethanol sinh học Do vậy, đề tài “Thử nghiệm cố định Saccharomyces cerevisiae & Pichia anomala chất mang PVA-alginate ứng dụng lên men thu nhận ethanol từ vỏ ca cao” thực để khảo sát lên men ethanol phương pháp cố định tế bào ứng dụng nguồn nguyên liệu phế phẩm nông nghiệp vỏ trái cacao Mục tiêu đề tài Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae Pichia anomala sử dụng chất mang PVA-alginate, ứng dụng lên men ethanol từ vỏ cacao Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu đề tài, tiến hành nghiên cứu nội dung sau: - Khảo sát chất mang PVA-alginate để cố định S cerevisiae P.anomala - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men sử dụng chế phẩm lên men S.cerevisiae P.anomala cố định chất mang PVA-alginate - Thử nghiệm khả sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P.anomala cố định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao Phụ lục A2: Cách dựng đường chuẩn cellulose - Dung dịch cellulose chuẩn (20 m tan 50 mL nước cất - Hút 1, 2, 3, 4, 5, 6, m mức 100 mL,thêm nước cất đến vạch mức.Các dung dịch pha có nồng độ cellulose 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 mg/mL - Cho 5mL thuốc thử anthrone vào ống nghiệm chứa 0,5mL dung dịch - Mẫu trắng: Hút 0,5 mL nước cấ thử anthrone - Nung cách thủy phút Làm lạnh nhanh đo OD bước sóng 630nm Mật độ quang OD - Từ giá trị OD, vẽ đồ thị đường chuẩn cellulose Đồ án tốt nghiệp Phụ lục A3: Xây dựng đường cong sinh trưởng Saccharomyces ceresiviae Điều kiện nuôi cấy: - Môi trường Sabouraud Dextrose Broth - 30 C Nuôi cấy tĩnh - Tỷ lệ giống bổ sung ban đầu 1%, mật độ 95,78 x 10 cfu/mL o log( cfu/mL) Đường cong sinh trưởng Phụ lục A4: Đường tương quan OD- mật độ tế bào Saccharomyces ceresiviae Đường tương quan mật độ quang OD-mật độ tế bào nấm men S.cerevisiae cung cấp Phịng thí nghiệm Nhiên liệusinh học Biomass, Trường đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh log( số tế bào x10 -6 / ml) Đường Đồ án tốt nghiệp Phụ lục A3: Xây dựng đường cong sinh trưởng Pichia anomala Điều kiện nuôi cấy: - Môi trường Sabouraud Dextrose Broth P.anomala hoạt hóa trước 24 môi trường SDB để nấm men phát triển sinh khối, tiếp sau sử dụng để xây dựng đường tương quan mật log(cfu/mL) độ quang OD-mật độ tế bào nấm men Tương quan mật đọ quang OD-mật độ tế bào P.anomala Khảo sát đường cong sinh trưởng P.anomala dựa vào phương pháp xác định mậtđộ log (cfu/mL) tế bào gián tiếp đường tương quan OD- mật độ tế bào P.anomala Đường cong sinh trưởng P.anomala Đường tương quan mật độ quang OD-mật độ tế bào nấm men S.cerevisiae cung cấp Phịng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học Biomass, Trường đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng Kết khảo sát thời gian sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P anomala cố định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao Thời gian (giờ) 42 45 48 51 54 56 Bảng Kết khảo sát pH môi trường lên men sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P anomala cố định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao pH 4,5 5,5 Đồ án tốt nghiệp Bảng Kết khảo sát tỷ lệ nấm men cố định bổ sung vào môi trường lên men sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P anomala cố định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao Tỷ lệ nấm men (%) Bảng Kết khảo sát khả tái sử dụng chế phẩm S.cerevisiae P anomala cố định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao TSD (lần) Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C HÌNH ẢNH Saccharomyces cerevisiae a) Khuẩn lạc S.cerevisiae c) Cấy ria giữ giống S.cerevisiae b) Tăng sinh S.cerevisiae Đồ án tốt nghiệp Pichia anomala a) Khuẩn lạc P.anomala c) Cấy ria giữ giống P.anomala b) Tăng sinh P.anomala Đồ án tốt nghiệp Chế phẩm S.cerevisiae P anomala cố định chất mang PVA để lên men thu bioethanol từ vỏ cacao a) Nồng độ PVA 10%, alginate c) nồng độ PVA 12%, alginate 1%, 1%, dung dịch acid boric (H3BO3) dung dịch acid boric (H3BO3) 7% 7% CaCl2 2% CaCl2 2% b) nồng độ PVA 11%, alginate 1%, d) nồng độ PVA 13%, alginate 1%, dung dịch acid boric (H3BO3) 7% dung dịch acid boric (H3BO3) 7% CaCl2 2% CaCl2 2% Đồ án tốt nghiệp e) Nồng độ chất mang PVA 14%, alginate 1% dung dịch acid boric (H3BO3) 7% CaCl2 2% a) Hạt gel PVA-alginate trước cho vào môi trường lên men 10 Đồ án tốt nghiệp 11 ... tận dụng hiệu để thử nghiệm lên men ethanol sinh học Do vậy, đề tài ? ?Thử nghiệm cố định Saccharomyces cerevisiae & Pichia anomala chất mang PVA- alginate ứng dụng lên men thu nhận ethanol từ vỏ. .. xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp ? ?Thử nghiệm cố định Saccharomyces cerevisiae Pichia anomala chất mang PVA- alginate ứng dụng lên men thu nhận ethanol từ vỏ cacao” cơng trình nghiên cứu thực... mang PVA- alginate để cố định S cerevisiae P .anomala - Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình lên men sử dụng chế phẩm lên men S .cerevisiae P .anomala cố định chất mang PVA- alginate - Thử nghiệm