Bài viết nghiên cứu các tính chất cảu Enzym PDH45 mở xoắn AND của cây đậu Hà Lan (Pisum Stavum L.) thông qua gien PDH45 là một gien không có intron; vai trò của gien PDH45 trong quá trình biệt hóa của hoa...
26(1): 39-47 Tạp chí Sinh học 3-2004 Nghiên cứu tính chất enzym PDH45 mở xoắn ADN đậu Hà Lan (Pisum sativum L.) Phạm xuân hội, trần q ViƯn Di trun n«ng nghiƯp Phan tn nghÜa Trờng đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN Narendra Tuteja Trung tâm Kỹ thuật gien Công nghệ sinh học Quốc tế Tất sống hành tinh sử dụng ADN nh nguyên liệu mang thông tin di truyền ADN helicaza nhóm enzym xúc tác việc mở xoắn sợi đôi ADN để tạo hai sợi đơn ADN việc bẻ gẫy cầu liên kết hydrogen hai sợi đơn, chúng có vai trò thiết yếu tất hoạt động trao đổi chất ADN nh trình chép, tái tổ hợp, sửa chữa ADN nh trình phiên m dịch m Cho đến nay, đ có khoảng 80 gien m hóa cho ADN helicaza từ đối tợng nh− E coli, thùc khuÈn thÓ, nÊm men, mét sè động vật có vú ngời đ đợc nhân dòng, tinh nghiên cứu tính chất, chứng tỏ sù phỉ biÕn cđa ADN helicaza thiªn nhiªn còng nh vai trò chúng tế bào thể pdh45 gien m hóa ADN helicaza thực vật đợc phân lập nghiên cứu [6] Trong viết này, trình bày kết nghiên cứu chi tiết đặc tính enzym PDH45 nh ảnh hởng yếu tố khác lên hoạt tính mở xoắn ADN enzym PDH45, cấu trúc gien m hãa cđa enzym PDH45 vµ biĨu hiƯn gien pdh4 điều kiện môi trờng, giai đoạn khác trình phát triển hoa I phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Đậu hà lan ngày tuổi điều kiện giai đoạn sinh trởng, phát triển khác vờn thí nghiệm Trung tâm Kỹ thuật gien Công nghệ sinh häc quèc tÕ (New Delhi) cung cÊp ADN M13 sợi đơn oligo để làm chất cho nghiên cứu hoạt động mở xoắn ADN Trung tâm Kỹ thuật gien Công nghệ sinh học quốc tế Trieste (Italia) cung cÊp C¸c hãa chÊt, bé kit sư dụng thí nghiệm đợc đặt mua từ h ng Promega, Clonetech, Stratagene Các hóa chất đánh dấu phóng xạ h ng Amersham Phơng pháp a) Nghiên cứu cấu trúc gien kỹ thuật phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) ADN hệ gien đậu hà lan đợc tinh dựa theo phơng pháp Murray Thompson (1980) Dellaaporta cs [3] ADN hệ gien ADN bổ sung (ADNc) đợc dùng làm sợi khuôn cho PCR hai mồi đặc hiệu đợc thiết kế hai đầu 5' 3' dựa vào trình tự nucleotit m hãa cđa gien pdh Ph¶n øng PCR đợc tiến hành 50àl hỗn hợp phản ứng gồm 100 ng (ADNs) hay 300 ng (ADN hƯ gien) lµm sợi khuôn, 50 ng chất mồi, 0,15 mM dNTPs, àl 10 x đệm Taq 2,5 đơn vị Taq polymeraza Chu kú nhiƯt cđa ph¶n øng nh− sau: 940C, phút để tách chuỗi ADN đôi thành chuỗi đơn, 550C, phút để gắn mồi; 720C, phút 20 giây để sinh tổng hợp chuỗi ADN Phản ứng đợc tiến hành liên tục 30 chu kỳ lặp lại b) Phân tích thể gien pdh45 thẩm tách ARN ARN tổng số đợc tinh theo phơng pháp Chomczynski Sacchi [2] Quá trình 39 điện di, xử lý gel chuyển ARN lên màng nh mô tả Reddy cs [7] Toàn đoạn gien pdh45 (1,6 kb) đợc tách viƯc xư lý plasmit mang gien bëi enzym EcoR1 vµ Xho1 Khoảng 50 - 100 ng đoạn gien pdh4 đợc đánh dấu phóng xạ phơng pháp dịch điểm đứt (nick translation) Màng chứa mẫu ARN lúc đầu đợc lai với ADN đ biến tính tinh trùng cá hồi , sau đợc rửa lai với đoạn gien pdh45 đánh dấu phóng xạ phân tích phóng xạ tự chụp c) Nghiên cứu hoạt tính bám poly(A) ARN enzym PDH45 phơng pháp dịch chuyển băng (band shift assay) Khoảng àg ADN plasmit chứa đoạn 0,2 kb clon pdh45 clon kb HPDE chứa poly(T) đợc xử lý với enzym XhoI để tạo dạng mạch thẳng ADN đ xử lý đợc tinh cách chiết với hỗn hợp phenol/clorophoc 20-30 ng ADN từ clon đợc sử dụng làm sợi khuôn cho phản ứng phiên m in vitro Phản ứng phiên m in vitro đợc tiến hành 100àl hỗn hợp phản ứng gồm 20-30 ng ADN sợi khuôn, mM ATP, 1mM CTP, mM GTP, 10 mM DTT (dithiothreitol), 20 đơn vị RNasin (chất ức chế ARNaza), 6àl - 32P UTP 100 đơn vị T3 ARN polymeraza Phản ứng tiến hành 370C giờ, sau bổ sung thêm 50 đơn vị T3 ARN polymeraza cho phản ứng tiếp tục thêm 30 phút ADN sợi khuôn hỗn hợp phản ứng đợc loại bỏ ADNaz, phần phóng xạ tự đợc loại bỏ việc chạy hỗn hợp phản ứng qua cột Sephadex G-50 Sản phẩm phản ứng phiên m in vitro (poly(A) ARNs đánh dấu phóng xạ) đợc sử dụng làm chất cho phản ứng dịch chuyển băng Khả bám poly(A) ARN enzym PDH45 đợc tiến hành 10àl hỗn hợp phản ứng chứa đệm Tris - HCl 20 mM pH 8.0, MgCl2 mM, ATP mM, KCl 60 mM, dithiothreitol (DDT) mM, sacaroza 4% , albumin huyÕt bò (BSA) 80àg/ml, 2àl poly (A) ARN đ đợc đánh dấu 200 ng 400 ng enzym PDH45 thời gian 30 phút nhiệt độ phòng Phản øng kÕt thóc b»ng viƯc bỉ sung 2µl chÊt chØ thị màu sản phẩm phản ứng đợc điện di gel polyacrylamit không biến tính 6% Gel đợc sấy khô phân tích 40 phong pháp phóng xạ tự chụp d) Chuẩn bị chất cho nghiên cứu hoạt tính mở xoắn ADN enzym PDH45 Cơ chất để phân tích hoạt động mở xoắn ADN ADN helicaza đoạn oligonucleotit đợc đánh dấu phóng xạ đầu 5' đầu 3' gắn với ADN sợi đơn mạch vòng (M13 viral ADN) để tạo phần xoắn đôi có chiều dài thông thờng 17 nucleotid Việc đánh dấu oligo đầu đợc tiến hành nh mô tả Sambrook cs [8] 50-100 ng oligo đánh dấu đầu đợc gắn vào - àg ADN M13 sợi đơn mạch vòng 50 àl hỗn hợp phản ứng chứa 40 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl vµ mM dithiothreitol Hỗn hợp phản ứng đợc làm biến tính 95 0C phót, sau g¾n ë 650C 20 phút giảm nhiệt độ từ từ tới nhiệt độ phòng Cơ chất phản ứng với helicaza 30 ë 37 0C víi sù cã mỈt cđa ATP ion Mg+2 Sản phẩm phản ứng mở xoắn ADN đợc điện di gel polyacrylamit không biến tính 12% Gel đợc sấy khô phân tích phơng pháp phóng xạ tự chụp [10] II Kết nghiên cứu Gien pdh45 gien intron Cấu trúc gien thể bậc cao thờng bao gồm đoạn m hóa (exon) đoạn không m hóa (intron) Để tìm hiểu có mặt đoạn không m hóa gien pdh45 tiến hành phản ứng PCR sử dụng ADN hệ gien ADNc đậu hà lan làm sợi khuôn với mồi để tìm kiếm khác vỊ kÝch th−íc cđa s¶n phÈm ph¶n øng PCR Kết thí nghiệm (hình 1) cho thấy sai khác kích thớc sản phẩm phản ứng PCR ADN hệ gien ADNc đậu hà lan đợc dùng làm sợi khuôn (hình 1: cột 1-4, 6,7) Sản phẩm phản ứng PCR sử dụng ADN hệ gien làm sợi khuôn xuất (hình 1: cột 1, 2) đợc giải thích có mặt ADN sợi khuôn, nhiều sản phẩm PCR đợc quan sát với phản ứng PCR thứ hai sử dụng sản phẩm phản ứng PCR làm sợi khuôn (hình 1: cột 3, 4) Kết thí nghiệm chứng minh gien pdh45 gien không chøa intron 1.2 kb Hình Gien pdh45 không chứa intron Cột 1, sản phẩm phản ứng PCR thứ sử dụng ADN hệ gien nh sợi khuôn Cột 3, sản phẩm phản ứng PCR thứ hai sử dụng sản phẩm phản ứng PCR thứ nh sợi khuôn Cột băng chuẩn Cột sản phẩm phản ứng PCR sử dụng ADNc nh sợi khuôn Gien pdh45 vai trò tr×nh biƯt hãa cđa hoa Sù biĨu hiƯn cđa gien pdh45 giai đoạn phát triển hoa đối tợng cho việc tìm hiểu vai trò gien pdh45 trình biệt hóa hoa đậu hà lan Các giai đoạn khác hoa (F1, F2, F3, F4, F5) đợc mô tả tóm tắt bảng Hoa đậu hà lan giai đoạn phát triển khác đợc sử dụng cho việc tách ARN tổng số 30 àg ARN tổng số từ giai đoạn phát triển đợc chạy điện di gel phormaldehyt-agaroza 1,2% Sau chạy điện di, ARN đợc chuyển lên màng Trớc lai, màng đợc nhuộm với xanh mêthylen để quan sát hàm lợng ARN từ mẫu đ đợc chuyển lên màng (hình 2A) Màng đợc lai với toàn đoạn gien pdh45 đánh dấu phóng xạ (hình 2B) Kết thí nghiệm cho thấy biểu gien pdh45 khác biệt giai đoạn phát triển hoa từ giai ®o¹n F2 ®Õn F5 Sù biĨu hiƯn cđa gien pdh45 đợc phát mức độ cao giai đoạn F1 (hình 2B: cột 1) hàm lợng ARN tổng số đợc đa lên màng để lai cột (hình 2A: cột 1) Kết thí nghiƯm chøng minh r»ng gien pdh45 cã vai trß quan trọng giai đoạn sớm hình thành hoa, nhiên vai trò trình biệt hóa hoa Bảng Mô tả tóm tắt giai đoạn phát triển hoa đậu hà lan Giai đoạn Kích thớc (mm) Mô tả Nét đặc trng F1 7-10 Giai đoạn nụ Hoa cha nở, cánh hoa quan sát F2 10-12 Giai đoạn nụ Hoa cha nở, cánh hoa lớn F3 13-15 Hoa vừa nở Cánh hoa nở nhng cha hoàn toàn F4 15 Hoa trởng thành Cánh hoa nở hoàn toàn, đài hoa nguyên F5 15 Hoa tàn Đài hoa rông 41 F1 F2 F3 F4 F5 28 S F1 F2 F3 F4 F5 1,6 kb 18 S B A Hình Biểu gien pdh45 giai đoạn phát triển khác hoa A: ARN tổng số từ giai đoạn phát triển khác hoa đợc chạy điện di nhuộm xanh mêtylen 18S 28S ARN ribosom B: Blot đợc lai với đoạn gien pdh45 đ đợc đánh dấu phóng xạ Một ARN 1,6 kb tơng ứng với pdh45 đợc phát tất giai đoạn phát triển hoa F1, F2, F3, F4, F5 tơng ứng vói cét 1, 2, 3, 4, chØ møc ®é thể pdh45 giai đoạn khác Tối Sáng Hồng ngoại Đỏ Lam Tối 28S Sáng Hồng ngoại Đỏ Lam 1,6 kb 18S 1 A 4 5 B H×nh Biểu gien pdh45 điều kiện chiếu sáng khác A: ARN tổng số từ điều kiện chiếu sáng khác đợc chạy điện di nhuộm xanh mêtylen 18 S 28 S la ARN ribosom B: Blot đợc lai với đoạn gien pdh45 đ đợc đánh dấu phóng xạ Một ARN 1.6 kb tơng ứng với pdh45 đợc phát Các điều kiện chiếu sáng: tối, sáng, hồng ngoại, đỏ, lam tơng ứng vãi c¸c cét 1, 2, 3, 4, chØ mức độ thể pdh45 điều kiện chiÕu s¸ng kh¸c Sù thĨ hiƯn cđa gien pdh45 đợc kích hoạt ánh sáng lam Để tìm hiểu biểu gien pdh45 điều kiện ánh sáng khác nhau, đậu hà lan ngày tuổi đợc gieo trồng điều kiện ánh sáng, ánh sáng trắng, hồng ngoại, đỏ lam đợc sử dụng cho việc tách ARN tổng số 30mg ARN tổng số từ điều kiện chiếu sáng đợc chạy điện di gel phormaldehyt-agaroza 1,2%, sau chuyển lên màng Màng đợc nhuộm methylen xanh để quan sát hàm lợng ARN từ mẫu đ đợc 42 chuyển lên màng (hình 3A) Màng đợc lai với toàn đoạn gien pdh45 đánh dấu phóng xạ (hình 3B) KÕt qu¶ thÝ nghiƯm chøng tá r»ng sù biĨu hiƯn gien pdh45 mức độ cao đợc quan sát mẫu ARN đợc xử lý ánh sáng lam (hình 3B: cột 5) Sự biểu mức độ cao gien pdh45 đợc quan sát mẫu ARN đợc xử lý điều kiện tối (hình 3B: cột 1) Tuy nhiên, điều đợc giải thích hàm lợng ARN màng cột mẫu ánh sáng nhiều so với cột khác (hình 3A: cột 1) Kết thí nghiệm khẳng định biểu gien pdh45 đợc kích hoạt ánh sáng lam Enzym PDH45 có khả bám poly (A) ARN Kết thí nghiệm nghiên cứu khả bám poly (A) ARN enzym PDH45 đợc trình bày hình 4, hình 4A t−¬ng øng víi c¬ chÊt 0,25 kb poly(A) ARN hình 4B tơng ứng với chất Kb poly (A) ARN, cột phản ứng enzym PDH45 0.25kb poly(A) RNA A Phức hợp PDH45 ARN đánh dấu cột phản ứng có mặt 200 400 ng enzym PDH45 KÕt qu¶ thÝ nghiƯm chØ r»ng phức hợp tạo enzym PDH45 poly (A) ARN đợc quan sát tất phản ứng cã sù tham gia cđa enzym PDH45 (h×nh 4A, B; cột 2,3) Việc tăng hàm lợng enzym PDH45 tới 400ng cho phản ứng đ dẫn tới di chuyển phức hợp enzym PDH45 poly (A) ARN chậm trình điện di (hình 4A, B; cột 3) Kết chứng minh enzym PDH45 có khả b¸m poly (A) ARN 1kb poly(A) B 5’ARN 3’ Phøc hợp PDH45 ARN đánh dấu ARN đánh giấu ARN đánh dấu 3 Hình Khả bám poly (A) ARN enzym PDH45 Hỗn hợp poly (A) ARN đ đợc đánh dấu enzym PDH45 đợc ủ 30 phút sau điện di gel polyacrylamit không biến tính 6% Sự hình thành phức hợp poly (A) ARN - enzym PDH45 đợc quan sát chụp ảnh phóng xạ tự động Lợng phóng xạ tự phức hợp đợc mũi tên Cột phản ứng enzym PDH45, cột phản ứng có 200 400 ng enzym PDH45 A: Khả bám 0,25 kb poly (A) RNA cđa enzym PDH45 B: Kh¶ bám kb poly (A) ARN enzym PDH45 Đặc tính hoạt động mở xoắn ADN enzym PDH45 yêu cầu phản ứng Các yêu cầu phản ứng cho hoạt động mở xoắn ADN enzym PDH45 đợc trình bày bảng Enzym PDH45 bị mÊt ho¹t tÝnh ë 56oC Ho¹t tÝnh enzym bị phá hủy hỗn hợp phản ứng có chứa trypsin Hoạt tính mở xoắn enzym PDH45 hoàn toàn bị ức chế mM EDTA, 45 mM ammonium sulfat, 100 mM phosphat kali (pH8,0), 30 mM M13 ssDNA Tuy vËy, M13 RFI DNA, E.coli tARN, ARN tæng số đậu hà lan, poly A, poly C, poly G hay poly U nồng độ 30mM ảnh hởng đến hoạt động mở xoắn ADN enzym PDH45 Hoạt động mở xoắn ADN enzym PDH45 phụ thuộc ATP Ion Mg2+ Hoạt tính enzym bị mÊt nÕu thay thÕ ATP bëi ATPγS, ADP, AMP hc thay thÕ Mg2+ bëi 43 c¸c ion kh¸c nh− Zn2+, Cu2+, Ni2++, Ag2+ Ca2+ Tuy nhiên, enzym thể khoảng10% hoạt động mở xoắn ADN nồng độ ion Mn2+ Ca2+ 0,6 mM nồng độ KCl NaCl 200 mM, hoạt động mở xoắn không bị ức chế đáng kể Thay MgCl2 MgSO4 Mg(CH3 C00)2 không ảnh hởng đáng kể đến hoạt động mở xoắn ADN enzym Bảng Điều kiện phản ứng cho hoạt động mở xoắn ADN enzym PDH45 Điều kiện phản ứng Phản ứng đầy đủ Phản ứng PDH45 PDH45 đ đợc xử lý 56oC, -ATP -ATP + ATP γS (0,6 mM) -ATP + ADP (0,6 mM) or AMP (0,6 mM) -MgCl2 -MgCl2 + CaCl2 (0,6 mM) -MgCl2 + ZnSO4 (0,6 mM) -MgCl2 + MnCl2 (0,6 mM) -MgCl2 + CuCl2 (0,6 mM) -MgCl2 + NiCl2 (0,6 mM) -MgCl2 + AgNO (0,6 mM) -MgCl2 + CoCl2 (0,6 mM) -MgCl2 + MgSO4 (0,6 mM) -MgCl2 + Mg(CH3COO)2 (0,6 mM) +KCl or NaCl (200 mM) +(NH4)2SO4 (45 mM) +KPO4 (pH 8,0 , 100 mM) +EDTA (5 mM) +M13ssDNA (30 mM) +M13RFI DNA (30 mM) +Pea leaves total RNA (30 mM) +E coli t-RNA (30 mM) +Poly[A] or Poly[C] or Poly[G] or Poly[U] +Trypsin (1U) % më xo¾n ADN 67