Bước đầu tìm hiểu nguồn gốc và phả hệ của virut gây bệnh “Nhộng Bọc” (Sacbrood) ở ong mật tại Việt Nam

Bước đầu tìm hiểu nguồn gốc và phả hệ của virut gây bệnh “Nhộng Bọc” (Sacbrood) ở ong mật tại Việt Nam thông qua nghiên cứu virut cường độc SBV của Việt Nam và tách chiết hệ gien ARN; chọn mồi và thực hiện phản ứng RT-PCR...

26(3): 37-42 Tạp chí Sinh học 9-2004 Bớc đầu tìm hiểu nguồn gốc phả hệ virút gây bệnh nhộng bọc (sacbrood) ong Mật việt nam Lê Thanh Hòa Viện Công nghệ sinh học Phạm Viết Liên Trung tâm nghiên cứu ong trung ơng Sacbrood virút (SBV) loại virút gây bệnh ấu trùng ong dạng túi hay gọi bệnh nhộng bọc (sacbrood) đợc phát lần vào năm 1913 đợc mô tả chi tiết vào năm 1917 [10] Khi bị bệnh, ấu trùng ngừng phát triển, không lột xác, mô bị biến hóa, hình dạng bị thay đổi tạo thành dạng túi, trớc có màu vàng, sau chuyển thành nâu khô đen [1, 2, 4, 5] SBV thuộc họ Picornaviridae, có dạng hình cầu, đờng kính 28 nm; chứa hệ gien ARN sợi có độ dài 8832 nucleotit [7] HƯ gien cđa SBV chØ cã nhÊt mét gien m hãa cho protein chung gåm 2858 axit amin, hỵp nhÊt cđa protein bao gåm: protein cÊu tróc, enzym helicaza, enzym proteaza vµ enzym ARN-polymeraza (GenBank: AF092924) [7] Chẩn đoán SBV dựa vào giám định hình thái kính hiển vi điện tử phơng pháp truyền thống nh phản ứng thấm miễn dịch (western blot), phản ứng miễn dịch phóng xạ (radio-immunoassay) phản ứng hấp phụ miễn dịch enzym (ELISA) Các phơng pháp không nhạy, thiếu xác, không đặc hiệu không xác định đợc chủng, típ SBV Hiện cha có dòng tế bào thích hợp để nuôi cấy SBV, nên gần đây, việc chẩn đoán phân lập SBV không thực đợc phòng thí nghiệm [8] Tại Việt Nam, bệnh SBV xảy nặng nề nớc, gây thiệt hại to lín vỊ kinh tÕ Do hƯ gien cđa SBV chứa ARN, nên trớc hết phải dùng enzym chép ngợc để chuyển đổi thành ADN, sau dùng phản ứng PCR để nhân vùng cần nghiên cứu, phản ứng đợc gọi PCR ngợc (RT-PCR = reverse transcription PCR) Từ bệnh phẩm phân lập Việt Nam, phản ứng RT- PCR so sánh đối chiếu với chủng SBV châu á, SBV Việt Nam đ đợc giám định phơng pháp sinh học phân tử, đợc đăng ký Ngân hàng Gien víi sè hiƯu: AY216794 Tuy nhiªn, SBV cã mèi quan hƯ hä hµng vµ ngn gèc nh− thÕ nµo với chủng SBV gây bệnh sacbrood giới vấn đề cần xem xét Trong báo này, giới thiệu kết bớc đầu tìm hiểu nguồn gốc phả hệ chủng SBV Việt Nam thức xác định chủng SBV gây bệnh ấu trùng ong dạng túi loài ong mật nội (Apis cearana) có họ hàng gần với chủng SBV cđa Trung Qc, gÇn gòi víi mét sè chđng khác châu á, khác xa với nhiều chủng châu âu I phơng pháp nghiên cứu Mục đích Thu nhận giải trình trình tự nucleotit axit amin mét vïng gien cđa chđng SBV cđa ViƯt Nam (tơng ứng với vị trí 5707-6604 [7]; Ngân hàng Gien: AF092924) Sử dụng chơng trình phân tích phả hệ tiến hóa (MEGA2.1), so sánh đối chiếu thành phần nucleotit vµ axit amin cđa chđng SBV cđa ViƯt Nam với chủng châu giới thu nhận từ Ngân hàng Gien, xác lập phả hệ tìm hiểu nguồn gốc, quan hệ họ hàng chúng Virút cờng độc SBV Việt Nam tách chiÕt hÖ gien ARN BÖnh phÈm nghi cã chøa SBV ấu trùng dạng túi đợc thu nhận từ đàn ong mật bị bệnh sacbrood điển hình Trung tâm nghiên 37 cứu ong trung ơng cung cấp Qua kiểm tra lâm sàng, triệu chứng, xem xét bệnh tích, đàn ong đợc xác định bị bệnh sacbrood Bệnh phẩm có bệnh tích đặc trng đợc cất giữ 20oC, sử dụng Hệ gien ARN hay gọi ARN tổng số, đợc tách chiết phơng ph¸p sư dơng hãa chÊt trizol (h ng GIBCO/BRL) [6] ARN tổng số SBV Việt Nam đợc tách chiÕt trùc tiÕp tõ bƯnh phÈm cđa Êu trïng ong mật bị bệnh Sau tách chiết, ARN tổng số đợc kiểm tra thạch agaroza 0,8%, tính toán hàm lợng ARN cho phản ứng RT-PCR, bảo quản 20oC sử dụng Chọn mồi thực phản ứng RT-PCR Chúng dùng mồi xuôi SB11F: 5ATATACGGTGCGAGAACTGC3 (vị trí: 5707-5726), mồi ngợc SB12R: 5CTCGGTAATAACGCCACTGT3 (vị trí: 6585-6604) theo thiết kế Grabensteiner cs (2001) sử dụng cho phản ứng RT-PCR để thu nhận đoạn gien dài khoảng 0,89 kbp Phản ứng RT-PCR đợc sử dụng phản ứng bớc (one-step RT-PCR) h ng Qiagen (QIAGEN Inc.) bao gồm giai đoạn: giai đoạn chuyển đổi (RT) biến ARN thành ADN thời gian 30 phút 50oC, giai đoạn nhân ®o¹n gien (PCR) thùc hiƯn chu kú 15 ë 95oC; 35 chu kú (94oC: 20 gi©y; 50oC: 20 giây; 72oC: phút) chu kỳ cuối cïng ë 72oC 10 S¶n phÈm RT-PCR cđa SBV Việt Nam đợc tách dòng vectơ pCR2.1 (Invitrogen Inc.) Plasmit tái tổ hợp đợc chọn lọc theo quy trình [9] ADN plasmit tái tổ hợp đợc t¸ch chiÕt b»ng bé hãa chÊt (kit) cđa Qiagen (QiaPrep Spin Mini Kit) Độ dài đoạn gien có plasmit tái tổ hợp đợc kiểm tra thạch 0,8%, sau xư lý b»ng enzym giíi h¹n EcoRI Chọn chuỗi tơng ứng để so sánh đối chiếu Chúng dùng phơng pháp truy cập Ngân hàng Gien (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), để tìm kiếm tất chuỗi nucleotit có tất chủng SBV đ đợc đăng ký Chuỗi nucleotit SBV Việt Nam đợc đăng ký Ngân hàng gien AY216794 giới số AF092924 từ AF284648 đến AF284660, bao gồm chủng có nguồn gốc từ Anh, áo, Đức, ấn Độ, Nêpan, Trung Quốc (bảng 1) Các chuỗi nucleotit axit amin chủng SBV Việt Nam giới đợc chọn để so sánh đối chiếu phân tích phả hệ Bảng Tên số đăng ký Ngân hàng Gien chuỗi nucleotit chủng SBV Việt Nam giới dùng để so sánh nghiên cứu phân tích phả hệ Tên chủng (ký hiệu) Số đăng ký Ngân hàng Gien (GB) Nguồn gốc Tài liệu công bố SB(VN) AY216794 Việt Nam Lê Thanh Hòa cs 2003 (GB) SB(CN) AF469603 Trung Quốc Zhang cs (Ngân hàng Gien) SB(UK1) AF284648 Anh Grabensteiner cs 2001 SB(AU) AF284649 áo Grabensteiner cs 2001 SB(GER1) AF284651 Đức Grabensteiner cs 2001 SB(GER2) AF284650 Đức Grabensteiner cs 2001 SB(GER3) AF284652 Đức Grabensteiner cs 2001 SB(GER4) AF284653 Đức Grabensteiner cs 2001 SB(GER5) AF284654 Đức Grabensteiner cs 2001 38 SB(GER6) SB(GER7) SB(GER8) SB(NP1) SB(NP3) SB(IN) AF284655 AF284656 AF284657 AF284658 AF284659 AF284660 SB(UK2) AF092924 Các chơng trình sử dụng để phân tích quan hệ phả hệ tiến hóa Trình tự nucleotit chủng SBV Việt Nam đợc giải trình máy tự động ABI377 h ng Perkin-Elmer (Mỹ), sau đợc xử lý chơng trình SeqEd1.03 chơng trình AssemblyLIGN 1.9 hệ chơng trình MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) So sánh đối chiếu xử lý số liệu tất chuỗi chơng trình GENDOC2.5 (Nicholas Nicholas, 1999) Thành phần axit amin đợc thu nhận cách sử dụng bé m cña vi sinh vËt bËc thÊp (vi khuÈn) Ngân hàng Gien (bảng m di truyền số 11) thông qua chơng trình GENDOC 2.5 Tất chuỗi cđa 16 chđng SBV ®ã cã chđng cđa Việt Nam đợc xếp theo xử lý chơng trình GENDOC2.5 đa vào phân tích phả hệ chơng trình MEGA2.1 thành phần nucleotit axit amin, sư dơng hƯ sè tiÕn hãa thÊp ME (minimum evolution index) (Kumar cs., 2001) Địa điểm nghiên cứu Công việc giữ giống SBV Việt Nam, tách chiết hệ gien ARN, thực phản ứng RTPCR, tách dòng sản phẩm, chọn lọc plasmit tái tổ hợp phần phân tích số liệu đợc thực phòng thí nghiệm virút học, thuộc Phòng miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học Giải trình trình tự nucleotit phần phân tích xử lý số liệu đợc tiến hành Viện nghiên cứu Y học Queensland, ôxtrâylia II kết bàn luận So sánh đối chiếu thành phần đoạn gien SBV Việt Nam giới Đức Đức Đức Nêpan Nêpan ấn Độ Anh Grabensteiner vµ cs 2001 Grabensteiner vµ cs 2001 Grabensteiner vµ cs 2001 Grabensteiner vµ cs 2001 Grabensteiner vµ cs 2001 Grabensteiner vµ cs 2001 Ghosh vµ cs 1999 Bảng trình bày kết so sánh đối chiếu phân đoạn gien có độ dài 818 nucleotit 272 axit amin tất chủng SBV Việt Nam giới Các chủng SBV giới có nguồn gốc châu châu âu, thích ứng gây bệnh hai loài ong Apis cerana (chủ yếu đợc nuôi châu á) Apis mellifera (chủ yếu đợc nuôi châu âu) Mức độ tơng đồng chủng khác giới nucleotit 88-100%, axit amin 92-100% Các chủng có nguồn gốc phân lập (cùng vùng địa lý) có mức độ tơng đồng cao, cụ thể chủng châu bao gồm Việt Nam, Trung Quốc, ấn Độ, Nêpan 93-96% (nucleotit) 95-97% (axit amin); chủng châu âu, bao gồm áo, Đức, Anh 92-99% (nucleotit) 96-99% (axit amin) Riêng chủng SB(NP3) (Nêpan 3) có mức độ tơng đồng với chủng châu thấp (92-93%) so với chủng châu âu (96-97%) chủng phân lập từ ong bệnh thuộc loài A mellifera, tõ loµi ong néi A cerana nh− chđng SB(NP1) SBV có quan hệ họ hàng liên quan đến loài ong bị nhiễm châu âu, á, Phi [8] Với chủng phân lập nớc, mức độ tơng ®ång vỊ nucleotit ®¹t 97-100%, vỊ axit amin ®¹t 98-100%; đặc biệt có nhiều chủng có mức độ tơng đồng đạt tối đa (100%) (bảng 2) Phân tích quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng SBV Việt Nam Bằng chơng trình MEGA2.1, với thông số tiến hãa thÊp (minimum evolution; ME), chđng SBV cđa ViƯt Nam chủng giới liệt kê bảng đợc so sánh thành phần nucleotit axit amin xem xét quan hệ nguồn 39 Bảng Mức độ tơng đồng (%) nucleotit (trên đờng chéo) axit amin (dới đờng chéo) so sánh phân đoạn gien chủng SBV Việt Nam 1 10 11 12 13 14 15 16 97 95 95 93 92 93 92 92 92 92 92 93 92 94 94 96 95 96 93 92 93 92 92 92 92 92 93 92 95 94 94 94 95 94 93 94 93 93 93 93 93 94 93 96 95 93 93 94 93 94 94 94 94 94 94 94 95 94 95 95 89 88 89 88 89 89 90 89 94 96 96 96 96 96 96 96 97 96 97 97 89 89 90 89 94 98 98 100 100 100 99 100 98 98 96 97 98 98 98 99 98 98 98 97 97 89 89 90 89 94 99 98 10 89 89 89 89 90 90 89 89 94 94 100 100 98 98 99 99 100 100 100 100 99 99 99 100 100 100 98 98 98 98 98 98 96 96 96 97 97 97 11 89 89 90 89 94 98 99 99 98 98 99 98 98 96 97 12 89 89 90 89 94 100 98 99 100 100 98 13 88 88 89 89 93 97 97 97 97 97 97 97 98 98 96 97 98 97 97 14 88 88 89 89 93 97 97 97 97 97 97 97 97 96 97 15 89 89 90 89 92 92 93 93 92 92 93 92 92 92 16 89 89 90 89 92 93 93 93 93 93 93 93 93 93 99 99 Ghi chó: 1: SB(VN); 2: SB(CN); 3: SB(IN); 4: SB(NP1); 5: SB(NP3); 6: SB(GER1); 7: SB(GER2); 8: SB(GER3); 9: SB(GER4); 10: SB(GER5); 11: SB(GER6); 12: SB(GER7); 13: SB(GER8); 14: SB(AU); 15: SB(UK); 16: SB(UK2) Ký hiƯu vµ ngn gốc chủng trình bày bảng Mức độ tơng đồng cao nucleotit axit amin chủng phân lập nớc (Đức) (các chủng GER1-8) đợc đóng khung bôi đậm để nhận xét (cét 6-13, ngang vµ däc) SB(GER5) SB(GER7) Nucleotit SB(GER4) SB(GER1) SB(GER3) SB(GER2) SB(GER6) SB(GER8) SB(AU) A SB(UK) SB(UK2) B 0,01 SB(NP3) SB(VN) SB(CN) SB(IN) SB(NP1) H×nh Mèi quan hƯ họ hàng nguồn gốc chủng SBV Việt Nam (SB (VN)) chủng giới liệt kê bảng 1, qua phân tích thành phần nucleotit chơng trình MEGA2.1 Ghi chú: Chủng Việt Nam (SB(VN)) đợc bôi đậm; Nhóm A: nhóm chủng châu âu; Nhóm B: nhóm chủng châu Hệ số tiến hóa đợc tính 0,01 40 SB(GER4) Axit amin SB(GER5) SB(GER3) SB(GER1) SB(GER7) SB(GER2) SB(GER6) SB(AU) SB(GER8) SB(NP3) A SB(UK) SB(UK2) SB(IN) B SB(NP1) SB(VN) SB(CN) 0,01 Hình Mối quan hệ họ hàng nguồn gèc cđa c¸c chđng SBV cđa ViƯt Nam (SB (VN)) chủng giới liệt kê bảng 1, qua phân tích thành phần axit amin chơng trình MEGA2.1 Ghi chú: Chủng Việt Nam (SB(VN)) đợc bôi đậm; Nhóm A: nhóm chủng châu âu; Nhóm B: nhóm chủng châu Hệ số tiến hóa đợc tính 0,01 gốc Sơ đồ mối quan hệ chủng đợc thể hai hình Các chủng phân tích phả hệ dựa vào thành phần cho kết nh nhau, chủng đợc phân bố nhóm, nhóm A bao gồm chủng cã ngn gèc ch©u ©u (trõ chđng SB(NP3)); nhãm B bao gồm chủng có nguồn gốc châu á, kể chủng SB(VN) phân lập Việt Nam (hình 2) Chủng SBV phân lập Việt Nam có thành phần nucleotit axit amin tơng đồng với chủng có nguồn gốc Trung Quốc (bảng 2) phân tích ph¶ hƯ còng cho thÊy chóng cã quan hƯ hä hàng gần Tuy nằm nhóm B (có nguồn gốc châu á) nhng chủng ấn Độ (SB(IN)) Nêpan (SB(NP1)) có xu hớng xa với chủng Việt Nam Trung Quốc Tất chủng SBV châu đợc phân lập từ loài ong Apis cerana Trong nhóm A chủng có nguồn gốc châu âu, chủng phân lập Đức đứng gần chủng Anh (UK UK2) hợp thành nhóm phụ Tuy nhiên, có chủng châu phân lập Nêpan (chủng SB(NP3)) lại nhóm họp với chủng châu âu Theo Grabensteiner cs (2001), chủng đợc phân lập đàn ong nhập từ châu âu vào (thuộc loài ong A mellifera) Rõ ràng, phân lập vị trí địa lý (Nêpan), nhng chủng SB(NP3) gây bệnh loài ong ngoại A mellifera có quan hệ phả hệ với SBV gây bệnh ong châu âu hoàn toàn khác quan hƯ hä hµng víi chđng SB(NP1) lµ mét chđng SBV gây bệnh loài ong nội A cerana Nªpan HiƯn nay, ë ViƯt Nam cã nhiỊu gièng ong đợc nuôi, trớc hết phải kể đến giống ong nội A cerana phổ biến giống ong ngoại có nguồn gốc từ Italia A mellifera ligustica đợc nhập vào Việt Nam từ 30 năm Liệu ViƯt Nam cã tån t¹i mét chđng SBV ngo¹i nh− chủng SB(NP3) Nêpan hay không vấn 41 đề cần nghiên cứu Chúng thu thập phân tích chủng SBV phân lập đàn ong ngoại nuôi Việt Nam để có liệu tìm hiĨu vỊ ngn gèc vµ quan hƯ hä hµng cđa chóng III kÕt ln Virót g©y bƯnh “Êu trïng ong dạng túi hay gọi bệnh nhộng bọc (sacbrood) Việt Nam hoàn toàn thuộc nhóm phả hệ với chủng SBV châu Phân tích phả hệ hai liệu nucleotit axit amin cho kết chủng SBV Việt Nam có quan hệ họ hàng gần với chủng Trung Quốc, ấn Độ Nêpan (chủng SB(NP1)) Các chủng SBV châu có quan hệ nguồn gốc họ hàng hoàn toàn xa với chủng SBV châu âu chủng SBV châu SBV gây bệnh loài ong nội (ong châu á) A cerana, chủng châu âu gây bệnh loài ong ngoại (ong châu âu) A mellifera Cần phân lập thêm nhiều chủng SBV khác, đại diện cho vùng địa lý nớc, đại diện loài ong mật đợc nuôi nớc ta, nhằm thực xác định di truyền quần thể SBV gây bệnh "nhộng bọc" Việt Nam Tài liệu tham khảo Bailey L., 1968: Annu Rev Entomol., 13: 191-212 Bailey L., 1976: Adv Virus Res., 20: 271304 Bailey L and Fernando E F W., 1972: Ann Appl Biol., 72: 27-35 Bailey L., Carpenter J M and Woods R D., 1982: J Invertebr Pathol., 39: 264-5 Bailey L., Gibbs A J and Woods R D., 1964: Virology, 23: 425-429 Chomczynski P and Sacchi N., 1987: Anal Biochem., 162(1): 156-159 Ghosh R C et al., 1999: J Gen Virol., 80: 1514-1549 Grabensteiner E et al., 2001: Clin Diagn Lab Immunol., 8(1): 93-104 Sambrook J and Russell D., 2001: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Cold Springs Harbor Press, Cold Springs Harbor N Y 10 White G F., 1917: Sacbrood U S Dep Agric Bull 431: 1-55 PRELIMINARY STUDIES ON THE ORIGIN AND THE PHYLOGENETIC RELATEDNESS OF THE SACBROOD VIRUS ISOLATED IN VIETNAM Le Thanh Hoa, Pham Viet Lien SUMMARY The 818 nucleotides sequence of a sacbrood virus (SBV) strain isolated from Vietnam was obtained by RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), cloned into a TA-vector (Invitrogen Inc.) and sequenced This sequence was phylogenetically analyzed with the representative corresponding SBV sequences of asian and european origins Using MEGA2.1 program (Molecular Evolution Genetics Analysis version 2.1), the phylogenetic relatedness and molecular evolutionary analyses of the SBV strains were established Both nucleotide and amino acid phylogenetic analysis indicated that all the SBV strains of the asian origin fall into one group being completely separated from the another group of those of the european origin The vietnamese SBV strain closely clustered with those of the mainland China and India and a SBV strain of Nepal (SB (NP1)) These SBV strains were isolated from the infected Apis cerana honeybee All the european SBV strains performed a distinct group completely different from the asian SBV strains, except one SBV strain isolated from Nepal (SB (NP3)) These are due to the SBV strains isolated from the infected Apis mellifera honeybee Phylogenetic analysis revealed that the vietnamese SBV strain was of geographically asian origin, having close biogeographic relatedness with those of mainland China and the neighbouring countries Ngµy nhËn bµi: 23-1-2004 42 ... phân lập đàn ong ngoại nuôi Việt Nam để có liệu tìm hiểu nguồn gèc vµ quan hƯ hä hµng cđa chóng III kÕt luận Virút gây bệnh ấu trùng ong dạng túi hay gọi bệnh nhộng bọc (sacbrood) Việt Nam hoàn toàn... đàn ong nhập từ châu âu vào (thuộc loài ong A mellifera) Rõ ràng, phân lập vị trí địa lý (Nêpan), nhng chủng SB(NP3) gây bệnh loài ong ngoại A mellifera có quan hệ phả hệ với SBV gây bệnh ong. .. SBV châu có quan hệ nguồn gốc họ hàng hoàn toàn xa với chủng SBV châu âu chủng SBV châu SBV gây bệnh loài ong nội (ong châu á) A cerana, chủng châu âu gây bệnh loài ong ngoại (ong châu âu) A mellifera