Bài viết nghiên cứu về tách dòng và đọc trình tự của Nucleotit đoạn ITS-1 Ribosom của 6 chủng tảo Scenedesmus được phân lập từ hồ Hoàn Kiếm, trên cơ sở đó xác định mối quan hệ về chủng loại của 6 chủng tảo này.
25(3): 105-109 9-2003 T¹p chÝ Sinh häc Mèi quan hƯ di trun cđa MéT Sè chđng Senedesmus ph©n lËp tõ Hồ Hoàn kiếm dựa trình tự nucleotit đoạn ITS-1 ribosom nguyễn đức bách, đặng diễm hồng Viện Công nghệ sinh học dơng đức tiến Trung tâm Công nghệ sinh học, ĐHQG Hà Nội Nguyễn Văn Đồng Viện Di truyền nông nghiệp Scenedesmus chi thuộc ngành tảo lục (Chlorophyta) có số lợng loài dới loài lớn (trên 200 taxon) [1] Nhiều chủng Scenedesmus có giá trị tích cực việc giảm thiểu ô nhiễm môi trờng nớc Ngoài ra, chúng có hàm lợng protein cao (khoảng 5060% trọng lợng khô) giàu chất dinh d−ìng ë ViƯt Nam, Scenedesmus rÊt phong phó loại hình thủy vực, hồ Hoàn Kiếm (Hà Nội) nơi tập trung nhiều loại vi tảo Do đa dạng phong phú chủng loại với khả biến đổi hình thái để thích ứng với điều kiện sống khác nên việc phân loại định tên xác loài tảo nói chung gặp nhiều khó khăn, có Scenedesmus Hiện nay, với phơng pháp phân loại kinh điển kỹ thuật sinh học phân tử đại đợc sử dụng rộng r i để phân loại Một sở việc phân loại dựa vào sai khác vỊ tr×nh tù nucleotit ë mét sè gien cã tÝnh bảo thủ cao trình tiến hóa Hệ gien đợc sử dụng phổ biến nhật gien m hãa cho tiÓu phÈn ribosom: 5,8S, 16S, 18S, 25S [5, 7, 8, 9, 10] vµ gien rubisco [6] vv Trong hệ gien này, thờng có số đoạn ADN ngắn không m hóa đóng vai trò nh vùng đệm Những biến đổi di truyền ngẫu nhiên (ở mức độ nucleotit) thờng xảy vùng này, kết đ tạo đa dạng lớn loài nh dới loài [6] Chính vậy, ngời ta hay sử dụng đoạn ITS (nuclear ribosome internal transcribed spacer) hc Rubisco spacer để kiểm tra xác định mối quan hệ gần gũi loài mối quan hệ di truyền quần thể loài điều kiện địa lý, sinh thái khác [6, 11, 12, 13] Theo hớng trên, đ nghiên cứu tách dòng đọc trình tự nucleotit đoạn ITS-1 chủng tảo Scenedesmus đợc phân lập từ hồ Hoàn Kiếm, sở xác định mối quan hệ chủng loại chủng tảo I phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Các mẫu tảo Scenedesmus đợc phân lập từ hồ Hoàn Kiếm Dơng Đức Tiến cs (Trung tâm Công nghệ sinh học, ĐHQGHN) cung cấp chủng đ đợc mô tả hình thái xếp vào loài Scenedesmus quadricauda (Turp.) var abudans Kirchn, Scenedesmus ellipsoides Chod, Scenedesmus obliquus (Turp.) var alternans, Scenedesmus obliquus (Turp.) var sp., Scenedesmus obliquus (Turp.) Kuetz var obliquu 367, Scenedesmus quadricauda var sp lần lợt đợc ký hiệu S-1695, S-190, S-177, S-4, S-35 S-G [3] Vectơ PCR2.1 TOPO hóa chất chuẩn h ng In Vitrogen Phơng pháp a Tách ADN: ADN tổng số đợc tách chiết 105 theo phơng pháp Trần Hữu Quang [4] b Phản ứng PCR: để nhân đoạn ITS-1 b»ng kü tht PCR tõ ADN tỉng sè, chóng đ sử dụng cặp mồi ITS1 (5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3') ITS2 (5'-Gctgcgttcttcatcgatgc-3') đặc hiệu cho loài tảo [8] Phản ứng PCR đợc thực máy PTC100 Programmable Thermal Controller MJ Reseach Mỗi phản ứng (20àl) gồm: ADN genom (50-100 ng) 1X PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,01% bovine serum albumin); 100 nM mồi; 100 àM dNTP; 0,5 đơn vị Taq polymeraza Phản ứng đợc bắt đầu bớc biến tính ADN khuôn 96oC phút; tiếp đến 30 chu kỳ, chu kỳ bao gồm bớc thay ®ỉi nhiƯt ®é nh− sau: 95oC - 30 gi©y; 60oC - phút; 72oC - phút Giai đoạn cuối đợc thực 72oC 10 phút Sản phẩm PCR đợc điện di gel agaroza 1% c Tạo dòng phân tử ADN: sản phẩm PCR đợc gắn vào vectơ PCR 2.1 TOPO h ng In Vitrogen, sau biến nạp vào tế bào E.coli (DH5) Các khuẩn lạc mang plasmit tái tổ hợp đợc chọn lọc môi trờng có bổ sung kanamycin, X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indol D-galactopyranosit) IPTG (isopropyl-Dthiogalactopyranosit) Plasmit đợc tách từ khuẩn lạc trắng riêng rẽ chọn lọc gel agaroza 0,8% Sự có mặt đoạn ITS-1 plasmit đợc kiểm tra lại enzym cắt giới hạn E.coRI Những khuẩn lạc đ mang gien đợc nhân với sinh khối lớn để tách tinh plasmit d Xác định trình tự ADN: trình tự nucleotit đoạn ITS-1 mẫu Scenedesmus đợc thực máy đọc trình tự tù ®éng ABI PRISM 377 ADN Sequencer, sư dơng ABI PRISM Big Dye Terminator Cylcle Sequecing Ready Reaction Kit cña h ng Perkin-Elmer Từ số liệu thu đợc, đ phân tích trình tự nucleotit đoạn ITS-1 mẫu Senedesmus xây dựng phân loại máy tính dựa chơng trình ClustalX Multiple Sequence Alignment Program (version 1.81, June 2000) 106 II Kết thảo luận Tách chiết ADN ADN tổng số đợc tách chiết theo phơng pháp Trần Hữu Quang cs [4] điện di kiểm tra gel agaroza 0,8% Kết điện di ADN đợc trình bày hình Sau đo độ hấp thụ bớc sóng 260/280 nm cho thấy ADN tách chiết đợc có hàm lợng độ tinh đủ để làm nguyên liƯu cho ph¶n øng PCR M H×nh ADN tỉng sè cđa chđng Scenedesmus phân lập từ hồ Hoàn Kiếm (M: Marker Kb; Cét 1: S-4; Cét 2: S-35; Cét : S-177; Cét 4: S-190; Cét 5: S-1695; Cét 6: S-G) Chạy PCR nhân đoạn ITS-1 Để nhân đoạn ITS-1 chủng Scenedesmus, đ chạy PCR sử dụng cặp mồi ITS1 ITS2 đặc hiệu cho loài tảo Sản phẩm đợc kiểm tra gel agaroza 0,8%, markơ đợc sử dụng kb Kết đ thu đợc sản phẩm đặc hiệu có kích thớc khoảng 250 pb (kết không đây) Tạo dòng phân tử Sản phẩm PCR đợc gắn vào plasmit PCR2.1 TOPO biến nạp vào tế bào E.coli (DH5) Sau chọn đợc khuẩn lạc mang plasmit tái tổ hợp, đ tách plasmit Để kiểm tra có mặt đoạn ITS-1, đ dùng enzym giới hạn E.coRI để cắt Sau chạy điện di, kiểm tra thấy đ văng băng ADN có kích thớc khoảng 250 bp Điều chứng tỏ đoạn ITS-1 đ đợc gắn vào plasmit M 10 M 250 bp Hình Kiểm tra đoạn ITS-1 chủng Scenedesmus đợc gắn plasmit enzym cắt giới hạn E.coRI Ghi chú: M: Markơ, Cột 2-9-10: đối chøng Cét 1: S-1695, cét 3: S-190, cét 4: S-177, cét 5: S-4, cét 7: S-35, cét 8: S-G Kết đọc trình tự nucleotit đoạn ITS-1 Sau tinh plasmit, đ xác định trình tự nucleotit máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 377 DNA Sequencer, sư dơng bé hãa chÊt chn ABI PRISM Big Dye Terminator Cylcle Sequecing Ready Reaction Kit cña h ng Perkin-Elmer Kết đọc trình tự nucleotit chủng Scenedesmus đợc trình bày hình S-1695 GCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGAGTTG 50 S-190 GCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGAGTTG S-G GCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGAGTTG S-4 GCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGAGTTG S-35 GCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGAGTTG S-177 GCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAGATATCCGTTGTTGAGAGTTG ***************************************************** S-1695 TTTTCGTTAAAACTGCCGATTAACAGCAGCCGAAACTTCAGAGTTTGGTT 100 S-190 TTTTCGTTAAAACTGCCGATTAACAGCAGCCGAAACTTCAGAGTTTGGTT S-G TTTTCGTTAAAACTGCCGATTAACAGCAGCCGAAACTTCAGAGTTTGGTT S-4 TTTTCGTTAAAACTGCCGATTAACAGCAGCCGAAACTTCAGAGTTTGGTT S-35 TTTTCGTTAAAACTGCCGATTAACAGCAGCCGAAACTTCAGAGTTTGGTT S-177 TTTTCGTTAAAACTGCCGATTAACAGCAGCCGAAACTTCAGAGTTTGGTT ***************************************************** S-1695 TAATCAATGGTTGGTCAATGGTGTGTGTGTGTGTGTAAGTAGGCCAAACC 150 S-190 TAATCAATGGTTGGTCAATGGTGTGTGTGTGTGTGTAAGTAGGCCAAACC S-G TAATCAATGGTTGGTCAATGGTGTGTGTGTGTGTAAGTAGGCCAAAGGGG S-4 TAATCAATGGTTGGTCAATGGTGTGTGTGTGTGTAAGTAGGCCAAACCGG S-35 TAATCAATGGTTGGTCAATGGTGTGTGTGTGTGTAAGTAGGCCAAACCGG S-177 TAATCAATGGTTGGTCAATGGTGTGTGTGTGTGTAAGTAGGCCAAACCGG *********************************** * S-1695 GGTGAGGGTTCGACCTAACGTCGGTACACAAGTAAAAGAGTGCGTGTTGT 200 S-190 GGTGAGGGTTC -ACCTAACGTCGGTACACAAGTAAAAGAGTGCGTGTTGT S-G TGAGGGTTCGACCTAACGTCGGTACACAAGTAAAAGAGTGCGTGTTGTGG S-4 TGAGGGTTCGACCTAACGTCGGTACACAAGTAAAAGAGTGCGTGTTGTGG S-35 TGAGGGTTCGACCTAACGTCGGTACACAAGTAAAAGAGTGCGTGTTGTGG S-177 TGAGGGTTCGACCTAACGTCGGTACACAAGTAAAAGAGTGCGTGTTGTGG * * *** ** * * * * * S-1695 GGTTTGCATATTCAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA S-190 GGTTTGCATATTCAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA S-G TTTGCATATTCAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA S-4 TTTGCATATTCAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA S-35 TTTGCATATTCAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA S-177 TTTGCATATTCAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA * ** * * 242 242 240 240 240 240 H×nh So sánh trình tự nucleotit đoạn ITS-1 chủng Scenedesmus phân lập từ hồ Hoàn Kiếm 107 Kết thu đợc cho thấy: chủng (S-G), (S-4), (S-35) (S-177) có trình tự nucleotit hoàn toàn giống Hai chủng lại (S-1695) (S-190) sai khác nucleotit vị trí 162 chuỗi trình tự đoạn ITS-1 Dựa chơng trình ClustalX Multiple Sequence Alignment Program (version 1.81, June 2000), chóng đ xây dựng phân loại chủng Scenedesmus (h×nh 4) S-1695 S-190 S-G S-4 S-35 S-117 H×nh Cây phát sinh chủng loại chủng Scenedesmus phân lập từ hồ Hoàn Kiếm Theo phân loại này, chủng Scenedesmus đ phân chia thành nhóm: nhãm thø nhÊt gåm chđng S-177 vµ S-35 Nhãm thø gåm chđng S-4, S-G, S-1695 vµ S-190 So sánh với kết sử dụng kỹ thuật RAPD để xác định mối quan hệ chủng Scenedesmus đ công bố [3] chủng S-4 S-G đ tách thành nhóm chủng S-G trở thành nhánh chủng S-4 Trong đó, chủng S-1695 S-190 thay đổi, chúng nằm nhánh nhánh phụ chủng S-G Nh vậy, cách phân tích trình tự nucleotit đoạn ITS-1 chủng S-G, S-4, S-35 vµ S-177 cã thĨ lµ cïng mét loµi thc chi Scenedesmus chủng S-1695 S-190 thuộc loài khác Dựa vào chơng trình ClustalX Multiple Sequence Alignment Program (version 1.81, June 2000) TreeView(1.6.12000), đ xác định đợc hệ số xa mặt di truyền chủng (S-G, S-4, S-35 S-177) chủng (S-1695 S-190) 0,34179 Trong đó, khoảng cách chủng S1695 S-190 nhỏ (0,00136) chøng tá chóng cã mèi quan hƯ di trun gần gũi Kết bổ sung cho kết đ công bố kỹ thuật RAPD phân loại kinh điển [3] 108 III Kết luận Lần Việt Nam, kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi ITS1& ITS2 đặc hiêu cho loài tảo, đ nhân tách dòng đợc đoạn ITS-1 (kÝch th−íc 250 bp) cđa chđng Scenedesmus ph©n lập từ hồ Hoàn Kiếm Kết phân tích so sánh trình tự nucleotit đoạn ITS-1 cho thấy có khác biệt mặt di truyền chủng Scenedesmus mức độ phân tử Trong ®ã, chñng S obliquus (Turp.) var alternans, S obliquus (Turp.) Kuetz var obliquu 367, S obliquus (Turp.) var sp S quadricauda var sp có trình tự nucleotit hoàn toàn giống Nh chúng đợc xếp vào loài chủng lại S quadricauda (Turp.) var abudans Kirchn S ellipsoides Chod khác biƯt nhÊt ë nucleotit, chøng tá chóng cã thể loài khác nhng có mối quan hệ di truyền gần gũi Để làm sáng tỏ mối quan hệ chủng Scenedesmus nh loài vi tảo khác, cần phải đọc so sánh trình tự nhiều gien khác nh đoạn ITS-2, gien rubisco, vùng intron nằm gien bảo thủ khác v.v Tài liệu tham khảo Dơng Đức Tiến, Võ Hành, 1997: Tảo nớc Việt Nam, phân loại tảo lục (Chlorococcales) NXB Nông nghiệp, Hà Nội Hoàng Thị Minh Hiền cs., 2000: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền cđa mét sè loµi Dunaliella (Chlorophyta) b»ng kü tht PCR-RAPD Những vấn đề nghiên cứu sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Trần Dụ Chi cs., 2000: Tạp chí Sinh học, 23(3a): 170-177 Trần Hữu Quang cs., 1999: Nghiên cứu trình tách chiết nhanh làm axit nucleic từ loài tảo biển Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh häc 1999: 107-113 Baker F T et al., 1992: J Phycology, 28: 839-845 6 Bente E and Linda M., 1998: Phycologia, 37(4): 275-283 Bird C J et al., 1992: Phycologia, 31: 510-522 Edvardsen E and Medlin L., 1998: Phycologia, 37: 275-283 Kaku H et al., 1999: Genetic diversity analysis of Agrobacteria and Rhizobia based on PCR-RFLP of 16S rDNA- 23S rDNA intergenic spacer region International Conference on Asian Netword 10 11 12 13 on Microbial Research Chiang Mai, Thailand, 705-716 Naomi P., Celia M S and Clifford W M., 2001: Phycological Research, 49: 97102 Norishige Y et al., 2001: Fisheries science, 67: 857- 862 Tadao Y., ValÐrie S and Takeo H., 2000: Phycological Research, 48: 125-131 ValÐrie S et al., 2000: Phycological Research, 48: 251-260 Phylogenetic relationships of some Scenedesmus strains (Chlorophyta) isolated from the hoankiem lake by basing on ITS-1 DNA sequences Nguyen Duc Bach, Dang Diem Hong, Duong Duc Tien, Nguyen Van Dong Summary Six strains of Scenedesmus, differing in their organic body scale morphology, were isolated from the Hoankiem lake, Hanoi city Using PCR technique, we amplified and sequenced the ITS-1 (internal transcribed spacer), located in the region of DNA encoding for 18S and 5,8 S ribosomes Based on the alignment of the ITS-1 sequence and the phylogenetic representation, six strains were divided into two main clusters (genetic distant coefficient was 0.34179) One of which was absolutely identical in genetic-homology and composed of S obliquus (Turp.) var alternans, S obliquus (Turp.) Kuetz var obliquu 367, S obliquus (Turp.) var sp and Scenedesmus quadricauda var sp; these four strains were suggested to be an exclusive species of the genus Scenedesmus The second group included Scenedesmus quadricauda (Turp.) var abudans Kirchn and Scenedesmus ellipsoides Chod (genetic distant coefficient was 0.00136) might be two distinct species but were almost identical in genetic relationship Ngµy nhËn bµi: 23-5-2002 109 ... So sánh trình tự nucleotit đoạn ITS-1 chủng Scenedesmus phân lập từ hồ Hoàn Kiếm 107 Kết thu đợc cho thấy: chủng (S-G), (S-4), (S-35) (S-177) có trình tự nucleotit hoàn toàn giống Hai chủng lại... chủng Scenedesmus phân lập từ hồ Hoàn Kiếm Kết phân tích so sánh trình tự nucleotit đoạn ITS-1 cho thấy có khác biệt mặt di truyền chủng Scenedesmus mức độ phân tử Trong đó, chủng S obliquus (Turp.)... đợc hệ số xa mặt di truyền chủng (S-G, S-4, S-35 vµ S-177) vµ chđng (S-1695 vµ S-190) 0,34179 Trong đó, khoảng cách chủng S1695 vµ S-190 lµ rÊt nhá (0,00136) chøng tá chóng cã mối quan hệ di truyền