Sắc í l ĩ thuật dùng để phân tách các hợp phần khác nhau của hỗn hợp, dựa trên sự di chuyển hác nhau trong pha động của các chất hòa tan trong hỗn hợp. Quá trình chung của sắc kí Cột sắc kí chuẩn bị với mẫu cần phân tách, giá thể được cân bằng với dung dịch đệm. Mẫu phân tử sinh học được hòa vào dung dịch đệm v được đưa qua cột Dòng dung dịch đệm được bơm qua cột, mẫu sẽ được đẩy ra khỏi cột theo từng giai đoạn. Sắc kí lọc gel sử dụng giá thể là các hạt gel, sự phân tách dựa trên ích thước phân tử. Nguyên tắc: Sự tách biệt các phân tử protein dựa trên sự khác nhau về ích thước, khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo cột ch a các hạt gel có ích thước lỗ quy định theo cơ chế thẩm thấu, dẫn đến sự khuyếch tán chọn lọc. Cấu tạo: Pha tĩnh l một cột ch a các hạt gel. Pha động ch a dung môi chuyển động. Một đầu dò được gắn v o điểm cuối của cột. Được làm từ polime hay cacbonhidrate có tí
I. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) a. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa vào sự thủy giải CMC bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH = 5 và 40oC. Sau p hản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với acid 3,5 – dinitrosalicylic (DNS), màu san phản ứng được xác định bằng đo mật độ quang ở bước sóng 540nm. Định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol/ phút dưới các điều kiện thực nghiệm. b. Hóa chất: - Dung dịch cơ chất (1%W/V CMC): cân chính xác 1g CMC, hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Na – acetate 50 mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch và lắc đều. - Dung dịch acid 3,5 – dinitrosalicylic: cân 10g DNS cho vào becher 1000 ml, thêm khoảng 400 ml nước cất, đặt becher trong chậu nước 80oC và khuấy đều. Thêm dung dịch NaOH (16g NaOH trong 150ml nước cất), từ từ vào d ung dịch DNS, khuấy ở 180oC. Tiếp tục thêm 300g potassium sodium tartrate tetrhydate vào d ung dịch DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 80oC. Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng. Chuyển duch dịch vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. Bảo quản dung dịch trong chai màu nâu có nắp. - Dung dịch lactose: hòa tan 0.12 g lactose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. - Dung dịch DNS – lactose: trộn đều 150ml DNS với 50 ml dung dịch lactose. - Dung dịch enzyme: Pha loãng dung dịch enzyme với dung dịch đệm Na – acetate 50mM, pH 5 đến độ pha loãng thích hợp. c. Dựng đường glucose chuẩn - Hoàn tan 100mg glucose monohydrate với 50ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều - Xây dựng đường glucose chuẩn theo bảng sau: Ống số 0 1 2 3 4 5 6 Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 - ml dd CMA 1% 1 1 1 1 1 1 1 -ml dd DNS – lactose 2 2 2 2 2 2 2 -ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 - Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ ở bước sóng 540 nm d. Tiến hành phản ứng - Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm thử thật, thay 1ml dung dịch enzyme bằng 1ml dung dịch Na- acetate 50mM, pH 5 đối với ống thử không. Đặt vào bể ổn nhiệt 40oC/5phu1t. Đồng thời ta cũng đặt lọ chứa dung dịch CMC 1% ở 40oC/5 phút.