Bài viết khảo sát hình thái hai giống sơ ri chua và ngọt; phân tích điện di protein; đánh giá về mặt hình thái; so sánh kích thước lá sơ ri chua và sơ ri ngọt. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.
31(2): 47-52 6-2009 T¹p chÝ Sinh häc NHËN DIƯN HAI GIốNG SƠ RI (Malpighia glabra l.) CHUA Và NGọT Gò CÔNG-TIềN GIANG BằNG HìNH THáI Và ĐIệN DI PRôTêIN TRầN THị THANH TUYềN, NGUYễN BảO TOàN Đại học Cần Thơ Cây sơ ri (Malpighia glabra L.) có nguồn gốc từ Nam, Trung Mỹ đợc du nhập vào Việt Nam từ không rõ Cây sơ ri loại ăn đợc trồng nhiều tỉnh Đồng sông Cửu Long Nhng diện tích trồng nhiều vùng Gò Công bao gồm Gò Công Tây, Gò Công Đông thị x Gò Công, tỉnh Tiền Giang Nơi trồng hai loại sơ ri phổ biến thị trờng sơ ri sơ ri chua, chiếm gần 600 diện tích Riêng trái sơ ri chua mặt hàng xuất có giá trị cao, giàu dỡng chất đặc biệt hàm lợng đờng vitamin nh vitamin A, vitamin C Các tác giả [2, 6, 7] đ mô tả đặc tính hình thái thực vật để nhận dạng sơ ri Với đặc điểm hình thái đ đợc tác giả mô tả phân loại mức độ loài (species) nhng mức độ dới loài (variety) công việc ny trở nên khó khăn Nông dân Gò Công canh tác sơ ri cho có giống sơ ri Sự chua sơ ri vùng đất canh tác gây Nhng có nông dân cho hai giống (variety) riêng biƯt, mét gièng chua vµ mét gièng ngät Sù nhËn dạng mức độ hình thái khó phân biệt biểu hình thái thờng bị tác động yếu tố môi trờng Điện di prôtêin công cụ giúp ích nhiều việc phân biệt cấp độ dới loài Sự khác loài cã thĨ cho r»ng sù kh¸c cđa gien Nh−ng so sánh trực tiếp gien công việc khó tốn nhiều thời gian Do so sánh khác sản phẩm hoạt tính gien cách sử dụng prôtêin nh maker kiểu gien (genotype) Kỹ thuật điện di đợc sử dụng phân tích prôtêin enzim để xác định đặc tính khác kiểu gien (genotype) loài (species) giống (variety) đợc nhiều tác giả nghiên cứu [1, 3, 8] Trên sở đánh giá mặt hình thái phân tích điện di prôtêin Nghiên cứu đợc thực nhằm nhận diện hai giống sơ ri chua đợc canh tác Gò Công, tỉnh Tiền Giang I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu Mẫu vật đợc sử dụng để nghiên cứu hai giống sơ ri chua đợc canh tác x thuộc huyện Gò Công (Đông Tây), tỉnh Tiền Giang Mẫu đợc thu thập hai đất thịt pha cát cát Khảo sát hình thái hai giống sơ ri chua Thân: quan sát ghi nhận màu sắc hình dạng thân, nhánh, lỗ khí, lông; Lá: đo chiều ngang, chiều dài phiến lá, đếm số gân hai loại Sơ ri; Hoa: đo đờng kính hoa; cánh hoa (chiều ngang, chiều dài) vµ ghi nhËn sù hiƯn diƯn cđa cÊu tróc hoa; Quả: đo đờng kính, cân trọng lợng 30 hai giống cân điện tử Tất chi tiêu đợc đo 30 mẫu tính độ lệch chuẩn (standard deviation) Phân tích điện di prôtêin Tinh prôtêin: Thu mẫu hai giống sơ ri Gò Công Mẫu thu cành mang non có màu xanh lục Các mẫu thu đợc cho vào bọc nilông, cột kín, ớp thùng lạnh đa vào phòng thí nghiệm Tách tinh prôtêin: theo phơng pháp [4] Tách khỏi cành, dùng gòn thấm cồn 70o lau lá, sau cho g mẫu vào cối đựng nitơ lỏng dùng chày nghiền nhá mÉu Cho ml dung dÞch trÝch mÉu trùc tiếp vào cối Dung dịch trích mẫu gồm 0,175 Tris-HCl, pH = 8,8; 5% sodium dodecyl sulfate (SDS); 15% Glycerol; 0,3M DTT (Dithiothreitol) Sau cho vào ống ly tâm 47 ly tâm 10.000 vòng/phút (rpm) thời gian 10 phút Thêm ml cồn tuyệt đối, trộn lẫn máy lắc giữ -20oC để kết tủa prôtêin; ly tâm 5000 vòng/phút thời gian 15 phút để thu prôtêin đ kết tủa, lấy chất bề mặt loại bỏ phần cồn d rửa 15-20 ml cồn 80o Lặp lại lần Thu prôtêin đ kết tủa cách ly tâm 5000 vòng/phút thời gian 15 phút, bỏ nớc làm khô mẫu thu đợc máy hút chân không 37oC 15 phút Cho TBS (Trisbuffered saline) vào Ly tâm lần để loại bỏ phần lẫn tạp Mẫu đ sẵn sàng để phân tích điện di prôtêin Điện di prôtêin: Chuẩn bị hộp điện di: rửa khuôn kính đổ gel, lợc cài, hộp điện di lau khô cồn Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide 12% với tổng thể tÝch 30 ml/2 gel, bao gåm n−íc cÊt: 6,6 ml; dung dÞch Acrylimide 8,0 ml; Tris-HCl (pH = 8,8) ml; SDS 10% 0,2 ml; APS (ammonium persulfate) 0,2 ml Dung dịch đợc trộn lẫn máy khuấy từ Sau đó, cho thêm 0,008 ml TEMED (N, N, N,N-tetramethylethylenediamine) vào dung dịch, khuấy nhanh chóng dùng pipet cho vào khung kính đổ gel Gel đợc bơm đến vạch cách lợc 0,5 cm Bơm tiếp lớp nớc cất lên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng Chờ 20 - 30 phút cho gel đông lại Chuẩn bị mẫu prôtêin: Pha mẫu với nớc cất theo tỉ lệ 1:1 Cho vào ống đựng mẫu (eppendorf) 100 àl mẫu prôtêin 100 àl dung dịch đệm đ chuẩn bị nh Lắc đun cách thủy 95oC phút Sau để nguội Đổ gel tập trung đợc pha nồng độ 4% gel có thành phần nh sau: 0,6 M Tris-HCl, pH = 6,8 1,25 ml; Acrylamide 30%, 0,67 ml; N−íc cÊt ml; SDS 10% 0,05 ml; APS 10% 0,025 ml; Khuấy dung dịch máy khuấy từ Sau cho thêm 0,005 ml TEMED Giống nh đổ gel phân tích Cho dung dịch vào khung đổ gel Đa lợc vào lớp gel Lợc cần phải đa vào cách cẩn thận để tránh tạo bọt phía dới chân lợc ý trớc đổ gel tập trung, phải đổ bỏ phần nớc phía gel phân tích cách nghiêng dùng giấy thấm Gel tập trung đông lại sau khoảng 20 phút Đánh dấu lại vị trí lỗ giếng Đa mẫu vào giếng: Sau lớp gel tập 48 trung đ đông lại tiến hành lắp khung đổ gel vào khung chạy điện di Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên dới bên chạy điện di Lấy lợc cho mẫu vào giếng Mẫu tích từ 10-20 àl đợc trộn với bromophenol R-250 Một giếng đợc bơm prôtêin chuẩn đ biết trọng lợng Chạy điện di: Sau hoàn tất việc đa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di cho dòng điện qua Dòng điện chạy điện di 25 mA/80 V Thời gian chạy - giê Còng cã thĨ quan s¸t qu¸ trình dịch chuyển prôtêin nhờ vào dải băng màu xanh bromophenol blue R-250 Nhuộm gel: Gel đợc lấy khỏi hộp gel cho vào dung dịch nhuộm gel đ đợc chuẩn bị nh sau (Comassie R-250 0,1 g; Methanol 50 ml; n−íc cÊt 40 ml; Acid acetic 100% 10 ml) Để làm nhanh trình nhuộm màu, hệ thống đợc đặt máy lắc đảo, thời gian nhuộm khoảng Tẩy màu: Tẩy gel dung dịch tẩy máy lắc - Dung dÞch tÈy bao gåm: Methanol 100 ml; Acid acetic 100% 70 ml Sau tÈy gel, gel sÏ s¹ch lớp màu băng prôtêin rõ gel Đo phân tích kết quả: Để xác định trọng lợng phân tử prôtêin băng có sai khác, tiến hành đo khoảng cách (R) từ giếng đến băng prôtêin chuẩn đồng thời xác định giá trị logM (M trọng lợng phân tử prôtêin chuẩn băng) Sau đó, dùng chơng trình Excel vẽ đồ thị tơng quan R log M để xác định phơng trình chuẩn y = ax + b tiến hành đo khoảng cách từ giếng đến băng cho thấy sai khác hai loại sơ ri (R = y), từ xác định đợc giá trị x = log M = (y - b)/a Nh vậy, trọng lợng phân tử M đợc xác định 10logM II KếT QUả Và THảO LUậN Đánh giá mặt hình thái Kết cho thấy mặt hình thái thực vật hai giống sơ ri chua có điểm giống khác biệt nh sau: Thân: Cây sơ ri thân dạng bụi, cao khoảng 3-5 m Cành dài 1-2 m, phân cành sớm, tán tha Thân có dạng thẳng Vỏ nhám có màu nâu đen Trên thân cành có vân gợn sóng song song với trục thân, cành Ngoài ra, thân cành có nhiều lỗ khí nhỏ Thân non lỗ khí nhỏ, màu vàng Khi trởng thành, lỗ khí nhiều hơn, màu trắng Tuy nhiên, đỉnh non lỗ khí mà thay vào nhiều lông mịn, màu trắng Khi già thân có màu nâu sậm; vân rõ, sâu dài Bên cạnh đó, lỗ khí lớn nhô cao Điểm khác sơ ri chua sơ ri thể màu sắc thân cha rõ rệt Lá: Lá sơ ri dạng thuôn dài, nhọn đỉnh tù cuống lá, mép nguyên Lá mọc đối, dạng đơn độc hay mọc thành cụm gần đỉnh cành khoảng cách ngắn Trên hai mặt phủ lông mịn, màu trắng Lông trởng thành Giữa sơ ri chua khác màu sắc, độ dòn, kích thớc độ dày (bảng 1) Lá sơ ri màu xanh đậm, dòn dày sơ ri chua Ngoài ra, kích thớc sơ ri lớn sơ ri chua chiều dài lẫn chiều ngang Bảng Đất canh tác Đất thịt pha cát Đất cát So sánh kích thớc (cm) sơ ri chua sơ ri Gièng S¬ ri chua Gièng S¬ ri ngät ChiỊu ngang ChiỊu dµi ChiỊu ngang ChiỊu dµi 2,47 ± 0,08 5,85 ± 0,16 3,34 ± 0,18 6,58 ± 0,23 2,42 ± 0,12 5,08 ± 0,17 3,39 ± 0,09 6,79 ± 0,21 Bảng Đờng kính hoa (cm) chiều dài cánh hoa (cm) hoa sơ ri chua sơ ri Giống Sơ ri chua Giống Sơ ri Đất canh tác Đờng kính Chiều dài Đờng kính Chiều dài Đất thịt pha cát 1,6 0,02 0,7 0,02 2,2 0,02 0,9 0,02 Đất cát 1,5 0,02 0,6 ± 0,02 2,0 ± 0,02 0,8 ± 0,02 Hoa: Hoa sơ ri có dạng quạt, mọc đơn độc hay tạo thành cụm gồm vài hoa Mỗi hoa có cánh rời, màu hồng Mép cánh hoa mỏng, mềm, màu hồng nhạt màu trung tâm cánh hoa Bìa nguyên nhng gợn sóng tổng số cánh hoa Riêng cánh lại to đặc biệt bìa có dạng ca gấp nếp nhiều Mỗi hoa có 10 nhị đực mang bao phấn dạng gần tròn, màu vàng tơi Hoa có nớm, dạng gần tròn, màu vàng Vòi rời, dạng thon dài, màu xanh vàng Có đài thon nhọn, phủ lông mịn Mỗi đài có đài phụ gốc Đó khối u thon bầu đỉnh Đờng kính chiều dài cánh hoa sơ ri chua cho thấy giá trị trung bình có khác biệt (bảng 2) So sánh cấu trúc hoa hai giống sơ ri chua đợc trình bày bảng CÊu tróc hoa cđa hai gièng s¬ ri chua hầu nh giống Trái: Trái sơ ri dạng tròn, dẹp Trái chia làm múi có vỏ mỏng Khi non trái màu xanh, vừa chín trái màu cà màu đỏ trái chín mọng Trái Sơ ri có vỏ nhăn, nơi tiếp giáp hai múi nhô lên đặc biệt gần cuống trái Khi non vỏ thịt trái có màu xanh đậm dòn Khi trái chín, thịt mềm, màu vàng nhạt vỏ màu đỏ sậm (đỏ bầm) Đặc biệt, trái sơ ri có trọng lợng, kích thớc lớn trái sơ ri chua đợc trồng đất thịt có vị Trái sơ ri chua có vỏ láng hơn, nơi tiếp giáp hai múi tạo thành r nh lõm sâu Khi non, trái màu xanh nhạt, thịt màu xanh vàng không dòn sơ ri Khi chín, thịt màu vàng sậm vỏ trái màu đỏ tơi so với sơ ri ngọt, vị chua Đờng kính trái trọng lợng trái hai giống Sơ ri chua có khác biệt (bảng 4) Hạt: Trái sơ ri có hạt Một hạt có khía hẹp tạo thành hai r nh rộng, chạy suốt từ gốc đến đỉnh hột Khía thẳng, hai khía bên nghiêng tạo thành góc khoảng 100 - 110o Hạt có dạng to, bầu góc nhọn đỉnh Các kết đạt đợc bảng cho thấy mặt hình thái hai giống sơ ri 49 chua đợc nghiên cứu có đặc tính hình thái mà tác giả đ mô tả [2, 6, 7] Trong đặc điểm hình thái lá, đờng kính hoa trái cho thấy có khác biệt Nhng thông số dễ biến động theo yếu tố môi trờng [5] Riêng cấu trúc hoa bị tác động môi trờng Trong phân loại, thực vật hoa tiêu quan trọng để phân biệt khác loài Phân tích cấu trúc hoa bảng cho thấy thông sè cđa cÊu tróc hoa cđa hai gièng s¬ ri chua giống Nh hai giống xuất phát loài sơ ri (Malpighia glabra L.) Bảng So sánh đặc điểm cấu trúc hoa Sơ ri chua Đặc tính Hoa tự Tiền khai hoa (TKH) Tính đối xứng Phái tính Số phần tử hoa Vị trí bầu no n Số lợng đài hoa Cách xếp đài Màu sắc đài Hình dạng đài Số lợng cánh hoa Cách xếp cánh hoa Màu sắc cánh Hình dạng cánh hoa Số lợng nhị Cách xếp nhị Nơi đính nhị Hình dạng nhị Màu sắc nhị Hình dạng bao phấn Số buồng/bao phấn Đờng khai bao phấn Hớng Màu sắc bao phấn Hình dạng vòi Kích thớc vòi Màu sắc vòi Số lợng nớm Hình dạng nớm Màu sắc nớm Số tâm bì Số buồng /no n Số tiểu no n Cách đính no n Số lợng nhụy 50 Hoa sơ ri chua Cô độc/chùm TKH kết hợp Không Lỡng tính Ngũ phân, dị phần Bầu no n (thợng) Luân sinh, rời, có lông Xanh vàng Thon nhọn Luân sinh, rời Hồng sậm Hình quạt, ca 10 Luân sinh, rời, không lông Đáy bầu no n Thon; to gốc hẹp đỉnh Trắng (chỉ nhị nhỏ), hồng (chỉ nhị to) Gần tròn, rời Ngoại hớng Vàng Thon dài Dài nhị Xanh vàng Gần tròn, rời Vàng 3 Trung trục Hoa sơ ri Cô độc/chùm TKH kết hợp Không Lỡng tính Ngũ phân, dị phần Bầu no n (thợng) Luân sinh, rời, có lông Xanh vàng Thon nhọn Luân sinh, rời Hồng pha sắc tím Hình quạt, ca 10 Luân sinh, rời, không lông Đáy bầu no n Thon; to gốc hẹp đỉnh Trắng (chỉ nhị nhỏ), hồng (chỉ nhị to) Gần tròn, rời Ngoại hớng Vàng Thon dài Dài nhị Xanh vàng Gần tròn, rời Vàng 3 Trung trục Bảng So sánh đờng kính (cm) trọng lợng trái (g) hai giống sơ ri chua sơ ri Giống sơ ri chua Giống sơ ri Đất canh tác Đờng kính Trọng lợng Đờng kính Trọng lợng Đất thịt pha cát 1,92 0,03 3,79 0,11 2,13 0,03 5,42 0,16 Đất cát 1,69 0,02 3,08 ± 0,17 1,87 ± 0,02 4,00 ± 0,15 Điện di prôtêin Hình Kết điện di prôtêin sơ ri chua sơ ri C sơ ri chua; N sơ ri ngọt; Pro Prôtêin chuẩn Bảng Giá trị prôtêin chuẩn R (cm) 1,0 1,7 2,3 3,3 4,2 4,5 M (kDa) 97,40 66,20 45,00 31,00 21,50 14,40 2.5 y = -0.2179x + 2.1874 R2 = 0.9798 log M Phân tích prôtêin theo phơng pháp ®iÖn di SDS - Page cho thÊy r»ng cã băng thể khác biệt chúng (hình 1) Giá trị khoảng cách (R) từ giếng đến băng prôtêin chuẩn logM (M trọng lợng phân tử prôtêin chuẩn băng) đợc trình bày b¶ng 1.5 0.5 0 LogM 1,99 1,82 1,65 1,49 1,33 1,16 Từ giá trị bảng tiến hành phân tích tơng quan giá trị R log M (hình 2) để đạt đợc phơng trình chuẩn sở để xác định trọng lợng phân tử băng khác biệt R Hình Đờng cong chuẩn logM theo khoảng cách di chuyển (cm) Giá trị R2 (hệ số tơng quan) đồ thị 0,9798 giá trị tơng quan chặt theo phơng trình chuẩn: y = - 0,2179x + 2,1874 Giá trị M băng khác biệt sau đo khoảng cách cho kết bảng Phân tích prôtêin hai loại sơ ri có khác biệt trọng lợng phân tử, khác biệt thể 51 băng prôtêin có trọng lợng phân tử 51,89 kDa; 31,08 kDa 28,06 kDa Trong đó, băng có trọng lợng 28,06 kDa đợc xem nh marker, cho thấy khác biệt rõ ràng Trọng lợng phân tử 28,06 kDa có loại sơ ri chua mà loại sơ ri Còn prôtêin có trọng lợng 51,89 kDa có nhiều loại loại chua prôtêin có trọng lợng 31,08 kDa ngợc lại Vì kết luận sơ ri chua hai giống (variety) khác Bảng Số liệu băng khác biệt R (cm) = y M Log M 2,20 51,89 1,72 3,20 31,08 1,49 3,40 28,06 1,45 III Kết luận Về mặt hình thái phân biệt đợc hai giống sơ ri chua sơ ri qua kích thớc lá, hoa, trái vị chua Nhng yếu tố dễ bị tác động môi trờng Điện di prôtêin cho thấy hai giống chua khác Sự khác biệt đợc thể băng có trọng lợng phân tử 51,89 kDa; 31,08 kDa 28,06 kDa TàI LIệU THAM KHảO Azeez M A and Morakinyo J A., 2004: African Journal of Biotechnology, 3(11): 585-587 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chơng, 2004: Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tËp Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi Giannasi D E and D J Crawford, 1986: Evolutionary Biology, 20: 25-148 Plenum Press, New York Hames P D., 1998: Gel electrophoresis of proteins, A practical approach, 3rd ed, Oxford Hartmann H T et al., 1997: Plant propagation principles and practices Sixth edition Prentice/Hall Simon & Schuser/A Viacom company, Upper saddle River, New Jersey Ph¹m Hoàng Hộ, 2000: Cây cỏ Việt Nam, tập 2, Nxb Trẻ Hồ Chí Minh Trần Hợp, 2002: Tài nguyên gỗ Việt Nam, Nxb Nông nghiệp Vries I M., 1996: Genet Resour Crop Eval., 43: 193-202 IDENTIFICATION OF TWO SWEET AND SOUR ACEROLA (Malpighia glabra L.) VARIETIES BY MORPHOLOGY AND PROTEIN ELECTROPHORESIS TRAN THI THANH TUYEN, NGUYEN BAO TOAN SUMMARY Acerola (Malpighia glabra L.) was one of the fruit trees cultivated popularly in some provinces of Mekong Delta The largest cultivated areas of these trees were Go Cong districts (West and East Go Cong), Tien Giang province Nowadays, there were two sour and sweet acerola varieties:cultivated Identification of these two varieties through morphology was very difficult and easy to mistake Protein electrophoresis was a good tool to identify varietties This research aimed to identify two sour and sweet acerola varieties based on morphology and protein electrophoresis Acerola samples used in research were collected on two kinds of soil: sandy silt and sandy soils Protein electrophoresis were analysed according to Hames (1998) Research results showed that there were differeces at some morphological characteristics such as flower and fruit diameters However, morphological characteristics were often influenced easily by environmental impacts While flower was not influenced Flower diagram analysis showed that both varieties were very similar Thus these morphological characteristics have not yet enough information to distinguish two varieties Results of protein electrophoresis showed that there were quite differences between two sour and sweet acerola varieties Differences were detected at bands which molecular weights were 51.89 kDa, 31.08 kDa and 28.06 kDa Key word: Acerola (Malpighia glabra L.); morphology, protein electrophoresis Ngµy nhËn bµi: 15-1-2008 52 ... hoa sơ ri chua cho thấy giá trị trung bình có khác biệt (bảng 2) So sánh cấu trúc hoa hai giống sơ ri chua đợc trình bày bảng Cấu trúc hoa hai giống sơ ri chua hầu nh giống Trái: Trái sơ ri dạng... xanh vàng không dòn sơ ri Khi chín, thịt màu vàng sậm vỏ trái màu đỏ tơi so với sơ ri ngọt, vị chua Đờng kính trái trọng lợng trái hai giống Sơ ri chua có khác biệt (bảng 4) Hạt: Trái sơ ri có... Đất cát 1,69 0,02 3,08 0,17 1,87 ± 0,02 4,00 ± 0,15 §iƯn di prôtêin Hình Kết điện di prôtêin sơ ri chua sơ ri C sơ ri chua; N sơ ri ngọt; Pro Prôtêin chuẩn Bảng Giá trị prôtêin chuẩn R (cm)