Bài viết trình bày việc khử trùng mẫu và phân lập vi khuẩn, khảo nghiệm khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA, phân lập vi khuẩn nội sinh, đặc tính khuẩn lạc và tế bào.
TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN Số 12 (37) - Tháng 2/2016 Phân lập, xác định đặc tính nhận diện vi khuẩn nội sinh mía (Saccharum Officinarum L.) trồng tỉnh Tây Ninh Isolation, characterization and identification of endophytic bacteria in sugarcane (Saccharum Officinarum L.) cultivated on soils of Tay Ninh province SV Nguyễn Thị Thu Hằng (1) ThS Đặng Thị Ngọc Thanh (2) (1), (2) Trường Đại học Sài Gòn St Nguyen Thi Thu Hang (1) M.S Dang Thi Ngoc Thanh (2) (1), (2) Sai Gon University Tóm tắt T ười a u rễ ười a u h n c y a r ng ại a huy n h u Thành Tr ng àng T n i n c a nh T y Ninh h n c y i òng i hu n n i inh r n i rường G h ng h n n c c òng i hu n hu c c hu n ạc ạng ròn a nguy n n i ch hư c – Đa c c c ạng u ng n h n ng chuy n ng T c c c òng hu c c h n ng c ịnh hòa an n h an inh ng h òng i hu n HT h hi n c a ặc nh n u r n n n c uy n chọn nh n i n ằng hư ng h inh học h n K u gi i r nh ự h ng n h a 16S r N nh i c ữ i u c a N ằng c ng cụ a n ch h y òng HT c ự ng ng 96% i a ry r uca n i ài i hu n c h n ng húc y ng rưởng hực c c Từ khóa: mía, cố định đạm, hòa tan lân, vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh… Abstract Endophytic bacteria in sugarcane plant cultivated on soils of Tay Ninh province were isolated and characterized Sugarcane materials were collected from three districts of this province including Chau Thanh, Trang Bang, and Tan Bien There were 75 bacterial isolates that were isolated in N free medium LGI The majority of their colonies are round-shaped, climy, smooth, colourless or milk-color, with size about 0.5-5.0 mm Cells often have short rod-shape and most of them have motility All of them have ability of nitrogen fixation, and phosphate solubilization together with IAA biosynthesis The best isolate HTR8 was selected to sequencing 16S rRNA gene fragment This isolate showed a high degree of similarity (96%) to reference strain Labrys portucalensis train F11 of the GenBank of NCBI, and one potential Plant Growth Promoting Bacteria has recently been reported Keywords: endophytic bacteria, IAA biosynthesis, nitrogen fixation, phosphate solubilization, Plant Growth Promoting Bacteria 108 Đặt vấn đề Đường giữ vai trò quan trọng kh u ph n n ngày c a c n người Đường c n u a nguy n i u hi n chi h n % ng s n ng ường thô c a tồn th gi i Vi t Nam, mía c tr ng nhiều ịa hư ng Tr ng Tây Ninh t nh có di n tích tr ng mía l n nh t khu vực Đ ng Na Tuy nhiên, t n n n 13 i n tích tr ng mía c a t nh gi m t 25,5 nghìn xu ng 22,3 nghìn (T ng cục th ng kê Vi t Nam, 2015) M t cách hường c sử dụng uy r n ng u t s n ng ng cường bón phân hóa học ch c y ng h n ạm hóa học hường c n ng n c c nư c sử dụng g N/ha/n h ặc th ch n n 400 g N/ha/n (H ang Minh Ta Cao Ngoc Diep, 2014) Bón phân khơng c n i, h p lý gây tình trạng v a th a v a thi u inh ưỡng cho tr ng, gây hi n ng chai cứng, gi phì, thay i tính ch t v t lý, hóa học sinh học c a t tr ng ng thời gây nh hưởng x u n i rường sức khỏ c n người ( hạ V n T n Trư ng H T c, 2004) Do v y ngày u hư ng tìm ki m ch ng vi khu n c ch r ng có vi khu n n i sinh, nhằm ứng dụng c c ch ph m giúp b sung thay th m t ph n phân bón hóa học cho tr ng c trọng Vi khu n n i sinh tr i qua ph n l n òng ời ch Chúng t p trung bên t bào, kho ng gian bào hay h th ng mạch mà không gây b nh b t kỳ h u qu tiêu cực nà i v i ch (Cao Ngọc Đi p, 2011) Nhiều loài vi khu n n i inh ã c phân l p t c y a Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum sp., Pantoea sp., Burkholderia vietnamiensis, B unamae, B silvatlantica … c i hu n có kh n ng húc y ng rưởng thực v t thông ua c c c ch trực ti p hay gián ti c ịnh ạm, hòa tan lân, t ng h p IAA, v.v (Hoang Minh Tam Cao Ngoc Diep, 2014) Nghiên cứu nhằm tìm ki m c u nh n di n dòng vi khu n n i inh c y a c c c ặc tính t Đ y c c dòng vi khu n b n ịa có tiề n ng ứng dụng s n xu t phân bón vi sinh chuyên dùng cho mía c a ịa hư ng Vật liệ 2.1 Khử trùng mẫu phân lập vi khuẩn c u thân rễ c a mía (Saccharum officinarum L.) r ng giai ạn v a tr cờ c thu th p ru ng mía 13 xã thu c huy n Châu Thành, Tr ng Bàng huy n Tân Biên c a t nh Tây Ninh M u c ti n hành khử trùng qua giai ạn c a Hoang Minh Tam Cao Ngoc Diep (2014) v i ng n ng c n n 96º ng hời gian khử m u xác nh n hi u qu khử trùng qua ki nư c rửa cu i r n i rường TYGA (Tryptone Yeast Glucose Agar) M u sau khử trùng bề mặ hành c ng c ti n hành thu l y dịch chi t ch ng vào i rường LGI (Cavalcante Döbereiner, 1988) kh ng n ặc Sau 24 – 48 , xu t hi n c a màng mỏng (pellicle) cách bề mặ i rường – mm chứng tỏ có hi n di n c a vi khu n n i sinh C y ria l p dịch ang i rường G ặc ti p tục c y chuy n ch n hi hu c khu n lạc th t thu n nh ưu rữ, b o qu n c c òng h n p (isolates) theo mô t c a Cao Ngọc Đi p (2011) 2.2 Xác định đặc tính khuẩn lạc tế bào Mơ t ặc i m hình thái khu n lạc 109 t bào theo Cao Ngọc Đi p (2011) Tr n inh Thư c ctv (2001) X c ịnh Gram c a c c òng hu c hư ng h nhu m Gram theo Nguyễn Đức ng ctv (2003) k t h p v i ki m tra nhanh hư ng h “KOH S ring T ” (von Graevenitz Bucher, 1983) 2.3 Khảo nghiệm khả cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA Các dòng mọc r n i rường phân l G h ng c c y chuy n ang i rường NBRIP chứa orthophosphate khó tan Dòng phát tri n c c hai loại i rường chứng tỏ có kh n ng c ịnh ạm hòa tan lân Các dòng ti p tục c nh giá kh n ng ng h p NH4+ môi rường ur ’ ( ar c ) h ng ạm lỏng, kh n ng hòa an n h an r ng i rường NBRIP (Nautiyal, 1999) lỏng ng thời c ịnh kh n ng inh r ng i rường LGI lỏng có b sung 100 mg tryptophan/L h c c hư ng pháp dựa ph n ứng màu k t h m uang c a Hoang Minh Tam Cao Ngoc Diep (2014) 2.4 Định danh dòng có khả cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA tốt Chọn dòng vi khu n c ặc tính t t nh ịnh danh gi i trình tự m t chiều g n 16S rRNA v i m i ng (universal primer) 27F (gửi m u cho Cơng ty Nam Khoa, Tp H Chí Minh) 2.5 Phương pháp xử lý số liệu Dựa hư ng r nh c chu n trị s O c c ịnh ng NH4+, P2O5 ( ng ng) c r ng u Tính toán xử lý th ng kê Microsoft Excel 2010 SPSS 16.0 Sử dụng chư ng r nh a n c a N so sánh trình tự 16S r N gi i v i trình tự c r ng c li u c a GenBank Tìm dòng có ch s ng ng cao, t uy n n ài c a dòng vi khu n uy n chọn Kết thảo luận 3.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh Vi khu n n i sinh có dịch chi t m u c y a trùng bề mặt phát tri n c i rường LGI bán ặc tạo thành màng mỏng c a Perin ctv (2006), Nguyễn Thị Thu Hà ctv (2009) (Hình 1) Sau hi c c y chuy n ang i rường G h ng ạm ặc làm thu n, dòng vi khu n c ti p tục c y ché ang i rường NBRIP ặc chứa orthophosphate K t qu hu c 75 dòng vi khu n có lúc hai kh n ng c ịnh hòa an n.Tr ng có 46 dòng có ngu n g c t rễ mía (61,33%) 29 dòng có ngu n g c t (38,67%) Nhiều tác gi khác nghiên cứu vi khu n n i inh nh n th y s dòng vi khu n n i sinh phân l c t rễ hường nhiều h n i phân l p t thân c y iều ng h m t gi thuy t ngu n g c vùng rễ (rhizophere) c a vi khu n n i sinh (Rosenblueth Martínez-Romero, 2006) Hình Vi khuẩn nội sinh phát triển môi trường LGI bán đặc (B) đối chứng âm gồm dịch chiết từ mẫu mơ mía hấp tiệt trùng (A) 110 3.2 Đặc tính khuẩn lạc tế bào Về hình thái khu n lạc a dòng vi khu n phân l c có dạng tròn (90,67%), s lại có dạng h ng ều (9,33%) Khu n lạc có màu tr ng ục chi m 38,67%, màu tr ng chi m 25,33%, màu tr ng ngà chi m 28% màu vàng nhạt chi m 8% Đa dòng thu c tạo khu n lạc có dạng bìa ngun (92%) n imơ (96%), lại dạng a r ng cưa ( %) n i lài (4%) Đường kính khu n lạc c a dòng thu c nằm kho ng t 0,5 n mm (Hình 2) chi m 56% Gram (+) chi m 44% (Hình 3) K t qu ng ự c c t qu nghiên cứu vi khu n n i sinh m t s m t m h c h (Nguyễn Thị Thu Hà ctv., 2009), loại cỏ ch n nuôi (Cao Ngọc Đi p Nguyễn Ái Chi, 2009), ngô (Dang Thi Ngoc Thanh Cao Ngoc Diep, 2014) vi khu n n i sinh mía tr ng t nh Đ ng Nai (Hoang Minh Tam Cao Ngoc Diep, 2014) Hình Kết nhuộm Gram số dòng vi khuẩn nội sinh 3.3 Khả cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA B ng au y r nh ày ề ngu n g c kh n ng c ịnh ạm, hòa tan lân sinh t ng h p IAA c a 10 dòng t t nh t s 75 dòng vi khu n n i sinh mía hân l c Hình Hình thái khuẩn lạccủa số dòng vi khuẩn nội sinh Qua uan c i kính hi n vi quang học, nh n th y ch y u dòng có t bào hình que ng n, nhỏ t t c ều có kh n ng chuy n ng Qua k t qu ki m tra Gram cho th y dòng Gram (-) Bảng Kết định lượng cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA 10 dòng vi khuẩn trội STT Dòng Nguồn gốc vi khuẩn n NH4+ P2O5 IAA (mg/L)* (mg/L)* (mg/L)* CT4 Th n - Châu Thành 1,507 e 57,892 a 18,212 b DR2 Rễ, H o Đức - Châu Thành 1,248 f 40,687 c 9,019 f KT1 Th n Đ ng Khởi - Châu Thành 1,625 d 42,458 c 5,562 gh 111 KT2 Th n Đ ng Khởi - Châu Thành 1,059 g 30,170 d 17,450 c LT2 Thân, Thành Long - Châu Thành 1,465 c 22,887 e 10,307 d TVT1 Thân, Trà Vong - Tân Biên 2,079 b 46,639 b 6,304 g TVT4 Thân, Trà Vong - Tân Biên 1,197 fg 41,625 c 5,296 h TDT8 Thân, Thạnh Đ ng - Tân Biên 1,207 fg 26,870 d 5,929 gh GBR5 Rễ, Gia Bình - Tr ng Bàng 0,254 h 61,315 a 10,413 e 10 HTR8 Rễ Hưng Thu n - Tr ng Bàng 2,654 a 58,417 a 18,836 a 11 Đ i chứng 0,000 i 0,000 f 0,000 i CV (%) 6,391 5,911 5,050 *Số liệu trình bày bảng bình quân đợt đo mẫu với lần lặp: 2, 4, 6, ngày sau cấy NH4+ IAA; 5, 10, 15, 20 ngày sau chủng P2O5 Những số (trong cột) theo sau chữ khơng có khác biệt ý nghĩa mức 5% Qua nh n th y ng ạm c ịnh c a 10 dòng t t nh a ng t 0,254 – + 2,654 mg/L NH4 ng lân hòa tan kho ng 22,87 – 61,315 mg/ L P2O5 ng ạt t 296 – 36 g/ Những òng ch u ịnh ng ca ề c a ch i u g c HT TVT1 T àG (H nh ) c t qu ịnh ng hu c ng ự u nghi n cứu c a m t s tác gi ti n hành i ng vi khu n n i sinh mía (Ngơ H ng Thanh ctv., 2014; Hồng Minh Tâm Cao Ngọc Đi p, 2014; Hoang Minh Tam Cao Ngoc Diep, 2014) m t s tr ng h c u nành (Glycine max ) ng (Zea mays L.) (Cassán ctv., 2009; Szilagyi-Zecchin ctv., 2014) Th ng ua c c c ch c ịnh ạm, hòa tan phosphate t ng h nhiều i khu n n i inh h hi n h n ng húc y ng rưởng thực v c c ài Pachycereus pringlei, Chlorella vulgaris, … c thông báo (Puente ctv., 2009; de-Bashan ctv., 2008, Ryan ctv., 2008;) Hình Phản ứng màu với thuốc thử số dòng vi khuẩn trội đo lượng lân hòa tan vào DAI (day after inoculation) 112 3.4 Kết giải trình tự phần đoạn gen 16S rRNA dòng vi khuẩn HTR8 Dòng HTR8 có ngu n g c t rễ mía tr ng Hưng Thu n, huy n Tr ng Bàng th hi n t t c ặc nh n u r n c n chọn ti p tục nh n di n hư ng h inh học phân tử K t qu gi i trình tự m t ph n ạn gen 16S rRNA ò òng ng ng c r ng c li u c a NCBI cho th y dòng HTR8 có ng ng 96% v i ch ng vi khu n Labrys portucalensis F11 (Hình 5) Labrys portucalensis m t Proteobacteria có hình que thu c nhóm Gram âm phù h p v i k t qu kh o sát hình thái nhu m Gram c a dòng HTR8 Kết luận Có 75 dòng vi khu n n i sinh phân l p c t rễ thân mía tr ng t nh T y Ninh Tr ng òng i hu n HTR8 c ng ạm c ịnh ng lân hòa tan ng IAA sinh cao nh n vào k t qu gi i trình tự ạn gen 16S rRNA ò òng ng ng, có th xem HTR8 i hu n Labrys portucalensis(gi ịnh) Dòng vi khu n có tiề n ng ứng dụng t vi khu n ch h ch ng rưởng thực v t cho mía TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tham khảo tiếng Việt Cao Ngọc Đi p Nguyễn Ái Chi (2009), “Phân l ặc tính vi khu n n i sinh khóm (Ananas comosus L.) tr ng r n t phèn huy n B n Lức, t nh Long An” Tuyển tập hội nghị Cơng nghệ sinh học phía Nam năm 2009, thành ph H Chí Minh t ngày 23-2 h ng n Cao Ngọc Đi p (2011), Sách chuyên khảo Vi khuẩn nội sinh thực vật, Nxb Đại Học C n Th n Th Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Đi p (2009), “Phân l ặc tính c a vi khu n n i sinh m t s loại cỏ ch n nu i” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2): 241-250 Hình Kết dò tìm dòng tương đồng trình tự phần gen 16S rRNA dòng HTR8 Nguyễn Đức ng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuy t (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (t p 2): Thí nghiệm vi sinh vật học, Nxb Đại học Qu c gia, Tp H Chí Minh Nhiều loài m i chi Labrys c phân l p t rễ tr ng nhiều nư c (Islam ctv., 2007; Nguyen ctv., 2015) M i y Inui-Kishi ctv (2012) ề c p kh n ng hòa an h t ng h p IAA t t c a m t dòng t ng s 60 dòng vi khu n nh c gi c phân l p t vùng rễ mía tr ng Brazil òng ng ng r nh ự 16S r N v i i hu n Labrys portucalensis Hoàng Minh Tâm Cao Ngọc Đi p (2014), “X c ịnh ặc tính nh n di n vi khu n n i sinh Gluconacetobacter diazotrophicus mía hai t nh B n Tre Long An” Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn 24: 68-74 Ngô H ng Thanh, Hoàng Minh Tâm Cao Ngọc Đi p (2014), “X c ịnh tính vi khu n n i sinh mía tr ng t nh B n Tre Long An” Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn 2:41-48 113 Tr n inh Thư c Nguyễn Đức H àng han Thị hư ng Trang hạ Thị H ng Tư i (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Ðại học Qu c gia, Tp H Chí Minh 15 Inui-Kishi R.N., Kishi L.T., Picch S.C., Barbosa J.C., Lemos M.T.O., Marcondes J., and de Macedo Lemos E.G (2012), “ h h ru u i izing an production activities inplant growth promoting rhizobacteria from brazilian soils un r ugarcan cu i a i n” ARPN Journal of Engineering and Applied Sciences 7(11): 1446- 1454 hạ V n T n Trư ng H T c (2 ), hân n vi sinh n ng nghiệp N N ng nghi Hà N i T ng cục th ng kê Vi t Nam (2015), (https:// www.gso.gov.vn/Default.aspx?tabid=217) 16 Islam M.S., Kawasaki H., Nakagawa Y , Hattori T., Seki T (2007), Labrys okinawensis sp nov and Labrys miyagiensis sp nov., budding bacteria isolated from rhizosphere habitats in Japan, and emended descriptions of the genus Labrys and Labrys monachus Int J Syst Evol Microbiol, 57: 552-557 B Tài liệu tham khảo tiếng Anh 10 Cassán F., Perrig D., Sgroy V., Masciarelli O., Penna C., and Luna V (2009), “Azospirillum brasilense Az39 and Bradyrhizobium japonicum E109, inoculated singly or in combination, promote seed germination and early seedling growth in corn (Zea mays L.) and soy bean (Glycine max )” Eur J Soil Biol, 45:28-35 11 17 Nautiyal C.S (1999), “ n ffici n microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing icr rgani ” FEMS Microbiology Letters 170: 265-270 Cavalcante V.A., and Döbereiner J (1988), “ n w aci -tolerant nitrogen-fixing ac riu a cia wi h ugarcan ” Plan and Soil 108: 23-31 18 Nguyen N.L., Kim Y.J., Hoang V.A., Kang J.P., Wang C., Zhang J., Kang C.H., and Yang D.C (2015), Labrys soli sp nov., isolated from the rhizosphere of Korean ginseng Int J Syst Evol Microbiol (Published online:Aug DOI: 10.1099/ijsem.0.000512) 12 Dang Thi Ngoc Thanh and Cao Ngoc Diep (2 ) “ a i n charac riza i n an identification of endophytic bacteria inmaize (Zea mays L.) cultivated on acrisols of the Southea f Vi na ” American Journal of Life Sciences 2(4): 224-233 (Published online: Aug 30, 2014 DOI: 0.11648/j.ajls 20140204.16) 19 Park M., Kim C., Yang J., Lee H., Shin W., Ki S an Sa T (2 ) “ a i n an characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricu ura cr f K r a” Microbiological Research 160: 127-133 13 De-Bashan L.E., Antoun H., and Bashan Y (2 ) “n n f in -3-acetic acid produced by the growth-promoting bacterium Azospirillum ” in r ing growth of Chlorella vulgaris J Phycol.44: 938-947 20 Perin L., Martínez-Aguilar L., CastroGonzález R., Estrada-de los Santos P., Cabellos-Avelar T., Guedes H.V., Reis V.M., and Caballero-Mellado J (2006), “ iaz r hic Burkholderia species associated with field-grown maize and ugarcan ” Appl Environ Microbiol 72: 3103-3110 14 Hoang Minh Tam and Cao Ngoc Diep (2014), “ a i n charac riza i n an i n ification of endophytic bacteria in sugarcane (Saccharum spp L.) cultivated on soils of the ng Nai r inc S u h a f Vi na ” American Journal of Life Sciences 2(6): 361368 (Published online: Dec 18, 2014 DOI: 10.11648/j.ajls.20140206.16) 21 Puentea M.E., Li C.Y., Bashan Y (2009), “En hy ic ac ria in cac i can improve the development of cactus see ing ” Environmental and Experimental Botany 66: 402-408 114 22 Rosenblueth M., and Martínez-Romero E (2 6) “ ac ria n hy an h ir in rac i n wi h h ” Molecular PlantMicrobe Interactions.19:827-837 Glienke C., and Galli-Terasawa L.V (2014), “Identification and characterization of endophytic bacteria from corn (Zea mays L.) roots with biotechnological potential in agriculture” AMB Express 4(26) (Published online: May, DOI: 10.1186/ s13568-014-0026-y) 23 Ryan R.P., Germanie K., Franks A., Ryan D.J., and Dowling D.N (2008), “ ac ria n hy : r c n n an a ica i n ” FEMS Microbiol Lett 278:1-9 25 Von Gravenitz A., and Bucher C (1983), Accuracy of the KOH and Vancomycin Tests in Determining the Gram Reaction of NonEn r ac ria ” J Clin Microbiol 16(4):983-985 24 Szilagyi-Zecchin V.J., Ikeda A.C., Hungria M , Adamoski D., Kava-Cordeiro V., Ngày nh n bài: 12/01/2016 Biên t p xong: 15/02/2016 115 Duy t ng: / 2/2016 ... tính t Đ y c c dòng vi khu n b n ịa có tiề n ng ứng dụng s n xu t phân bón vi sinh chun dùng cho mía c a ịa hư ng Vật liệ 2.1 Khử trùng mẫu phân lập vi khuẩn c u thân rễ c a mía (Saccharum officinarum. .. Vi khuẩn nội sinh phát triển môi trường LGI bán đặc (B) đối chứng âm gồm dịch chiết từ mẫu mơ mía hấp tiệt trùng (A) 110 3.2 Đặc tính khuẩn lạc tế bào Về hình thái khu n lạc a dòng vi khu n phân. .. khảo Vi khuẩn nội sinh thực vật, Nxb Đại Học C n Th n Th Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Đi p (2009), Phân l ặc tính c a vi khu n n i sinh m t s loại cỏ ch n nu i” Tạp chí Cơng nghệ Sinh