Bài viết trình bày phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của Peptit tái tổ hợp Pep-H nhằm góp phần nghiên cứu các peptit có hoạt tính kháng khuẩn ứng dụng trong Y học.
25(1): 30-34 3-2003 Tạp chí Sinh học Phơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn peptit tái tổ hợp PEP-H lê quang huấn Viện Công nghệ sinh học Trong năm gần đây, kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh ngày gia tăng Nhiều loại thuốc kháng sinh đ nhanh chóng hiệu lực, đồng thời xuất bệnh nhiễm virut mang tính toàn cầu nh HIV, viêm gan B, C, viêm màng n o mối quan tâm đặc biệt quốc gia nh nhà khoa học toàn giới Vì vậy, nhà khoa học không ngừng tìm kiếm loại vacxin mới, loại kháng sinh với chế tác động khác với chế tác động loại kháng sinh thông thờng, đồng thời có hiệu lực kháng khuẩn mạnh đặc hiệu Một hớng nghiên cứu tìm kiếm loại thuốc kháng sinh có chất peptit Ngoài peptit tự nhiên đợc tách chiết từ động thực vật, có peptit tái tổ hợp đợc nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm Để góp phần nghiên cứu peptit có hoạt tÝnh kh¸ng khn øng dơng y häc, thêi gian qua, chúng tối đ tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn peptit tái tổ hợp [2,3, 4] dựa tình tự nucleotit peptit kháng khuẩn đ đợc tìm thấy sam biển Tachypleus tridentatus mà tác giả Nhật Bản đ công bố trớc [5] Trong này, trình bầy phơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn peptit tái tổ hợp PEP-H I phơng pháp nghiên cứu Nguyên liệu Dựa trình tự peptit tachypleusin, peptit máu sam biĨn (horshoe crab: Tachypleus tridentatus) còng nh− tÝnh chÊt cđa amino axít, thiết kế đoạn oligonucleotit có tr×nh tù nh− sau: 5’-AATTCATGAGAAGTGGTGTTATAGAAAGAAACCATATAGAAAATGTAGATGA-3’ 3’-GTACTCTTCTACCACAATATCTTTCTTTGGTATATCTTTTACATCTACTTCGA-5’ Tr×nh tù nucleotit cđa đoạn gien đợc h ng GENSET Singapore Biotech Pte Ltd tổng hợp dới dạng sợi độc lập theo phơng pháp hóa học Chủng vi sinh vật Esherichia coli BL21; Vectơ biểu pMAL-C2; Các hóa chất sử dụng thÝ nghiÖm: IPTG (isopopyl β-Dthiogalactopyranosit) (Sigma), sephadex G-75, sephadex G-25 (Sigma), cột sắc ký lực amyloza resin h ng New England Biolab, maltoza (Sigma), factơ Xa hóa chất sử dụng khác hóa chÊt tinh khiÕt M«i tr−êng nu«i cÊy vi sinh vËt: m«i tr−êng láng LB (2% trypton, 1% yeast extract, 1% NaCl); môi trờng chọn lọc môi trờng LB bổ sung ampixillin nồng độ 100 àg/ml 30 Phơng pháp a) Nu«i cÊy vi khn Chđng vi khn biĨu hiƯn peptit tái tổ hợp E coli BL21 mang gien tái tổ hợp đợc nuôi môi trờng LB đạt OD600 = 0,5, bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 0,3 mM, tiếp tục nuôi lắc (200 vòng/phút) 37oC, thời gian 180 phút b) Tách chiết protein liên kết Từ 300 ml dịch nuôi cấy tế bào, sau cảm ứng giờ, đợc ly tâm với vận tốc 5000 vòng/phút 4oC 20 phút, phần tế bào kết lắng đợc hòa lại 15 ml dung dịch đệm (10 mM Tris-HCl, pH = 8,0; mM EDTA) Sau ®ã, sù thđy giải tế bào đợc thực siêu âm enzym lysozym (100 àg/ml) Lấy ml dịch thủy giải tế bào đa lên cột lực amyloza resin Sau rửa cột với 15 ml dung dịch đệm (20 mM Tris-HCl, pH = 8,0, mM EDTA, 200 mM NaCl), protein liên kết đợc giải hấp với dung dịch ®Ưm trªn cã bỉ sung maltoza (20 mM Tris-HCl, pH = 8,0, mM EDTA, 200 mM NaCl, 10 mM maltoza) Thu 10 phân đoạn sau cho dung dịch giải hấp, phân đoạn ml Xác định phân đoạn chứa protein liên kết, xử lý với factơ Xa để tách protein MalE peptit tái tổ hợp Protein liên kết đợc cắt factơ Xa ®Ưm TE cã bỉ sung 20 mM CaCl2 ë nhiƯt ®é 23oC, thêi gian 16 giê Sau ®ã dÞch protein đ cắt factơ Xa đợc sác ký lực qua cột amyloza resin (cột sắc ký ì cm) Thu phân đoạn (10 phân đoạn, 300 àl/phân đoạn) sau cho dung dịch protein Hoạt tính kháng khuẩn peptit phân đoạn đợc kiểm tra theo phơng pháp vòng kháng khuẩn c) Xác định hoạt tính kháng khuẩn peptit Các chủng vi khn sư dơng phÐp thư: E coli DH-5α vµ Pseudomonas aeruginosa Môi trờng hóa chất: - Trypticaza soy broth (TBS, Difco, Detroit, MI): hßa 30 g TBS lit n−íc cÊt khư ion (dH2O), khư trïng 20 phút nhiệt dộ 121oC, bảo quản nhiệt độ phòng - Đệm phốtphát: dung dịch stock (100 mM), hòa riªng biƯt 15,6 g NaH2PO4.2.H2O; 26,8 g Na2HPO4.7.H2O lit dH2O Pha dung dịch đệm phốtphát (100 mM) có pH 7,4 6,5 cách trộn hai dung dịch theo tỷ lệ định đạt pH mong muốn Khử trùng lọc qua màng lọc (0,45àm), bảo quản nhiệt độ phòng - Agaroza (sigma): sử dụng agaroza để hạn chế tới mức tối thiểu tơng tác peptit mang điện tích dơng với agar điều cần thiết xác định hoạt tÝnh kh¸ng khn cđa peptit - Líp gel d−íi: trộn 50 ml đệm phốtphát 100 mM với ml TSB, thêm g agaroza, thêm dH2O đủ 500 ml, chØnh pH = 7,4 hc 6,5 b»ng 1N NaOH hc HCl Khử trùng Bảo quản nhiệt độ phòng Trớc sử dụng, làm nóng chảy lò vi sãng hc bĨ n−íc nãng 42oC - Líp gel trên: hòa tan 60 g trypticaza soy broth (sigma) vµ 10 g agaroza lit dH2O Khư trïng bảo quản nhiệt độ phòng Trớc sử dụng, làm nóng chảy lò vi sóng bể nớc nóng 420C - Dung dịch 10 mM phốtphát, pH = 7,4 đợc chuẩn bị từ dung dịch 100 mM, khử trùng bảo quản nhiệt độ phòng Dung dịch đệm đợc làm lạnh trớc rửa tế bào Quy trình thử nghiệm: Cấy chuyển khuẩn lạc vào 50 ml TSB, nuôi lắc (200 vòng/phút), 37oC, 18-24 Cấy chuyển 50 àl (đối với tế bào E.coli) vào 50 ml môi trờng TSB nuôi tiếp 2,30 37oC máy lắc Ly tâm thu tế bào: 400 vòng/phút, 10 phút 4oC Rửa tế bào với 10 ml dung dịch đệm phốtphát (pH = 7,4) đ làm lạnh, ly tâm thu tế bào nh bớc Sau hòa lại tế bào ml dung dịch đệm phốtphát (pH = 7,4) đ làm lạnh Lấy ml dịch tế bào vừa thu đợc đo phổ hấp thụ Kết xác định OD620 cho phép tính toán pha phần dịch tế bào lại (4 ml) tới nồng độ 4.106 CFU (công thức tÝnh nh− sau: CFU/ml= OD620 × 2,5.108) LÊy 10 ml dung dịch gel dới cho vào ống ly tâm dung tÝch 15 ml vµ bỉ sung 4.106 CFU, vortex 15 giây, đổ lên đĩa petri, để gel đông chặt khoảng phút Đặt đĩa lên tờ giấy kẻ ôly đục giếng theo số lợng: ì ì Cho àl mẫu peptit cần thử nghiệm vào giếng đ đục (peptit đợc pha 0,01% axít axetic) Đậy đĩa petri nuôi 37oC Bổ sung thêm 10 ml lớp gel giầu dinh dỡng vào đĩa; sau gel đông chặt đậy đĩa petri nuôi tiếp qua đêm 37oC 10 Sáng hôm sau, bổ sung 10 ml dung dịch tẩy lên bề mặt đĩa (dung dịch tẩy: 5% axit axetic 25% metanol); sau 20 phút, xác định bán kính vòng kháng khuẩn II Kết thảo luận Thiết kế vectơ mang gien peptit tái tổ hợp 31 Gien tổng hợp sau đợc gắn vào vectơ pMAL-C2 nhờ enzym giới hạn E.CoR1 HindIII, đợc biến nạp vào chủng vi khuẩn E coli DH5 chọn lọc môi trờng LB chứa ampixillin (100 àg/ml) Để kiểm tra kết biến nạp, đ tiến hành tách chiÕt ADN cña plasmit pMAL1 C2 mang gien peptit tái tổ hợp cắt ADN plasmit enzym giới hạn E.CoR1 Hind III, sau kiểm tra điện di gel polyacrylamit Kết điện di đồ thu đợc băng ADN, băng tơng ứng với ADN có trọng lợng phân tử lớn băng có trọng lợng phân tử tơng ứng với trọng lợng phân tử đoạn oligonucleotit tổng hợp (hình 1) Đoạn ADN sau cắt enzym Đoạn oligonucleotit tổng hợp Hình Kết điện di ADN plasmit sau cắt enzym E.CoR I Hind III Các giếng 1, 2, 3: ADN plasmit khuẩn lạc sau xử lý với E.CoR I Hind III Các giếng 4, 5: Đoạn oligonucleotit tổng hợp Từ kết đây, khẳng định đoạn oligonucleotit tổng hợp đ đợc gắn vào vectơ pMAL-C2 thay cho đoạn polylinker pMAL-C2 Vị trí đoạn oligonucleotit nằm vị trí nhận biết enzym giới hạn E.CoR1 HindIII Biểu gien tái tổ hợp Sau biến nạp vectơ pMAL-C2 mang gien peptit tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn E coli BL21, tế bào vi khuẩn đ biến nạp đợc nuôi cấy môi trờng LB chứa kháng sinh ampixillin (100 àg/ml) đạt nồng độ OD600 = 0,5, bổ sung chất cảm ứng IPTG tới nồng độ cuối 0,3 mM Nuôi tiÕp giê ë 37oC, sau ®ã thu nhËn tế bào tách chiết protein vi khuẩn Kết kiĨm tra sù biĨu hiƯn cđa gien sau c¶m ứng IPTG điện di gel polyacrylamit SDS-PAGE đợc trình bầy hình 43 kDa Hình Điện di đồ protein tế bào vi khuẩn trớc sau cảm ứng IPTG GiÕng 5: Marker protein; C¸c giÕng 1, 3, 6, protein trớc cảm ứng IPTG Các giếng 2, 4, 7, protein sau cảm ứng IPTG 32 Trên hình 2, sau cảm øng b»ng IPTG, ta thÊy l−ỵng protein cã träng l−ỵng phân tử khoảng 43 kDa xuất rõ so với trớc gây cảm ứng Điều có nghĩa gien tái tổ hợp vectơ đ hoạt động mạnh (tổng hợp lợng lớn protein tái tổ hợp) sau bổ sung IPTG vào môi trờng nuôi cấy Tinh chÕ peptit Pha lo ng dịch phá tế bào đệm TE (TE: 50mM Tris-HCl, pH = 7,4, 0,1% EDTA vµ 100 mM NaCl) Sau đó, cho lên cột sắc ký lực với chất amyloza resin, giải hấp đệm TE có bổ sung maltoza Các phân đoạn chứa protein liên kết đợc kiểm tra điện di SDS-PAGE Kết thu đợc băng protein có trọng lợng phân tử khoảng 43 kDa (hình 3) Phân đoạn sau sắc ký lực 43 kDa Hình Điện di đồ phân đoạn thu đợc sắc ký lực amyloza resin Giếng 1: Marker protein Các giếng 2, 3, 4, 5, 6: Protein phân đoạn thu đợc sau bổ sung maltoza Protein liên kết, sau tinh chế cột sắc ký lực, đợc cắt factơ Xa đệm TE có bổ sung 20 mM CaCl2 ë nhiƯt ®é 23oC, thêi gian 16 Sau dịch protein đ cắt factơ Xa đợc sắc ký lực qua cột amyloza resin (cột sắc ký ì cm) Thu phân đoạn (10 phân đoạn, 300 àl/phân đoạn) sau cho dung dịch protein Hoạt tính kháng khuẩn peptit phân đoạn đợc kiểm tra theo phơng pháp vòng kháng khuẩn Kết cho thấy, phân đoạn thứ 4, khả ức chế phát triển vi khuẩn rõ Kết xác định hoạt tính kháng khuẩn peptit theo phơng pháp vòng kháng khuẩn đợc trình bày hình Hình Khả ức chế phát triển vi khuẩn gram dơng Bacillus subtilis Giếng 4: phân đoạn sau sắc ký lc có ức chế Bacillus subtilis Các giếng 1, 2, 3, 5: Các phân đoạn 1, 2, 4, sau sắc ký lực hoạt tính 33 iii Kết luận nói riêng, peptit nói chung Đoạn oligonucleotit tổng hợp m hóa cho peptit tái tổ hợp đ đợc gắn vào vectơ pMAL-C2 điểm nhận biết enzym giới hạn ECoR1 HindIII biểu hiƯn tèt tÕ bµo vi khn E coli BL21 Protein liên kết đợc tế bào vi khuẩn E.coli BL21tổng hợp với lợng lớn sau cảm ứng IPTG thu đợc protein cần bớc tinh chế cột lực amyloza resin Đ xây dựng đợc phơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn thích hợp, có độ nhạy cần thiết để xác định hoạt tính peptit tái tổ hợp tài liƯu tham kh¶o Bechinge B., Zasloff M., Opella Sj., 1993: Protein Sci., 2(12): 2077-2084 Birney M H and Penney D G., 1990: Heart Lung, 19(2): 174-183 Blondelle S E., 1995: J Appl Bacteriol , 78: 39-46 Boma H G., 1995: Annu Rev Immun., 13: 61-92 Nakamura T et al., 1998: J Biol Chem., 263: 16709-16713 method for detection of the antimicrobial activity of the recombinantial peptide PEP-H le quang huan summary The gene encoding the recombinant peptide has been synthesized by chemical method and it was sucessfully expressed in E coli The new method was developed for detection of the antimicrobial activities of the pure recombinant peptide which after has been purified on affinity chromatography and cleaved by the factor Xa Ngµy nhËn bµi: 14-1-2002 34 ... protein Hoạt tính kháng khuẩn peptit phân đoạn đợc kiểm tra theo phơng pháp vòng kháng khuẩn Kết cho thấy, phân đoạn thứ 4, khả ức chế phát triển vi khuẩn rõ Kết xác định hoạt tính kháng khuẩn peptit. .. cột lực amyloza resin Đ xây dựng đợc phơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn thích hợp, có độ nhạy cần thiết để xác định hoạt tính peptit tái tổ hợp tài liệu tham khảo Bechinge B., Zasloff... àl/phân đoạn) sau cho dung dịch protein Hoạt tính kháng khuẩn peptit phân đoạn đợc kiểm tra theo phơng pháp vòng kháng khuẩn c) Xác định hoạt tính kháng khuẩn peptit Các chđng vi khn sư dơng phÐp