Bước đầu chuyển gen Bt vào cây mía (Saccharum officinarum L.)

bước đầu chuyển gen bt vào cây mía Nhóm sâu đục thân là một trong những loài sâu hại làm giảm năng suất đáng kể cho mía. Việc phun thuốc bảo vệ mía gặp một số trở ngại do mật độ mía ở ruộng rất dày, lá mía sắc và sâu đục thân lại sống bên trong thân mía. Chuyển gen kháng sâu (Bt- tổng hợp) cry1Ab và cry1B-cry1Ab (gen lai) vào hai giống mía VN 84 4137 và Suphanbury 7 nhằm mong muốn tạo ra các giống mía có khả năng kháng sâu hiệu quả, chủ yếu là sâu đục thân. Hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp các plasmid mang gen cry1Ab và gen cry1B-cry1Ab dùng để chuyển gen vào thực vật. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy mô mía cho thấy, khi nuôi cấy tạo mô sẹo từ mảnh lá non ở lõi ngọn mía ex vitro, tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất của giống VN84 4137 trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 3 mg/l là 93,33%, trong khi của giống Suphanbury 7 ở nồng độ 2 mg/l là 96,67%. Tỉ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất trên môi trường có tổ hợp BAP 2 mg/l và NAA 1 mg/l là 100% ở cả hai giống. Bước đầu chuyển gen cry1Ab và cry1Bcry1Ab gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mía đã thu được các khối mô sẹo có biểu hiện GUS và kháng chất chọn lọc phosphinothricin ở nồng độ 3 mg/l, là nồng độ gây chết khi khảo sát khả năng chống chịu phosphinothricin ở mô sẹo không chuyển gen

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 BƯỚC ĐẦU CHUYỂN GEN Bt VÀO CÂY MÍA (Saccharum officinarum L.) Phan Tường Lộc*, Hoàng Văn Dương, Mai Trường, Lê Tấn Đức, Trần Thị Ngọc Hà, Văn Đắc Thành, Phạm Đức Trí, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Hữu Hổ Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, (*)locphan@itb.ac.vn TĨM TẮT: Nhóm sâu đục thân lồi sâu hại làm giảm suất đáng kể cho mía Việc phun thuốc bảo vệ mía gặp số trở ngại mật độ mía ruộng dày, mía sắc sâu đục thân lại sống bên thân mía Chuyển gen kháng sâu (Bt- tổng hợp) cry1Ab cry1B-cry1Ab (gen lai) vào hai giống mía VN 84 4137 Suphanbury nhằm mong muốn tạo giống mía có khả kháng sâu hiệu quả, chủ yếu sâu đục thân Hai dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens biến nạp plasmid mang gen cry1Ab gen cry1B-cry1Ab dùng để chuyển gen vào thực vật Khảo sát điều kiện ni cấy mơ mía cho thấy, nuôi cấy tạo mô sẹo từ mảnh non lõi mía ex vitro, tỉ lệ tạo mô sẹo cao giống VN84 4137 môi trường có 2,4-D nồng độ mg/l 93,33%, giống Suphanbury nồng độ mg/l 96,67% Tỉ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao mơi trường có tổ hợp BAP mg/l NAA mg/l 100% hai giống Bước đầu chuyển gen cry1Ab cry1Bcry1Ab gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào mía thu khối mơ sẹo có biểu GUS kháng chất chọn lọc phosphinothricin nồng độ mg/l, nồng độ gây chết khảo sát khả chống chịu phosphinothricin mơ sẹo khơng chuyển gen Từ khóa: Agrobacterium tumefaciens, Bt, chuyển gen, sâu đục thân mía MỞ ĐẦU Hơn thập niên qua, ngành mía đường Việt Nam ln gặp khó khăn nguồn ngun liệu mía cung cấp khơng đủ để sản xuất Với nhu cầu ngày tăng, theo dự kiến ngành, đến năm 2020 nước đạt mức tiêu thụ đường triệu tấn/năm [25], việc bảo đảm sản lượng mía đáp ứng đủ ổn định cho sản xuất vấn đề cần thiết Một nguyên nhân làm giảm sản lượng mía sâu hại, đó, nhóm sâu đục thân thuộc Cánh vảy (Lepidoptera) gây thiệt hại lên đến 30% [14, 24] Ứng dụng chuyển gen Bt giải pháp tiềm để tạo giống mía có khả kháng loại sâu đục thân [3, 9, 18, 21], mà tập tính sống chúng thường gây khó khăn cho việc xử lý hóa chất [14] Độc tố kháng côn trùng từ Bacillus thuringiensis (Bt) độc tố crystal viết tắt Cry gen cry mã hóa [20] Độc tố Cry phân loại dựa sở đồng dạng trình tự amino acid tiền độc tố Các protein tiền độc tố với 45% đồng trình tự có hệ số khác dãy phân hạng (ví dụ Cry1, Cry2) mức 78% 95% đồng dạng thiết lập ranh giới cho dãy phân hạng thứ hai thứ ba (ví dụ Cry1Ab) 170 [12] Tính đặc hiệu hoạt tính độc tố Cry kết tương tác ly giải tiền độc tố bên hệ thống tiêu hóa lồi côn trùng cụ thể [12] Do biến nạp vào thực vật dùng gen cry đơn, nguyên cho biểu độc tố không cao giai đoạn ban đầu, nghiên cứu chuyển gen Bt có cải tiến giai đoạn sau Các gen cry tổng hợp có nhiều thay đổi trình tự so với ngun bản, giảm thành phần A, T, tăng tỷ lệ C + G, để thích hợp biểu cao thực vật [5, 9]; áp dụng mơ hình hiệu quy tụ (pyramiding) để tạo hiệu kháng sâu cao lai gen cry có tác động khác lại đồng chuyển vào thực vật [9] Theo cơng bố, gen cry1Ab có tính kháng chủ yếu với côn trùng thuộc Lepidoptera [1, 2, 6, 12] cry1B có tính kháng kép Lepidoptera Coleoptera [5, 12] Protein lai Cry1B-Cry1Ab tạo hiệu ứng kháng hiệu Lepidoptera Coleoptera [4] PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Giống mía: Hai giống mía dùng để chuyển gen Suphanbury (Thái Lan) VN84 4137 (Việt Nam), cung cấp Phan Tuong Loc et al Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Mía Đường, xã Phú An, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dương Chủng vi khuẩn: Chủng vi khuẩn E coli mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab chủng E coli DH5α Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 có mang sẵn helper plasmid chứa gen vir gen kháng kháng sinh rifampicin Plasmid: Plasmid pCRY1B-1Ab, kích thước khoảng 17 kb, mang tổ hợp gen Pubi/cry1Bcry1Ab/Tnos (cry1B-cry1Ab: gen lai - tổng hợp) gen chọn lọc P70S/bar/T35S T-DNA A B KaR LB LB T35S bar T35S bar P35S P70S PUbi biểu thực vật, gen nptII kháng kanamycin biểu vi khuẩn Gen bar quy định tính kháng phosphinothricin (PPT) dùng để chọn lọc đối tượng chuyển gen (hình 1A) Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab, có kích thước 15,6 kb, từ plasmid pCAMBIA3301 chèn thêm tổ hợp gene Pubi-1/cry1Ab/Tnos TDNA (Pubi : maize ubiquitin-1 (Ubi-1) promoter, Tnos: nopaline synthase (NOS) terminator, cry1Ab: gen tổng hợp) (hình 1B) Các gen cry1Ab, cry1B-cry1Ab có nguồn gốc từ Altosaar I (Canada), chương trình trao đổi khoa học cry1Ab Tnos cry1Ab Tnos cry1B P35S 5'UTR Ubi gus Tnos PUbi RB RB KaR Hình Sơ đồ plasmid A Plasmid pCRY1B-1Ab; B Plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab Môi trường Môi trường nuôi cấy vi khuẩn gồm môi trường LB (Luria-Bertani) dùng nuôi cấy giữ giống E coli Agrobacterium tumefaciens; môi trường AB (Chilton) dùng để chuyển gen Môi trường nuôi cấy thực vật gồm mơi trường khống MS, vitamin MS, vitamin B5, đường 30 g/l, pH 5,8; chất điều hòa sinh trưởng BAP, NAA Phương pháp Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E coli xung điện Biến nạp thực xung điện máy BTX ECM 830 2500 V, 40 uF, ms, cuvette mm Vi khuẩn sau biến nạp chọn lọc môi trường LB có bổ sung kanamycin 100 mg/l ly trích plasmid để kiểm tra đặc điểm, kích thước enzyme cắt giới hạn HindIII [8, 15] Biến nạp plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Biến nạp thực phương pháp CaCl2 nhiệt Vi khuẩn sau biến nạp cấy chọn lọc mơi trường có bổ sung rifampicin 100 mg/l kanamycin 100 mg/l Theo dõi kết sau 24-48 [10, 11, 16] Kiểm tra diện gen cry1Ab gen cry1B-cry1Ab phương pháp PCR Đối với gen cry1Ab, trình tự mồi xuôi (F): 5’-TTC CT T GGA CGA AAT CCC ACC3’ mồi ngược (R): 5’-GCC AGA ATT GAA CAC ATG AGC GC-3’ kích thước đoạn khuếch đại tương ứng 559 bp Đối với gen cry1B-cry1Ab, trình tự mồi xuôi (F): 5’-GAT AGC AGG ACC TAT CCA AT-3’ mồi ngược (R): 5’-GCC GAA GAG GGA GGC GTC AA-3’, kích thước đoạn khuếch đại tương ứng 0,5 kb Chương trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/4 phút (94oC/30 giây, 50-54oC/1 phút, 72oC/30-90 giây), 72oC/10 phút, với 35 chu kỳ Hỗn hợp thành phần phản ứng PCR gồm có l buffer PCR 5X, 0,5 l dNTP 10 mM, 0,25 l taq polymerase U/l, l mồi xuôi M, l mồi ngược M, l DNA plasmid, thêm nước cất đủ thể tích 25 l [7] Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D lên q trình tạo mơ sẹo từ non Phần lõi non bên mía, thường tình trạng vơ trùng, cắt thành khoanh dày mm tách lớp để nuôi cấy môi trường tạo mô sẹo gồm thành phần khoáng MS, vitamin MS, casein 0,5 g/l agar 10 g/l, có bổ sung 2,4-D nồng độ khác 171 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 (0; 1; 2; 3; mg/l) để đánh giá ảnh hưởng 2,4-D lên q trình tạo mơ sẹo mẫu [19] Khảo sát ảnh hưởng BAP NAA lên q trình tái sinh chồi từ mơ sẹo Mơ sẹo sau thời gian nuôi cho tái sinh chồi mơi trường có thành phần khống MS, vitamin B5, bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP (1; mg/l) NAA (0,2; 0,5; mg/l) [23] Khảo sát ảnh hưởng chất chọn lọc PPT lên phát triển mô sẹo, in vitro Nuôi cấy tạo mô sẹo nuôi cấy môi trường có bổ sung PPT nồng độ khác (0; 1; 2; 3; 4; mg/l) vào môi trường, để đánh giá ảnh hưởng PPT lên phát triển mô sẹo [13] Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chọn lọc mô chuyển gen Vi khuẩn A tumefaciens nuôi cấy lắc qua đêm 28oC môi trường LB có bổ sung kháng sinh kanamycin 100 mg/l rifampicin 50 mg/l, sau đó, ly tâm lấy sinh khối 4000 g, phút chuyển sang nuôi môi trường AB điều kiện có bổ sung thêm acetocyringone 200 M Mô sẹo để khô bớt độ ẩm tủ cấy vô trùng khoảng 30 phút, ngâm 10 phút dịch vi khuẩn điều kiện áp suất thường, sau đưa vào điệu kiện chân không 50 kPa phút đưa trở lại môi trường áp suất thường phút, trước mang thấm khô chuyển sang ủ chung với vi khuẩn môi trường tạo mô sẹo, khoảng 2-3 ngày Mơ sẹo sau rửa dung dịch kháng sinh cefotaxime 500 mg/l để diệt khuẩn Agrobacterium tumefaciens, chuyển sang chọn lọc mô chuyển gen mơi trường tạo mơ sẹo, có bổ sung cefotaxime nồng độ 500 mg/l PPT nồng độ ngưỡng gây chết [17] Khảo sát biểu gen thị gus kỹ thuật hóa mơ [13] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biến nạp tạo chủng vi khuẩn E coli chứa vector plasmid pCRY1B-1Ab 172 Để lưu giữ nhân bản, plasmid pCRY1B-1Ab biến nạp vào dòng E coli DH5 phương pháp xung điện Vi khuẩn sau chuyển gen cấy trải để chọn lọc mơi trường LB rắn có bổ sung kanamycin 100 mg/l Sau ngày, nhận khoảng 70 khuẩn lạc mọc đĩa petri nuôi cấy, giả định biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab, đĩa đối chứng nuôi cấy vi khuẩn E coli DH5 không biến nạp, khơng có khuẩn lạc xuất Các khuẩn lạc giả định biến nạp plasmid chọn ni cấy mơi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 100 mg/l để tách plasmid phân tích Plasmid sau tách chiết, cắt enzyme giới hạn HindIII điện di kiểm tra gel agarose, cho thấy có băng DNA 17 kb phù hợp với kích thước plasmid pCRY1B-1Ab chứng tỏ dòng E coli DH5 biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab (hình 2) L 17 kb Hình Kiểm tra plasmid cry1B-cry1Ab sau biến nạp vào dòng vi khuẩn E.coli DH5 L Thang chuẩn DNA -HindIII; Plasmid kiểm tra cắt enzyme HindIII có kích thước khoảng 17 kb Biến nạp tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid pCAMBIA3301cry1Ab dòngvi khuẩn A tumefaciens mang plasmid pCRY1B-1Ab Hai dòng E coli mang plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab pCRY1B-1Ab nhân lên tách plasmid Biến nạp plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab pCRY1B-1Ab vào Phan Tuong Loc et al vi khuẩn Agrobacterium tumefacien EHA 105 thực phương pháp xử lý nhiệt với CaCl2 Vi khuẩn sau biến nạp cấy chọn lọc mơi trường LB rắn có bổ sung kanamycin 100 mg/l rifampicin 100 mg/l (hệ thống binary vector) 28oC Sau ngày, đĩa nuôi cấy xuất khoảng 20 khuẩn lạc Agrobacterium tumefaciens EHA 105 giả định biến nạp plasmid Tách khuẩn lạc kiểm tra có mặt gen cry1Ab cry1B-cry1Ab cấu trúc phương pháp PCR với mồi đặc hiệu Kết biểu gel agarose với marker kb cho thấy, dòng A tumefaciens biến nạp plasmid pCAMBIA-Cry1Ab dòng A tumefaciens biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab, sản phẩm PCR từ plasmid tách có băng khuếch đại gen cry1Ab giống với đối chứng dương (được khuếch đại từ pCAMBIA3301-cry1Ab E coli), phù hợp với trình tự mục tiêu 559 bp (hình 3) Trong dòng A tumefaciens biến nạp pCRY1B-1Ab có thêm băng khuếch đại trình tự đặc hiệu đoạn DNA cry1B-cry1Ab giống với đối chứng dương (được khuếch đại từ pCRY1B-1Ab E coli) phù hợp với trình tự mục tiêu khoảng 0,5 kb (hình 4) L PC H2O 500 bp Hình Kết kiểm tra PCR diện gen cry1Ab plasmid vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens L Thang chuẩn DNA kb; PC Băng DNA 559 bp khuếch đại từ vi khuẩn E coli mang pCAMBIA3301-cry1Ab; Băng DNA 559 bp khuếch đại từ vi khuẩn A tumefaciens biến nạp pCAMBIA3301-cry1Ab; Băng DNA 559 bp khuếch đại từ vi khuẩn A tumefaciens biến nạp pCRY1B1Ab L PC H2O 559 bp Hình Kết kiểm tra PCR diện gen cry1B-cry1Ab plasmid vi khuẩn A tumefaciens PCR L Thang chuẩn DNA kb; PC Băng DNA 0,5 Kb khuếch đại từ vi khuẩn E coli mang pCRY1BAb; Băng DNA 0,5 Kb khuếch đại từ vi khuẩn A tumefaciens biến nạp pCRY1B-1Ab Như vậy, dòng vi khuẩn A tumefaciens EHA 105 biến nạp plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab dòng vi khuẩn A tumefaciens EHA 105 biến nạp plasmid pCRY1B-1Ab thực thành cơng dùng để chuyển gen vào thực vật Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D lên trình tạo mơ sẹo mơ Mơ non mía ni cấy mơi trường tạo mơ sẹo có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D nồng độ khác Mơ sẹo bắt đầu hình thành sau 12 ngày mép mô Mô sẹo giống Suphanbury mềm ướt giai đoạn đầu, màu sắc khối mô vàng nhạt so với giống VN84 4137 (hình 5) Sau 28 ngày, tỉ lệ mơ sẹo hình thành khác biệt rõ rệt công thức Công thức với nồng độ 2,4-D mg/l cho tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao giống VN84 4137 2,4-D mg/l giống Suphanbury (bảng 1) Tiếp tục nuôi cấy khoảng 1,5 tháng, mô sẹo phát triển thành khối mô chắc, có bề mặt căng láng (hình 6) 173 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 Bảng Kết tạo mô sẹo giống VN84 4137 giống Suphanbury mơi trường MS có bổ sung nồng độ 2,4-D khác Cơng thức thí nghiệm 2,4-D (mg/l) Tỷ lệ mẫu hình thành mơ sẹo giống VN84 4137 (%) 0a 40 b 76,67 c 93,33 d 63,33 e Tỷ lệ mẫu hình thành mơ sẹo giống Suphanbury (%) a 76,66 bd 96,67 c 80 bd 66,67 bde Các giá trị trung bình khơng theo nhóm có mẫu chữ giống có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê LSD Giống VN84 4137 Giống Suphanbury Hình Khối mơ sẹo phát sinh từ mơ non mía sau khoảng 20 ngày ni cấy Các khối mô mang tái sinh mơi trường MS có bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP NAA khác Sau tuần, chồi có dấu hiệu hình thành Số liệu lấy công thức đạt tỷ lệ tạo chồi tuyệt đối sau 21 ngày Kết kiểm tra ngày 21 cho thấy, Hình Mơ sẹo phát triển hình thành khối tế bào có khả tái sinh công thức gồm tổ hợp NAA mg/l BAP mg/l có 100% mẫu tạo chồi hai giống mía, số lượng chồi mẫu nhiều, chồi có hình dạng bình thường Các cơng thức khác hình thành chồi chậm hơn, số lượng chồi có hình dạng khơng đồng khối mô dị dạng (bảng 2, hình 7) Bảng Kết tái sinh chồi giống mía VN84 4137 giống Suphanbury mơi trường MS có bổ sung tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP NAA khác Cơng Tỷ lệ mơ sẹo hình thành chồi Tỷ lệ mơ sẹo hình thành chồi BAP NAA thức nghiệm thức giống nghiệm thức giống (mg/l) (mg/l) TN VN84 4137 (%) Suphanbury (%) 0 13,33 a a 0,2 80,00 cd 60,00 c 0,5 86,67 de 73,33 cd 1 53,33 b 40,00 b 0,2 80,00 cd 80,00 d 0,5 66,67 bc 86,67 de 100 e 100 e Các giá trị trung bình khơng theo nhóm có mẫu chữ giống có khác biệt có ý nghĩa thống kê mức p = 0,01 dựa theo kiểm định thống kê Duncan 174 Phan Tuong Loc et al VN84 4137 Suphanbury Hình Chồi giống VN84 4137 Suphanbury hình thành từ mơ sẹo mơi trường có tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng BAP mg/l NAA mg/l Nghiên cứu ảnh hưởng PPT lên khả phát triển mô sẹo, in vitro Mô sẹo sau tháng nuôi cấy hai giống mía VN84 4137 Suphanbury chuyển sang mơi trường có bổ sung PPT nồng khác Từ nồng độ mg/l khối mô sẹo bắt đầu chuyển sang màu vàng đậm tích tụ ammonia sau tuần Ở nồng độ mg/l tất mơ sẹo hóa nâu đen chết VN84 4137 hai giống mía sau tháng, nồng độ cao thời gian chết khoảng 12 tuần (hình 8) Các mía in vitro hai giống mía VN84 4137 Suphanbury nuôi cấy môi trường MS có bổ sung PPT nồng độ khác Sau 10 ngày, nồng độ PPT từ mg/l, vàng chết dần (hình 9) Suphanbury Hình Ảnh hưởng PPT nồng độ mg/l gây chết mơ sẹo PPT mg/l PPT mg/l Hình Ảnh hưởng PPT nồng độ khác phát triển mía VN84 4137 in vitro 175 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 Bước đầu chuyển gen mơ sẹo mía thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mơ sẹo mía sau tháng ni cấy mơi trường có 2,4-D mg/l cho giống VN84 4137 mg/l cho giống Suphanbury có hình thái đồng xử lý chuyển gen với hai dòng vi khuẩn A.tumefaciens mang plamid pCAMBIA3301-cry1Ab pCRY1B-1Ab Các mô sẹo tiếp tục nuôi cấy chọn lọc mơi trường tạo mơ sẹo có bổ sung PPT mg/l Sau VN84 4137 tuần chuyển gen, nhuộm sơ số cụm mô chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301cry1Ab dung dịch X-Gluc thu mơ có màu xanh dương đậm đặc trưng, giả định mô chuyển gen có biểu GUS (hình 10) Sau tuần hầu hết mơ sẹo nâu hóa chết, số cụm mơ nhỏ có khả sống PPT nồng độ mg/l tiếp tục phát triển mô Số lượng mô kháng PPT mg/l khoảng từ 2-4% mẫu chuyển gen (bảng 3, hình 11) Suphanbury Hình 10 Mơ sẹo chuyển gen plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab biểu gen gus nhuộm dung dịch X-Gluc Giống VN84 4137 pCAMBIA3301-cry1Ab Giống Suphanbury pCRY1B-1Ab Giống Suphanbury pCAMBIA3301-cry1Ab Giống VN84 4137 pCRY1B-1Ab Hình 11 Mơ sẹo chuyển gen chọn lọc môi trường tạo mô sẹo 176 Phan Tuong Loc et al Bảng Tỷ lệ mô sẹo phát triển môi trường chọn lọc PPT mg/l sau tuần chuyển gen Giống VN84 4137 Giống Suphanbury pCAMBIA3301-cry1Ab 2% 4% Thảo luận Suphanbury VN84 4137 hai giống mía có suất hàm lượng đường cao, CCS 11% trồng nhiều vùng ngun liệu mía Việc thích hợp ni cấy in vitro, làm sở cho ứng dụng công nghệ sinh học hai giống mía này, mang ý nghĩa thực tiễn cao Mô non tạo mô sẹo 93,33-96,67% môi trường có bổ sung 2,4-D nồng độ 2-3 mg/l tương tự với nghiên cứu số tác giả trước [2, 19, 23], mẫu mô sẹo tái sinh chồi đạt tỉ lệ 100% mơi trường có bổ sung BAP mg/l NAA mg/l điều kiện thuận lợi để ứng dụng chuyển gen Mô sẹo mía nhạy cảm với PPT, chất chọn lọc mạnh, bị ức chế sinh trưởng chết nồng độ mg/l, Điều giúp khả chọn lọc cao, nhiên, khó nhân mơ tái sinh q trình chọn lọc Các dòng Agrobacterium tumefaciens sau biến nạp plasmid pCAMBIA3301cry1Ab pCRY1B-1Ab dùng để chuyển gen vào hai giống mía Kết bước đầu nhận mô sẹo biểu GUS hai giống mía chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301cry1Ab mơ sẹo chuyển gen từ hai plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab pCRY1B1Ab có khả chống chịu tiếp tục phát triển mơi trường có bổ sung PPT mg/l, điều cho thấy, biến nạp gen từ Agrobacterium vào mô sẹo mía thực Các mơ sẹo chuyển gen tiếp tục chọn lọc cho tái sinh thành hoàn chỉnh KẾT LUẬN Tạo hai chủng Agrobacterium tumefaciens dùng để chuyển gen mía, gồm chủng chứa plasmid pCRY1B-1Ab chủng chứa plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab Xác định nồng độ 2,4-D thích hợp pCRY1B-1Ab 3% 3% cảm ứng tạo mơ sẹo giống mía VN84 4137 mg/l, Suphanbury mg/l Tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng cho tỉ lệ tái sinh chồi 100% từ mơ sẹo hai giống mía VN84 4137 Suphanbury cao BAP mg/l, NAA mg/l Xác định nồng độ PPT gây chết mô sẹo dùng làm nồng độ bắt đầu chọn lọc đối tượng chuyển gen điều kiện in vitro mg/l Bước đầu thu 2-4% mơ sẹo chuyển gen giả định có biểu gen gus phát triển tốt môi trường chọn lọc với PPT mg/l Các mô chuyển gen giả định tiếp tục chọn lọc môi trường có bổ sung PPT nồng độ cao (5 mg/l) để chọn lọc mô tái sinh Cây chuyển gen phân tích kỹ thuật sinh học phân tử để xác định đặc điểm di truyền biểu gen Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học Công nghệ, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam hỗ trợ kinh phí cho cơng trình TÀI LIỆU THAM KHẢO Arvinth S., Selvakesavan R K., Subramonian N., Premachandran M N., 2009 Transmission and expression of transgenes in progeny of sugarcane clones with cry1Ab and aprotinin genes, Sug Tech, 11(3): 290-295 Arvinth S., Arun S., Selvakesavan R K., Srikanth J., Mukunthan N., Ananda Kumar P., Premachandran M N., Subramonian N., 2010 Genetic transformation and pyramiding of aprotinin-expressing sugarcane with cry1Ab for shoot borer (Chilo infuscatellus) resistance, Plant Cell Rep., 29: 383-395 Arencibia A D., Vaquez R I., Prieto D., Tellez P., Carmona E R., Coego A., Hernandez L., de La Riva G A., Housein G 177 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 170-179 S., 1997 Transgenic sugarcane plants resistant to stem borer attack Mol Breed, 3: 247-255 Bano-Maqbool S., Riazuddin S., Loc N T., Gatehouse A M R., Gatehouse J A., Christou P., 2001 Expression of multiple insecticidal genes confers broad resistance against a range of different rice pests Mol Breed, 7: 85-93 Bohorova N., Frutos R., Royer M., Estanol P., Pacheco M., Rascon Q., Mclean S., Hoisington D., 2001 Novel synthetic Bacillus thuringiensis cry1B gene and the cry1B-cry1Ab translational fusion confer resistance to southwestern corn borer, sugarcane borer and fall armyworm in transgenic tropical maize Theor Appl Genet., 103: 817-826 Braga D P V., Arrigoni E D P., SilviaFilho M C., Ulian E C., 2003 Expression of the Cry1Ab protein in genetically modified sugarcane for the control of Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae) J New Seeds, 5: 209-222 Casali N., Preston A., 2003 Methods in molecular Biology E.coli plasmid vector Methods and applications, Humana Press, 235: 316 Chassy B.M and Flickinger J.L., 1987 Transformation of Lacobacillus casei by electroporation FEMS Microbiol Lett, 44: 173-177 Christou P., Capell T., Kohli A., Gatehouse J A., Gatehouse A M R., 2006 Recent developments and future prospects in insect pest control in transgenic crops TRENDS in Plant Science, 11(6): 302-308 10 Cohen S N., Chang A C Y., Hsu L., 1972 Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA Proc Natl Acad Sci USA, 69: 2110-2114 11 Dagert M., Erlich S D., 1979 Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells Gene, 6: 23-28 12 de Maagd R A., Bravo A., Crickmore N., 178 2001 How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world TRENDS in Genetics, 17(4): 193-199 13 Enriquez-Obregon G A., 1998 Herbicideresistant sugarcane (Saccharum offcinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation Planta, 206: 20-27 14 Fauconnier R., 1993 Sugar Macmillan Press Ltd, London, UK cane, 15 Fiedler S., Wirth R., 1988 Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation Anal Biochem., 170: 3844 16 Hanahan D., 1983 Studies on the transformation of Escherichia coli with plasmids J Mol Biol., 166: 557-580 17 Joyce P., Kuwahata M., Turner N., Lakshmanan P., 2010 Selection system and co-cultivation medium are important determinants of Agrobacterium-mediated transformation of sugarcane Plant Cell Rep., 29: 173-183 18 Kim S., Kim C., Li W., Kim T., Li Y., Zaidi M A., Altosaar I., 2008 Inheritance and field performance of transgenic Korean Bt rice lines resistant to rice yellow stem borer Euphytica, 164: 829-839 19 Rashid H., Khan S A., Zia M., Chaudhary M F., Hanif Z., Chaudary Z., 2009 Callus induction and regeneration in elite sugarcane cultivar hsf-240 Pak J Bot., 41(4): 1645-1649 20 Schnepf H E., Crickmore N., Van Rie N., Dereclus J., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D H., 1998 Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins Microbiol Mol Biol Rev., 62: 775-806 21 Valderrama A M., Velasquez N., Rodriguez E., Zapata A., Zaidi M A., Altosaar I., Arango R., 2007 Resistance to Tecia solanivora (Lepidoptera : Gelechiidae) in three transgenic Andean varieties of potato expressing Bacillus thuringiensis Cry1Ac protein J Econ Entomol., 100: 172-179 Phan Tuong Loc et al 22 Weng L X., Deng H., Xu J L., Wang L H., Jiang Z., Zhang H B., Li Q., Zhang L H., 2006 Regeneration of sugarcane elite breeding lines and engineering of stem borer resistance Pest Manage Sci., 62:178-187 23 Xu L P., Que Y X., Xu J S., Fang S R., Zhang M Q., Chen Y Q., Chen R K., 2008 Establishment of genetic transformation system and obtaining transgenic sugarcane (var badila) transformed with RS gene Sugar Tech, 10(2): 128-132 24 Http://www.baodongnai.com.vn/tuvan/2012 04/Phong-tru-sau-benh-hai-mia-2150229/ 25 Http: //www.thesaigontimes.vn/Home/ kinhdoanh/dautu/45285/10-nam-i-ach-1trieu-tan-duong.html PRELIMINARY TRANSFORMATION OF Saccharum officinarum L WITH Bt GENE Phan Tuong Loc, Hoang Van Duong, Mai Truong, Le Tan Duc, Tran Thi Ngoc Ha, Van Dac Thanh, Pham Duc Tri, Nguyen Thi Thanh, Nguyen Huu Ho Institute of Tropcial Biology, VAST SUMMARY Borer is one of the major pests of sugarcane that can cause a loss of crop yield Spraying pesticides for the control of borer faces obstacles because the pest lives inside sugarcane stem and sugarcanes with sharp leaves are planted at high density in fields Transformation of two sugarcane varieties, VN 84 4137 and Suphabury 7, with synthetic Bt genes, cry1Ab and hybrid cry1B-cry1Ab, aims to provide effective resistance against pests, mainly borer Two strains of Agrobacterium tumefaciens were transformed with plasmids containing cry1Ab gene or cry1B-cry1Ab gene for plant transformation Sugarcanes were investigated in vitro conditions of cultivation, which indicated that the highest calli formation from the young leaf rolls was obtained on the medium with mg/l 2,4-D for VN84 4137 at 93.33% and mg/l 2,4-D for Suphanbury at 96.67% The highest number of calli forming shoots was achieved on the medium with the combination of mg/l BAP and mg/l NAA at 100% for two varieties Preliminary Agrobacterium-mediated transformation of sugarcane was obtained with calli expressing GUS and/or resistant to phosphinothricin at mg/l, which was the lethal threshold for wild-type callus and in vitro young plants Keywords: Agrobacterium tumefaciens, Bt, sugarcane, gen-transformation Ngày nhận bài: 21-6-2012 179 ... pCAMBIA3301cry1Ab pCRY1B-1Ab dùng để chuyển gen vào hai giống mía Kết bước đầu nhận mơ sẹo biểu GUS hai giống mía chuyển gen với plasmid pCAMBIA3301cry1Ab mô sẹo chuyển gen từ hai plasmid pCAMBIA3301-cry1Ab... độ bắt đầu chọn lọc đối tượng chuyển gen điều kiện in vitro mg/l Bước đầu thu 2-4% mơ sẹo chuyển gen giả định có biểu gen gus phát triển tốt môi trường chọn lọc với PPT mg/l Các mô chuyển gen giả... biến nạp gen từ Agrobacterium vào mơ sẹo mía thực Các mô sẹo chuyển gen tiếp tục chọn lọc cho tái sinh thành hoàn chỉnh KẾT LUẬN Tạo hai chủng Agrobacterium tumefaciens dùng để chuyển gen mía, gồm