Vi tảo lục Haematococcus pluvialis là một nguồn cung cấp sắc tố astaxanthin tự nhiên - một loại sắc tố được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản, công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Trong bài báo này, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl lên sinh trưởng và tích lũy astaxanthin của loài vi tảo H. pluvialis Flotow phân lập tại tỉnh Hòa Bình. Thí nghiệm được tiến hành theo mô hình nuôi cấy hai pha, trong đó ở pha một tảo được nuôi cấy dưới điều kiện tối ưu để đạt mật độ tế bào cực đại, sau đó chuyển sinh khối tảo vào pha thứ hai sốc muối với nồng độ NaCl của môi trường là 0,8%, 1,5% và 2,5%. Kết quả cho thấy, nồng ñộ NaCl cao trong môi trường gây ra sự ức chế sinh trưởng và tăng cường sự tích lũy astaxanthin trong tế bào. Ở nồng độ NaCl 2,5%, tế bào tảo chuyển sang giai đoạn bào xác sớm nhất, với hàm lượng astaxanthin tăng nhanh từ 10 pg/tế bào lên 48 pg/tế bào sau khi chuyển sang pha hai 15 ngày. Ngoài ra, các kết quả xác định hàm lượng lipid tổng số cũng cho thấy, sự tích lũy astaxanthin và lipid trong tế bào H. pluvialis xảy ra đồng thời. Hàm lượng lipid đạt cao nhất là 19 ± 1,3% và 26 ± 0,12%, tương ứng ở công thức thí nghiệm sốc muối 1,5% và 2,5% sau khi chuyển sang pha hai 10 ngày.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(2): 213-223 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MUỐI LÊN SINH TRƯỞNG VÀ KHẢ NĂNG TÍCH LŨY ASTAXANTHIN CỦA VI TẢO HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS LÀM CƠ SỞ BƯỚC ĐẦU CHO QUI TRÌNH NI CẤY PHA Lưu Thị Tâm, Đinh Đức Hoàng, Đinh Thị Ngọc Mai, Ngơ Thị Hồi Thu, Hồng Thị Lan Anh, Đặng Diễm Hồng* Viện Cơng nghệ sinh học, (*)ddhong60vn@yahoo.com TĨM TẮT: Vi tảo lục Haematococcus pluvialis nguồn cung cấp sắc tố astaxanthin tự nhiên - loại sắc tố ñược sử dụng rộng rãi nuôi trồng thủy sản, công nghiệp thực phẩm dược phẩm Trong báo này, chúng tơi nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối NaCl lên sinh trưởng tích lũy astaxanthin loài vi tảo H pluvialis Flotow phân lập tỉnh Hòa Bình Thí nghiệm tiến hành theo mơ hình ni cấy hai pha, pha tảo ñược nuôi cấy ñiều kiện tối ưu ñể ñạt mật độ tế bào cực đại, sau chuyển sinh khối tảo vào pha thứ hai sốc muối với nồng ñộ NaCl môi trường 0,8%, 1,5% 2,5% Kết cho thấy, nồng độ NaCl cao mơi trường gây ức chế sinh trưởng tăng cường tích lũy astaxanthin tế bào Ở nồng ñộ NaCl 2,5%, tế bào tảo chuyển sang giai ñoạn bào xác sớm nhất, với hàm lượng astaxanthin tăng nhanh từ 10 pg/tế bào lên 48 pg/tế bào sau chuyển sang pha hai 15 ngày Ngoài ra, kết xác ñịnh hàm lượng lipid tổng số cho thấy, tích lũy astaxanthin lipid tế bào H pluvialis xảy ñồng thời Hàm lượng lipid ñạt cao 19 ± 1,3% 26 ± 0,12%, tương ứng cơng thức thí nghiệm sốc muối 1,5% 2,5% sau chuyển sang pha hai 10 ngày Từ khóa: Haematococcus pluvialis, lipid tổng số, ni cấy pha, sốc muối, tích lũy astaxanthin MỞ ĐẦU Astaxanthin (3, 3’- dihydroxy β) dẫn xuất β-carotenoid ñược sử dụng phổ biến nuôi trồng thủy sản (thức ăn bổ sung cho cá hồi, cá cảnh), công nghiệp thực phẩm (chất màu tự nhiên), dược phẩm (chất chống oxi hóa, tăng cường khả miễn dịch, phòng chống ung thư) thực phẩm chức [13, 17] Astaxanthin ñược tổng hợp thực vật, vi khuẩn, vài loại nấm tảo lục Trong số đó, lồi vi tảo lục nước Haematococcus pluvialis thu hút ñược quan tâm nghiên cứu khả tích lũy astaxanthin cao, lên tới 4-5% trọng lượng khơ [24] Astaxanthin tích lũy tế bào tảo H pluvialis suốt trình chuyển từ giai ñoạn sinh dưỡng (tế bào chuyển ñộng, có màu xanh) sang giai đoạn bào xác (tế bào hình cầu khơng chuyển động) Ở điều kiện mơi trường tối ưu, tế bào tảo H pluvialis trì trạng thái sinh dưỡng astaxanthin tích lũy mức ñộ thấp Khi gặp ñiều kiện môi trường bất lợi như: thiếu hụt nitơ, photpho, tỷ lệ C/N cao ñộ mặn, cường ñộ ánh sáng, nhiệt ñộ cao, q trình tích lũy astaxanthin tăng cường phản ứng bảo vệ thể [2, 12, 23] Nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm tìm phương pháp tối ưu cho nuôi trồng vi tảo H pluvialis với hàm lượng cao astaxanthin Kang et al (2005) [11] so sánh khả tích lũy astaxanthin vi tảo lục nuôi quang tự dưỡng dị dưỡng Kết cho thấy, nuôi dị dưỡng (sử dụng acetate nguồn C), hàm lượng astaxanthin thấp - lần nuôi cấy quang tự dưỡng mơi trường thiếu nitơ bổ sung bicarbonate (HCO3-) CO2 liên tục chiếu sáng cường ñộ cao Các kết nghiên cứu khác cho thấy, yếu tố mơi trường có tác dụng làm tăng cường trì sinh trưởng sinh dưỡng tế bào tảo H pluvialis, khơng có vai trò kích thích tế bào tảo tích lũy astaxanthin ngược lại, tác nhân có tác dụng kích thích trình sinh tổng hợp astaxanthin cao ức chế sinh trưởng tảo Vì vậy, quy trình ni cấy pha, đó, pha đầu thiết lập điều kiện tối ưu cho sinh trưởng tế bào sinh dưỡng nhằm ñạt mật ñộ cao pha II, với điều kiện thuận lợi cho việc tích lũy astaxanthin, ñược coi hiệu phù hợp cho việc sản xuất sinh khối tảo giàu astaxanthin [18] Hiện nay, Việt Nam, nuôi trồng vi tảo 213 Luu Thi Tam et al H pluvialis ñang bắt đầu với số nghiên cứu cơng bố [9, 10] Trong báo này, ảnh hưởng nồng độ muối lên sinh trưởng khả tích lũy astaxanthin vi tảo H pluvialis ñã ñược nghiên cứu Các kết thu ñược sở bước đầu cho qui trình ni trồng pha lồi vi tảo để thu sinh khối tảo giàu astaxanthin cho nhiều ứng dụng khác tương lai PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Chủng vi tảo H pluvialis Flotow phân lập tỉnh Hòa Bình (năm 2009) phòng Cơng nghệ tảo, Viện Cơng nghệ sinh học cung cấp Tảo ñược lưu giữ nhân giống sơ cấp môi trường C, 25oC, cường ñộ chiếu sáng 1,5 klux với chu kỳ sáng tối 12: 12 Thành phần môi trường C RM theo công bố Đặng Diễm Hồng nnk (2010) [10] Phương pháp Tảo H pluvialis ni mơi trường C, điều kiện tối ưu cho sinh trưởng (25oC, cường ñộ ánh sáng 1,5 klux, chu kỳ sáng: tối 12: 12 giờ) Sau ngày nuôi (các tế bào chủ yếu trạng thái sinh dưỡng, chiếm 8090% tổng số tế bào), dịch nuôi cấy ñược ly tâm 6000 vòng/5 phút Loại bỏ phần dịch trên, thu cặn tế bào bổ sung môi trường RM có chứa nồng độ muối khác ñể tiến hành thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng nồng ñộ muối lên sinh trưởng tảo H pluvialis: Thí nghiệm tiến hành mơi trường RM bình tam giác 250 mL với nồng độ NaCl khác nhau: 0%; 0,2%; 0,4%; 0,6% 0,8% Mật ñộ tế bào tảo ban đầu cơng thức thí nghiệm × 104 tế bào (TB)/ml Tảo ni ñiều kiện tối ưu cho sinh trưởng mơ tả Mỗi cơng thức lặp lại lần Nghiên cứu ảnh hưởng nồng ñộ muối lên khả tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis (thí nghiệm nuôi cấy pha sử dụng tác nhân sốc muối): Sau chọn nồng độ NaCl thích hợp cho trình chuyển pha nhanh từ tế bào sinh dưỡng sang dạng bào xác tích lũy astaxanthin, chúng tơi sử dụng nồng độ muối để nghiên cứu tiếp ảnh hưởng 214 chúng lên khả tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis Thí nghiệm thực theo quy trình ni cấy pha: pha I tảo ni điều kiện tối ưu, kích thích tảo sinh trưởng nhanh đạt mật ñộ tế bào cao 10 ngày Sau ñó, dịch tảo ni pha I ly tâm thu tế bào Cặn tế bào hòa mơi trường RM có bổ sung NaCl nồng ñộ 0,8; 1,5 2,5% (pha II) Lắc ñều chia dịch tảo vào bình tam giác 500 1000 ml tương ứng với 350 500 ml dịch tảo/bình Các bình ni tảo đặt điều kiện mơ tả Pha II thí nghiệm nuôi cấy pha sử dụng tác nhân sốc muối, 24 ñầu, tảo ñược lấy giờ/lần ñể quan sát thay đổi hình thái tế bào kính hiển vi quang học Nhuộm tế bào Nile Red để quan sát khả tích lũy lipid soi kính hiển vi huỳnh quang Sinh trưởng tảo đánh giá thơng qua mật độ tế bào, mật độ quang bước sóng 680 nm (OD680nm), hàm lượng sắc tố (chlorophyll a, astaxanthin) hàm lượng protein nội bào [14, 21, 22] Hàm lượng chlorophyll a, astaxanthin hàm lượng protein nội bào ñược xác ñịnh theo công bố Đặng Diễm Hồng nnk (2010) [10] Nhuộm tế bào tảo Nile Red theo quy trình Doan & Obbard (2011) [6]: Bổ sung µl dung dịch Nile Red (9 - diethylamino - 5H benzo [α] phenoxazine-5-1) có nồng độ 0,1 mg/ml aceton vào ml dịch tảo Hỗn hợp ñược vortex nhẹ ủ tối 10 phút nhiệt độ phòng Sau ñó, tế bào tảo ñã nhuộm Nile Red quan sát kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng kích thích từ 450490 nm Tách chiết lipid tổng số xác ñịnh hàm lượng lipid tổng số theo phương pháp Bligh & Dyer (1959) [1] với số cải tiến ñể phù hợp với ñiều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam: cân 0,1 g sinh khối tảo khô cho vào cối chày sứ, bổ sung thêm 0,2 g Na2SO4 nghiền hỗn hợp thành bột mịn Sau bổ sung thêm 10 ml hỗn hợp dung môi chloroform : methanol (tỷ lệ 2:1 (v/v)) ngâm nhiệt độ phòng Lọc hỗn hợp qua giấy lọc Whatman số thu dịch Bã sinh khối ñược tiếp tục chiết với chloroform từ - lần TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(2): 213-223 40 35 30 25 20 15 10 0 Đ/C 12 0,20% 15 20 0,40% 25 31 0,60% Thời gian (ngày) 35 làm bay n-hexan để thu hồi lipid Số liệu thí nghiệm ñược xử lý phần mềm Excel xử lý thống kê ANOVA mức ý nghĩa P ≤ 0,05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng nồng ñộ NaCl lên sinh trưởng tảo H pluvialis Hàm lượng chlorophyll a (µg/L) Mật độ tế bào (x 10 TB/ml) ñể thu tối ña lipid sinh khối tảo Dịch chiết ñược trộn ñều chuyển sang phễu chiết Sau đó, bổ sung thêm 10 ml dung dịch NaCl 0,9% để tĩnh nhiệt độ phòng qua đêm Lớp dung mơi hữu phía chứa thành phần lipid thu nhận Sau đó, dung mơi ñược bay 60oC làm khô desiccator Sản phẩm hòa tan n-hexan, lọc bỏ cặn 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0,80% 15 0% 0,2% Thời gian (ngày) 35 31 0,4% 0,6% 0,8% Hình Sự thay đổi hàm lượng chlorophyll a (chl a) H pluvialis nồng ñộ NaCl khác 0,75 600 T ỷ lệ astaxan th in / ch l a H m lư ợ n g a stax a n th in (µ g /L ) Hình Mật độ tế bào tảo H pluvialis nồng ñộ NaCl khác sau 35 ngày nuôi 25 500 400 300 200 100 0 15 0% 25 0,2% 31 0,4% 0,6% 0,55 0,45 0,35 Thời gian (ngày) 0,25 Thời gian (ngày) 35 0,8% Hình Sự thay đổi hàm lượng astaxanthin H pluvialis nồng ñộ NaCl khác 0,65 15 0% 25 0,2% 0,4% 31 35 0,6% 0,8% Hình Sự thay đổi tỷ lệ astaxanthin /chl a H pluvialis nồng ñộ NaCl khác 22 155 135 115 95 75 55 Thời gian (ngày) 15 0% 0,20% 25 0,40% 31 0,60% 35 0,80% Hàm lượng lipit tổng số (% TLK) H m lư ợ n g p r o te in (p g /T B ) 175 20 18 16 14 12 10 15 25 31 Thời gian (ngày) 35 Hình Sự thay đổi hàm lượng protein nội bào H pluvialis nồng ñộ NaCl khác Hình Sự thay đổi hàm lượng lipid tổng số tảo H pluvialis công thức nồng ñộ NaCl 0,8% Ảnh hưởng nồng ñộ NaCl lên sinh trưởng tảo H pluvialis thơng qua mật độ tế bào (MĐTB) trình bày hình Kết cho thấy, nồng độ NaCl có ảnh hưởng rõ rệt lên 215 Luu Thi Tam et al sinh trưởng tảo H pluvialis Trong ngày ñầu tiên, nồng ñộ muối khác tảo sinh trưởng phát triển bình thường, khơng có sai khác có ý nghĩa thống kê cơng thức thí nghiệm Sau ngày ni, sinh trưởng tảo bắt đầu có sai khác cơng thức thí nghiệm có nồng độ muối khác Tảo sinh trưởng tốt cơng thức đối chứng (khơng bổ sung muối) với mật ñộ tế bào ñạt cực ñại 35 × 104 TB/ml sau 12 ngày, tiếp ñến công thức 0,2%, 0,4%, 0,6% 0,8% NaCl tương ứng với mật ñộ tế bào ñạt cực ñại 24; 20; 19 16 × 104 TB/ml Ở cơng thức ñối chứng, tảo trì chủ yếu dạng tế bào sinh dưỡng, có màu xanh, roi Chúng tơi khơng quan sát thấy có thay đổi hình thái tế bào từ dạng sinh dưỡng sang dạng bào xác Ngược lại, cơng thức thí nghiệm với 0,8% NaCl, trạng thái tế bào tảo chủ yếu dạng bào xác có tích lũy astaxanthin bên tế bào Tỷ lệ caroteniod/chlorophyll a số thể trạng thái sinh lý tế bào tảo tỷ lệ thơng số tốt để đánh giá khả tích lũy astaxanthin Haematococcus pluvialis [7, 15] Vì vậy, H pluvialis có chứa chlorophyll a b chúng tơi lựa chọn nghiên cứu thay ñổi hàm lượng chlorophyll a tỷ lệ astaxanthin/chlorophyll a thơng số đặc trưng cho sinh trưởng tích lũy astaxanthin lồi vi tảo lục Hàm lượng chlorophyll a, astaxanthin, tỷ lệ astaxanthin/chl a protein nội bào công thức thí nghiệm có nồng độ muối khác hình 2, 3, Từ kết hình 2, 3, nhận thấy, hàm lượng sắc tố chlorophyll a astaxanthin có xu hướng tăng tăng mạnh sau 15 ngày ni cấy Hàm lượng astaxanthin đạt cao cơng thức đối chứng với giá trị 1182 µg/l sau 35 ngày ni, tiếp 479, 448, 391 283 µg/l tương ứng cơng thức thí nghiệm có nồng độ NaCl 0,2%, 0,4%, 0,6% 0,8% Điều giải thích tảo sinh trưởng mạnh cơng thức đối chứng, mật ñộ tế bào tăng cao dẫn ñến hàm lượng astaxanthin tổng số đơn vị thể tích ni cao Tuy nhiên, tỷ lệ astaxanthin/chl a lại cho kết ngược lại Ở cơng thức có nồng độ NaCl 0,8%, tỷ lệ astaxanthin/chl a ñạt giá trị cao 0,5 sau 15 ngày, công thức nồng ñộ NaCl 216 khác tỷ lệ ñều nhỏ 0,5 (hình 4) Theo Kobayshi et al (1997) [12] tỷ lệ astaxanthin/chl a > 0,5 cho thấy tế bào tảo chủ yếu trạng thái bào xác có tích lũy astaxanthin Như vậy, nồng độ 0,8% NaCl giúp tế bào tảo H pluvialis chuyển giai ñoạn từ tế bào dạng sinh dưỡng sang dạng bào xác nhanh Điều quan trọng áp dụng cho quy trình ni cấy pha lồi vi tảo lục Hàm lượng protein nội bào có xu hướng giảm dần theo thời gian nuôi tất cơng thức thí nghiệm Kết sau 35 ngày ni, hàm lượng protein nội bào lại nhỏ 100 pg/tế bào Ở cơng thức đối chứng, hàm lượng protein nội bào giảm 1/2 lần so với giá trị ban đầu Trong đó, hàm lượng giảm 1/4 lần so với giá trị ban ñầu cơng thức có bổ sung NaCl (hình 5) Cùng với thay ñổi hàm lượng sắc tố protein nội bào hàm lượng lipid tổng số có biến đổi q trình ni Sự thay ñổi hàm lượng lipid tổng số tảo H pluvialis cơng thức thí nghiệm có bổ sung 0,8% NaCl trình bày hình Kết cho thấy, hàm lượng lipid tổng số có xu hướng tăng dần q trình ni Khi tế bào chuyển sang giai đoạn bào xác tích lũy astaxanthin ñồng thời có tăng hàm lượng lipid tổng số Ở thời ñiểm ban ñầu, hàm lượng lipid chiếm 13,54 ± 0,23% trọng lượng khơ-TLK sau tăng dần lên 21,34 ± 0,35% TLK ngày thứ 31 Kết hoàn toàn tương tự với kết tác giả khác cơng bố giới [4, 5, 16, 19] Như vậy, việc bổ sung NaCl với nồng ñộ khác ñã ảnh hưởng lên sinh trưởng khả tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis Ở nồng ñộ NaCl thấp (0,2 0,4%), sinh trưởng tảo chưa bị ảnh hưởng nhiều Tuy nhiên, tăng nồng ñộ muối lên 0,6 0,8%, sinh trưởng tảo bị ức chế trình chuyển pha từ tế bào sinh dưỡng sang dạng bào xác diễn nhanh hơn, ñặc biệt nồng độ NaCl 0,8% (hình 7) Vì vậy, chúng tơi chọn nồng độ muối làm tác nhân cảm ứng để tiến hành thí nghiệm ni cấy pha tảo H pluvialis TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(2): 213-223 Đối chứng 0,2% NaCl 0,4% NaCl 0,6% NaCl 0,8% NaCl Hình Hình thái tế bào tảo H pluvialis nồng ñộ NaCl khác sau 35 ngày ni cấp độ bình tam giác 250 ml ñược chụp kính hiển vi quang học với ñộ phóng đại x400 Hình Mật độ tế bào H pluvialis thí nghiệm ni cấy pha với pha II sử dụng tác nhân sốc muối nồng ñộ 0,8% NaCl Hình Sự thay ñổi hàm lượng astaxanthin tảo H pluvialis thí nghiệm ni cấy pha với pha II sốc muối Hình 10 Sự thay ñổi hàm lượng lipid tổng số tảo H pluvialis thí nghiệm ni cấy pha với pha II sốc muối Thí nghiệm ni cấy pha tảo H pluvialis với pha II sốc muối Quy trình ni cấy hai pha pha ni cấy tảo ñiều kiện tối ưu ñể ñạt mật ñộ tế bào cực đại, sau chuyển sinh khối tảo vào pha thứ với ñiều kiện thuận lợi cho việc tích lũy astaxanthin chứng minh mơ hình hiệu để thu sinh khối H pluvialis giàu astaxanthin [18] Trong thí nghiệm ni cấy pha với pha II sốc muối này, chúng tơi tiến hành theo quy trình Trước hết, tảo ñược nuôi cấy ñiều kiện tối ưu cho ñến tảo bắt ñầu ñi vào pha cân với mật độ tế bào cực đại 28 × 104 TB/ml hàm lượng chlorophyll a ñạt 400 ± 10 µg/l sau 10 ngày ni cấy Tiếp theo, tảo chuyển sang điều kiện sốc muối để kích thích tế bào chuyển sang giai đoạn bào xác có tích lũy cao astaxanthin Theo công bố Boussiba & Vonshak (1991) [3], tảo H pluvialis gặp ñiều kiện bất lợi nồng độ muối cao tế bào tảo có chế tự bảo vệ cách ngừng sinh trưởng hoàn toàn, tế bào chuyển từ trạng thái sinh dưỡng, có màu xanh, chuyển động sang dạng bào xác, màu đỏ tích lũy lượng lớn astaxanthin tế bào Trong nghiên cứu này, quan sát thấy thay đổi hình thái tế bào tảo cảm ứng nồng ñộ 217 Luu Thi Tam et al NaCl 0,8% (hình 7) Sự thay đổi mật độ tế bào pha thí nghiệm ñược trình bày hình Kết hình cho thấy, 10 ngày pha I, mật độ tế bào có xu hướng tăng nhẹ đạt giá trị cao 31 × 104 TB/ml ngày thứ sau nuôi Sau 10 ngày ni, NaCl bổ sung với nồng độ 0,8% vào mơi trường ni để kích thích tế bào tảo tích lũy astaxanthin Lúc này, mật độ tế bào tảo pha II có sai khác rõ rệt cơng thức đối chứng thí nghiệm Ở cơng thức ñối chứng, mật ñộ tế bào có xu hướng trì ổn định q trình ni Ngược lại, cơng thức thí nghiệm, cảm ứng nồng độ muối cao ức chế sinh trưởng tảo, mật độ tế bào cơng thức thí nghiệm lại giảm 2,5 lần so với giá 10 ngày trị mật ñộ tế bào đầu pha II sau 22 ngày ni Sự thay ñổi hàm lượng sắc tố astaxanthin hàm lượng lipid tổng số nuôi cấy pha II ñược trình bày hình 10 Kết hình 10 cho thấy, hàm lượng astaxanthin/tế bào cơng thức đối chứng thí nghiệm có xu hướng tăng dần pha I pha II Tuy nhiên, có sử dụng tác nhân sốc muối, hàm lượng astaxanthin/tế bào tăng ñột biến Sau ngày sốc muối, hàm lượng sắc tố astaxanthin tăng từ pg/TB lên 37 pg/TB Hàm lượng lipid tổng số tảo pha I có xu hướng tăng nhẹ từ 13,54 ± 0,23% TLK ngày ñến 14,92 ± 0,34% TLK ngày thứ 10 Sau chuyển tảo sang pha II ñiều kiện sốc muối, hàm lượng lipid tổng số tăng nhanh, từ 14,92 ± 0,34% TLK lên 17,14 ± 0,26% TLK sau ngày 14 ngày 18 ngày 22 Đối chứng Thí nghiệm Hình 11 Hình thái tế bào tảo H pluvialis chụp kính hiển vi quang học (hàng trên) kính hiển vi huỳnh quang sau nhuộm Nile Red (hàng dưới) (độ phóng đại 1000 lần) cơng thức đối chứng cơng thức 0,8% NaCl bình tam giác 250 mL Sự thay đổi hàm lượng lipid bên tế bào tảo H pluvialis ñược phát nhanh phương pháp nhuộm tế bào Nile Red Chất nhuộm Nile Red ñi qua màng tế bào liên kết với thể lipid trung tính nội bào phát huỳnh quang màu vàng ñược chiếu ánh sáng huỳnh quang dải bước sóng từ 450-490 nm (hình 11) Kết hình 11 218 cho thấy, cơng thức ñối chứng, thể lipid nhỏ, tập trung mép tế bào, thể qua thể bắt màu vàng Trong đó, cơng thức thí nghiệm, thể lipid to tập trung bên tế bào vùng quanh nhân, bắt màu vàng ñậm Tuy nhiên, tiến hành sốc muối nồng ñộ 0,8% NaCl q trình carotenoid hóa diễn TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(2): 213-223 chậm, tế bào chuyển sang giai đoạn bào xác nhanh q trình tích lũy astaxanthin bên tế bào kéo dài Sau 22 ngày, sắc tố ñỏ tế bào H pluvialis cơng thức thí nghiệm sốc muối tập trung quanh vùng nhân Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Sarada et al (2002) [20] ñã công bố Tác giả ñã rằng, thời gian ni giống ban đầu (tuổi tảo) yếu tố định khởi động q trình sinh tổng hợp astaxanthin mẫu cảm ứng sốc muối Khi dịch tảo hoạt hóa (4-8 ngày ni) mẫn cảm với NaCl, đó, dịch tảo ni trước 12-16 ngày có khả chống chịu tốt với sốc muối vậy, thời gian tích lũy astaxanthin kéo dài ñến 20 ngày 450 M ật ñ ộ tế b (x 10 T B /m l) Hàm lượng chlorophyll a (µg/L) 25 20 15 10 Thời gian (ngày) Đ/C 1,5% NaCl 10 2,5% NaCl 350 300 250 200 15 45 25 Thời gian (ngày) Đ/C 10 1,5% NaCl 15 2,5% NaCl Thời gian (ngày) 1,5% NaCl Đ/C 10 15 2,5% NaCl Hình 13 Sự thay ñổi hàm lượng chl a tảo H pluvialis nồng ñộ sốc muối khác H m lư ợng lipid tổ ng số (% / T L K ) Hình 12 Sự thay đổi mật độ tế bào tảo H pluvialis nồng ñộ NaCl khác Hàm lượng astaxanthin (pg/TB) 400 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 Thời gian (ngày) Đ/C 10 1,5% NaCl 15 2,5% NaCl Hình 14 Sự thay ñổi hàm lượng astaxanthin tảo H pluvialis nồng độ sốc muối khác Hình 15 Sự thay ñổi hàm lượng lipid tổng số tảo H pluvialis nồng ñộ sốc muối khác Cũng theo tác giả Sarada et al (2002) [20], sốc muối tảo H pluvialis cần có chu kỳ cảm ứng dài kết hợp với nhiều tác nhân cảm ứng khác tích lũy lượng lớn carotenoid bên tế bào Để làm rõ vấn ñề này, chúng tơi tiến hành thí nghiệm sốc muối lần với nồng ñộ muối cảm ứng 1,5 2,5% kết hợp với nhiệt ñộ cao (> 30oC) Kết thí nghiệm trình bày hình 12, 13, 14 15 tế bào dạng sinh dưỡng sang dạng bào xác sau 15 ngày ni Trong đó, giá trị mật độ tế bào mơi trường có bổ sung NaCl với nồng ñộ khác lại có xu hướng giảm rõ rệt, đặc biệt nồng ñộ muối 2,5% Sau 15 ngày, mật ñộ tế bào công thức giảm lần so với giá trị ban đầu, từ 33 × 104 xuống 14 × 104 TB/ ml, tế bào trạng thái bào xác tích lũy lượng lớn astaxanthin bên tế bào Tuy nhiên, tế bào bị dần sắc tố bị chết ni nồng độ muối cao thời gian dài Kết hình 12 cho thấy, mật độ tế bào cơng thức đối chứng tiếp tục tăng, từ 33 × 104 lên 47 × 104 TB/ml khơng quan sát thấy có thay đổi trạng thái tế bào từ Khi sử dụng nồng ñộ muối cao kết hợp với nhiệt độ cao q trình chuyển giai ñoạn từ tế 219 Luu Thi Tam et al bào sinh dưỡng sang tế bào dạng bào xác diễn nhanh vòng Đến ngày thứ 5, quan sát thấy dịch tảo chuyển sang màu nâu đỏ tích lũy lượng lớn sắc tố ñỏ bên tế bào chúng Kết thay ñổi hàm lượng sắc tố (chlorophyll a astaxanthin) trình bày hình 13 hình 14 Hàm lượng chlorophyll a cơng thức có xu hướng tăng sau ngày ni, sau hàm lượng giảm dần sau 15 ngày sốc muối (hình 13) Riêng cơng thức đối chứng, giai đoạn từ ngày thứ 10 ñến 15, hàm lượng chlorophyll a giảm mật ñộ tế bào tăng Điều giải thích giảm hàm lượng chlorophyll a tế bào tảo Đối chứng 1,5% NaCl 2,5% NaCl H pluvialis lớn so với tăng mật độ Ngồi ra, hàm lượng chlorophyll b tăng cao trường hợp nên tảo tăng mật ñộ tế bào Ngược lại, với xu hướng thay ñổi chlorophyll a, hàm lượng astaxanthin tế bào tảo H pluvialis tăng mạnh, từ 10 pg/TB ngày thứ lên 39 48 pg/TB ngày thứ 15, tương ứng với công thức nồng ñộ muối 1,5% 2,5%, Ở nồng ñộ muối 2,5%, tảo chuyển sang giai ñoạn bào xác sớm, vòng ngày Như vậy, kết hợp nồng ñộ muối cao nhiệt ñộ cao nhân tố giới hạn, giúp tảo H pluvialis chuyển pha nhanh cảm ứng tích lũy lượng lớn astaxanthin bên tế bào ngày 24 10 ngày 15 ngày 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm 10µm Hình 16 Hình thái tế bào tảo H pluvialis chụp kính hiển vi quang học (hàng trên) kính hiển vi huỳnh quang sau nhuộm Nile Red (hàng dưới) (độ phóng đại 1000 lần) cơng thức đối chứng, cơng thức 1,5 2,5% NaCl bình tam giác 500 1000 ml 220 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(2): 213-223 Sự tích lũy astaxanthin tế bào H pluvialis ñiều kiện sốc muối ñã ñược trình bày nghiên cứu Boussiba & Vonshak (1991), Cifuentes et al (2003), Kobayashi et al (1997) [3, 5, 12] Mặc dù thí nghiệm chúng tơi ñược tiến hành dựa theo công bố Cifuentes et al (2003) [5] nồng độ NaCl thích hợp ñể kích thích tích lũy astaxanthin chủng tảo H pluvialis Flotow mà chúng tơi phân lập Hòa Bình cao so với kết nghiên cứu tác giả cơng bố (2,5% NaCl so với 0,8% NaCl) Vì vậy, việc áp dụng phương pháp nghiên cứu khác ñối với chủng tảo ñịa phương nên ñược cải biến hợp lý ñể thu ñược kết tốt tin cậy Golyal (2007) [8] ñã sốc muối nguyên nhân gây tăng hàm lượng lipid nội bào glycerol tảo Dunaliella tertiolecta Trong thí nghiệm này, chúng tơi tìm hiểu mối liên hệ trình chuyển pha tế bào từ sinh dưỡng sang giai đoạn bào xác, tích lũy astaxanthin q trình tích lũy lipid tổng số bên tế bào Kết thay ñổi hàm lượng lipid tổng số tảo H pluvialis nồng ñộ NaCl khác trình bày hình 15 Kết hình 15 cho thấy, q trình tích lũy lipid tổng số astaxanthin xảy ñồng thời Ở cơng thức đối chứng cơng thức có nồng ñộ muối 1,5%, hàm lượng lipid tổng số dao ñộng khoảng 15 ± 0,35% - 19 ± 1,3% TLK khơng có khác biệt nhiều ngày nuôi Ngược lại, hàm lượng tăng mạnh công thức có nồng độ muối 2,5% (tăng từ 15 ± 0,35% lên 26 ± 0,12% TLK) sau 10 ngày sốc muối Tuy nhiên, kéo dài thời gian sốc muối lên 15 ngày hàm lượng lipid tổng số lại giảm Điều tảo bị chết ni nồng độ muối cao, dẫn tới hàm lượng lipid tổng số trọng lượng khô tế bào giảm Hình 16 cho thấy, thể lipid tập trung nhiều vùng màng xung quanh tế bào có kích thước khơng Tuy nhiên, nhuộm tế bào H pluvialis chúng tơi nhận thấy, mức độ bắt màu vàng với chất nhuộm Nile Red tăng dần tế bào chuyển sang giai ñoạn bào xác bắt đầu tích lũy astaxanthin, sau giảm dần tế bào chuyển sang dạng bào xác hoàn toàn Điều gợi ý rằng, q trình chuyển pha sang giai ñoạn bào xác, thành phần lipid có biến đổi lượng triacylglycerol, phospholipid cholesterol Kết tương ñồng với kết ñịnh lượng lipid tổng số theo phương pháp Bligh & Dyer (1959) [1] KẾT LUẬN Nồng ñộ muối NaCl có ảnh hưởng rõ rệt lên sinh trưởng khả tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis Nồng độ muối 0,6- 0,8% kìm hãm sinh trưởng kích thích tảo tích lũy astaxanthin Việc bổ sung NaCl 0,8% vào mơi trường ni pha II quy trình nuôi cấy pha tảo H pluvialis tác nhân để cảm ứng tích tích lũy astaxanthin cho hiệu không cao Thời gian chuyển pha từ tế bào sinh dưỡng sang dạng bào xác kéo dài 20 ngày Khi tăng nồng ñộ NaCl lên 2,5% kết hợp với nhiệt độ cao kích thích tảo chuyển sang giai đoạn bào xác nhanh (trong vòng giờ) bắt đầu tích lũy astaxanthin Ở nồng ñộ muối 2,5%, hàm lượng astaxanthin tăng từ 10 pg/TB lên 48 pg/TB sau 15 ngày sốc muối Kết thu liệu có giá trị khoa học bước ñầu phục vụ cho nghiên cứu quy trình ni cấy hai pha để thu ñược sinh khối tảo H pluvialis giàu astaxanthin Quá trình tích lũy astaxanthin lipid tổng số tảo H pluvialis xảy đồng thời với q trình chuyển trạng thái tế bào từ sinh dưỡng sang dạng bào xác Ở cơng thức đối chứng cơng thức có nồng ñộ NaCl 1,5%, hàm lượng lipid tổng số dao ñộng từ 15 ± 0,35% ñến 19 ± 1,3% trọng lượng khơ Khi tăng nồng độ NaCl lên 2,5%, lipid tổng số ñạt giá trị cao 26 ± 0,12% trọng lượng khô sau 10 ngày Lời cảm ơn: Cơng trình hỗ trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi vi tảo Haematococcus pluvialis công nghệ chiết xuất astaxanthin” Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn thuộc Chương trình Cơng nghệ sinh học thủy sản năm 2010-2012 cho Phòng Cơng nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Bligh E G and Dyer W J., 1959 A rapid 221 Luu Thi Tam et al method of total lipid extraction and purification Can J Biochem Physiol., 37: 911-917 Boussiba S., Bing W., Yuan J-P., Zarka A and Chen F., 1999 Changes in pigments profile in the green alga Haeamtococcus pluvialis exposed to environmental stresses Biotechnol Lett., 21: 601-604 Boussiba S and Vonshak A., 1991 Astaxanthin accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis Plant Cell Physiol., 32: 1077-1082 Cerón M C., García-Malea M C., Rivas J., Acien F G., Fernández J M., Del Río E., Guerrero M G and Molina E., 2007 Antioxidant activity of Haematococcus pluvialis cells grown in continuous culture as a function of their carotenoid and fatty acid content Appl Microbiol Biotechnol., 74: 1112-1119 Cifuentes A S., González M A., Vargas S., Hoeneisen M and González N., 2003 Optimization of biomass, total carotenoids and astaxanthin production in Haematococcus pluvialis Flotow strain Steptoe (Necada, USA) under laboratory conditions Biol Res., 36: 343-357 Doan T T Y., Obbard J P., 2011 Improved Nile Red staining of Nannochloropsis sp J Appl Phycol., 23(50): 895-901 Fábregas J., Domínguez A., Álvarez D G., Lamela T and Otero A., 1998 Induction of astaxanthin accumulation by nitrogen and magnesium deficiencies in Haematococcus pluvialis Biotechnol Lett., 20(6): 623-626 Goyal A., 2007 Osmoregulation in Dunaliella II Photosynthesis and starch contribute carbon for glycerol synthesis during a salt stress in Dunaliella tertiolecta Plant Physiol Biochem., 45:705-710 Đinh Đức Hoàng, Lưu Thị Tâm, Nguyễn Thị Thu Thủy, Đặng Diễm Hồng, 2011 Nghiên cứu thay đổi hình thái tế bào, hàm lượng sắc tố protein nội bào vòng ñời vi tảo lục Haematococcus pluvialis nuôi cấy điều kiện phòng thí nghiệm Tạp chí Sinh học, 33(1): 59-66 222 10 Đặng Diễm Hồng, Đinh Đức Hoàng, Nguyễn Thị Thủy, Hồng Thị Lan Anh, 2010 Lựa chọn mơi trường tối ưu để ni trồng vi tảo lục Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin Tạp chí Sinh học, 32(2): 43-53 11 Kang C D., Lee J S., Park T H., Sim S J., 2005 Comparison of heterotrophic and photoautotrophic induction on astaxanthin production by Haematococcus pluvialis Appl Microbiol Biotechnol., 68: 237-241 12 Kobayashi M., Kurimura Y., Tsuji Y., 1997 Light independent, astaxanthin production by the green microalga Haematococcus pluvialis under salt stress Biotechnol Lett., 19: 507-509 13 Lorenz R T., Cysewski G R., 2000 Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin TibTech, 18: 160-167 14 Lowry O H., Rosebrough N J., Farr A L and Randall R J., 1991 Protein measurement with the folin phenol reagent J Biol Chem., 193: 265-275 15 Manny B A., 1969 The relationship between organic nitrogen and the carotenoid to chlorophyll a ratio in five freshwater phytoplankton species American Society of Limnology and Oceanography, 11 pages 16 Mendoza H., Martel A M., Jiménez del Río M and García Reina G., 1999 Oleic acid is the main fatty acid related with carotenogenesis in Dunaliella salina J Appl Phycol., 11: 15-19 17 Miki W., 1991 Biological functions and activities of animal carotenoids Pure Appl Chem., 63: 141-146 18 Olaizola M., 2000 Commercial production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using 25,000-liter outdoor photobioreactors J Appl Phycol., 12: 499-506 19 Rabbani S., Beyer P., Lintig J., Philippe H and Kleinig H., 1998 Induced β-Carotene synthesis driven by triacylglycerol deposition in the unicellular alga Dunaliella bardawil Plant Physiol., 116: 1239-1248 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(2): 213-223 20 Sarada R., Tripayhi U., Ravishankar G A., 2002 Influence of stress on astaxanthin production in Haematococcus pluvialis grown under different culture conditions Process Biochem., 37: 623-627 21 Strickland J D H., Parsons T R., 1972 A manual of seawater analysis Bull Fish Res Bd Can., 125, 310 p 22 Ngơ Thị Hồi Thu, Lưu Thị Tâm, Đặng Diễm Hồng, 2008 Một số đặc điểm sinh học lồi vi tảo biển Isochrysis galbana Nannochloropsis oculata phân lập Việt Nam ñược sử dụng làm thức ăn tươi sống cho ni trồng thủy sản Tạp chí Hóa học, 46(5A): 98-104 23 Tjahjono A E., Kakizono T., Hayama Y., Nishio N and Nagai S., 1994 Isolation of resistant mutants against carotenoid biosynthesis inhibitors for a green alga Haematococcus pluvialis and their hybrid formation by protoplast fusion for breeding of higher astaxanthin producers J Ferment Bioeng., 77(4): 352-357 24 Yuan J P., Chen F., 2000 Purification of trans-astaxanthin from a high-yielding astaxanthin ester-producing strain of the microalga Haematococcus pluvialis Food Chem, 68: 443-448 25 Zhekisheva M., Boussiba S., KhozinGoldberg I., Zarka A., Cohen Z., 2002 Accumulation of oleic acid in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) under nitrogen starvation or high light is correlated with that of astaxanthin esters J Phycol., 38: 325-331 26 Zhekisheva M., Zarka A., Khozin-Goldberg I., Cohen Z., Boussiba S., 2005 Inhibition of astaxanthin synthesis under high irradiance does not abolish triacylglycerol accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) J Phycol., 41: 819-826 STUDY ON THE EFFECT OF SALT CONCENTRATION ON GROWTH AND ASTAXANTHIN ACCUMULATION OF MICROALGAE HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS AS THE INITIAL BASIS FOR TWO PHASE CULTURE OF ASTAXANTHIN PRODUCTION Luu Thi Tam, Dinh Duc Hoang, Dinh Thi Ngoc Mai, Ngo Thi Hoai Thu, Hoang Thi Lan Anh, Dang Diem Hong Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Microalga Haematococcus pluvialis Flotow is one of the natural sources of astaxanthin, a pigment widely used in aquaculture, food, pharmaceutical and nutraceutical industries In the present study, we investigated the effect of high NaCl concentrations on growth and astaxanthin accumulation in the microalga Growth was observed under different salt concentrations (0.8%, 1.5% and 2.5% NaCl) according to two - phase culture mode The obtained results have indicated that the high NaCl concentrations caused an increase in carotenoid content per cell and a decrease in the algal growth The best carotenogenic condition by addition of salt was obtained at 2.5% NaCl under high temperature Astaxanthin content per cell increased 4.8 folds in comparison to the initial value, from 10 pg.cell-1 to 48 pg.cell-1 after 15 days of salt stress We observed that the accumulation of total lipid content was correlated with an increasing in astaxanthin content The total lipid content of control was 15 ± 0,35% of dry cell weight whereas that of cell exposed to salt stress was 19% ± 1,3% and 26 ± 0.12% at 1.5% and 2.5% NaCl concentrations, respectively This study will be an initial basis for the two phase culture process to obtain astaxanthin rich Haematococcus pluvialis biomass Keywords: Astaxanthin accumulation, Haematococcus pluvialis, salt stress, total lipid, two phase culture Ngày nhận bài: 14-2-2012 223 ... Tam et al H pluvialis ñang bắt đầu với số nghiên cứu cơng bố [9, 10] Trong báo này, ảnh hưởng nồng độ muối lên sinh trưởng khả tích lũy astaxanthin vi tảo H pluvialis ñã ñược nghiên cứu Các kết... dụng nồng độ muối để nghiên cứu tiếp ảnh hưởng 21 4 chúng lên khả tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis Thí nghiệm thực theo quy trình ni cấy pha: pha I tảo ni điều kiện tối ưu, kích thích tảo sinh. .. hưởng lên sinh trưởng khả tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis Ở nồng ñộ NaCl thấp (0 ,2 0,4%), sinh trưởng tảo chưa bị ảnh hưởng nhiều Tuy nhiên, tăng nồng ñộ muối lên 0,6 0,8%, sinh trưởng tảo