Phương pháp xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl callulase

Sắc í l ĩ thuật dùng để phân tách các hợp phần khác nhau của hỗn hợp, dựa trên sự di chuyển hác nhau trong pha động của các chất hòa tan trong hỗn hợp. Quá trình chung của sắc kí Cột sắc kí chuẩn bị với mẫu cần phân tách, giá thể được cân bằng với dung dịch đệm. Mẫu phân tử sinh học được hòa vào dung dịch đệm v được đưa qua cột Dòng dung dịch đệm được bơm qua cột, mẫu sẽ được đẩy ra khỏi cột theo từng giai đoạn. Sắc kí lọc gel sử dụng giá thể là các hạt gel, sự phân tách dựa trên ích thước phân tử. Nguyên tắc: Sự tách biệt các phân tử protein dựa trên sự khác nhau về ích thước, khi hỗn hợp protein di chuyển dọc theo cột ch a các hạt gel có ích thước lỗ quy định theo cơ chế thẩm thấu, dẫn đến sự khuyếch tán chọn lọc. Cấu tạo: Pha tĩnh l một cột ch a các hạt gel. Pha động ch a dung môi chuyển động. Một đầu dò được gắn v o điểm cuối của cột. Được làm từ polime hay cacbonhidrate có tí

I Phương pháp xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase)

a Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự thủy giải CMC bởi enzyme carboxymethyl cellulase ở pH =

5 và 40oC Sau p hản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với acid 3,5 – dinitrosalicylic (DNS), màu san phản ứng được xác định bằng đo mật độ quang ở bước sóng 540nm

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol/ phút dưới các điều kiện thực nghiệm

b Hóa chất:

- Dung dịch cơ chất (1%W/V CMC): cân chính xác 1g CMC, hòa tan trong 80 ml dung dịch đệm Na – acetate 50 mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch và lắc đều

- Dung dịch acid 3,5 – dinitrosalicylic: cân 10g DNS cho vào becher 1000 ml, thêm khoảng 400 ml nước cất, đặt becher trong chậu nước 80oC và khuấy đều Thêm dung dịch NaOH (16g NaOH trong 150ml nước cất), từ từ vào d ung dịch DNS, khuấy

ở 180oC Tiếp tục thêm 300g potassium sodium tartrate tetrhydate vào d ung dịch DNS và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 80oC Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng Chuyển duch dịch vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất đến vạch, lắc đều Bảo quản dung dịch trong chai màu nâu có nắp

- Dung dịch lactose: hòa tan 0.12 g lactose monohydrate với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch, lắc đều

- Dung dịch DNS – lactose: trộn đều 150ml DNS với 50 ml dung dịch lactose

- Dung dịch enzyme: Pha loãng dung dịch enzyme với dung dịch đệm Na – acetate 50mM, pH 5 đến độ pha loãng thích hợp

c Dựng đường glucose chuẩn

- Hoàn tan 100mg glucose monohydrate với 50ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều

- Xây dựng đường glucose chuẩn theo bảng sau:

Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

- ml dd glucose (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

-ml dd DNS – lactose 2 2 2 2 2 2 2 -ml nước cất 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

- Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát So màu trên máy quang phổ ở bước sóng

540 nm

d Tiến hành phản ứng

- Hút 1ml dung dịch enzyme cho vào ống nghiệm thử thật, thay 1ml dung dịch

enzyme bằng 1ml dung dịch Na- acetate 50mM, pH 5 đối với ống thử không Đặt vào

bể ổn nhiệt 40oC/5phu1t Đồng thời ta cũng đặt lọ chứa dung dịch CMC 1% ở 40oC/5 phút

- Thêm 1ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzyme và lắc đều

- Cho phản ứng ở 40oC trong thời gian 10 phút

- Thêm 2ml dung dịch DNS – lactose, lắc đều để ngừng phản ứng enzyme

- Đem đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh đến nhiệt độ phòng trong một chậu nước mát So màu ở bước sóng 540nm dựa theo đường glucose chuẩn

e Tính toán

Giá trị F = (0.1/AG0.1 + CMCase

Sắc ký lọc gel

Khái quát:

Sắc í l ĩ thuật dùng để phân tách các hợp phần khác nhau của hỗn hợp, dựa trên sự

di chuyển hác nhau trong pha động của các chất hòa tan trong hỗn hợp

Quá trình chung của sắc kí

- Cột sắc kí chuẩn bị với mẫu cần phân tách, giá thể được cân bằng với dung dịch

đệm

- Mẫu phân tử sinh học được hòa vào dung dịch đệm v được đưa qua cột

- Dòng dung dịch đệm được bơm qua cột, mẫu sẽ được đẩy ra khỏi cột theo từng

giai đoạn

Sắc kí lọc gel sử dụng giá thể là các hạt gel, sự phân tách dựa trên ích thước phân tử Nguyên tắc:

Sự tách biệt các phân tử protein dựa trên sự khác nhau về ích thước, khi hỗn hợp

protein di chuyển dọc theo cột ch a các hạt gel có ích thước lỗ quy định theo cơ chế thẩm thấu, dẫn đến sự khuyếch tán chọn lọc

Cấu tạo:

- Pha tĩnh l một cột ch a các hạt gel

- Pha động ch a dung môi chuyển động

- Một đầu dò được gắn v o điểm cuối của cột

- Được làm từ polime hay cacbonhidrate có tính trơ, hông hòa tan, hông phản ng

với protein…

- Bề mặt các hạt gel có các lỗ với ích thước xác định

- Được làm từ polime hay cacbonhidrate có tính trơ, hông hòa tan, hông phản ng

với protein…

- Bề mặt các hạt gel có các lỗ với ích thước xác định

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM PROTEIN ENZYME GVHD: TS HUỲNH NGỌC OANH SVTH: NHÓM 3 – BUỔI SÁNG 52

Hình 8 Minh họa phương pháp lọc gel

Các bước tiến hành thí nghiệm:

- Nhồi hạt gel vào cột Dùng ống hút các hạt gel ch a trong dung dịch đệm bảo vệ

nhồi từ từ vào cột để đảm bảo cột gel tạo thành không ch a bọt

- Dùng nước cất rửa sạch đệm bảo vệ gel, sau đó cho đệm Tris-HCl 0.05M qua cột trong 1 gi Kết thúc dùng nút bít cột gel để trên mặt gel vẫn còn khoảng 1cm

chiều cao dung dịch đệm

- Tiến hành cho dung dịch đệm vào cột gel và gở nút bít ra để tiến hành quá trình

chạy sắc ký lọc gel Trong quá trình chạy phải cho đệm vào cột gel để đảm bảo

trên mặt gel trong cột vẫn còn khoảng 1cm chiều cao dung dịch đệm

- Khi quá trình chạy tiến hành thu mẫu ra khỏi cột cho vào ống nghiệm Mỗi ống

nghiệm thu khoảng 3ml (hay 50 giọt)

- Khi thu được 3 ống ch a mẫu thì cho 2ml dịch enzyme thô vào cột gel Quá trình tiếp tục diễn ra và phải đảm bảo trên mặt gel luôn có khoảng 1cm dung dịch (dung dịch enzyme hay đệm)

- Các mẫu trong ống nghiệm được đem đi đo OD ở bước sóng 540nm để xác định mẫu ch a enzyme tinh

- Quá trình chạy sắc ký kết thúc khi có 3 mẫu ở các ống nghiệm kế nhau mà chỉ số

OD hông đổi

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM PROTEIN ENZYME GVHD: TS HUỲNH NGỌC OANH SVTH: NHÓM 3 – BUỔI SÁNG 53

2.2.2.4 Điện di

Nguyên tắc của kỹ thuật điện di

Điện di (Electrophoresis) là kỹ thuật phân tích các thành phần trong hỗn hợp dựa vào vận tốc chuyển động khác nhau của các ion trong điện trư ng

Vận tốc chuyển động của các cation tới cathode hay của các anion tới anode phụ

thuộc vào lực tác động của điện trư ng lên các ion mang điện và phụ thuộc vào các lực tương tác giữa các phân tử, giữa phân tử với môi trư ng, mà chủ yếu là lực ma sát và lực tương tác tĩnh điện

Rất nhiều hợp chất sinh học ch a các nhóm có khả năng ion hóa ví dụ như axit

amin, peptit, protein, nucleotit, cacbohydrat v.v trong dung dịch chúng có thể tồn tại ở dạng tích điện, hoặc là cation hoặc anion Đa số các phân tử sinh học là các chất điện

ly lưỡng cực Dấu điện tích của phân tử phụ thuộc vào pH Mặt khác có nhiều chất mặc dù mang điện tích phân tử gần giống nhau hay thậm chí có điện tích bằng nhau, nhưng do hác nhau về trọng lượng phân tử, nên có giá trị tương quan tỷ lệ giữa điện tích phân tử và trọng lượng phân tử (q/M) khác nhau Vì vậy mà vận tốc chuyển động trong điện trư ng của mỗi phân tử tích điện là không giống nhau Đó chính l cơ sở của kỹ thuật điện di, phân tách riêng các cấu tử trong điện trư ng do sự khác biệt về điện tích và phân tử lượng

Tiến hành:

- Mẫu dung dịch được hòa tan trực tiếp trong dung môi pha mẫu tỉ lệ 1:1 về thể tích giữa mẫu và dung môi pha mẫu sao cho có nồng độ protein khoảng 1 mg/ml đun sôi cách thủy 5 phút, để nguội mới cho vào các giếng của gel

- Chuẩn bị gel phân tách

- Tạo khuôn bản gel

Gel polyacrylamide thư ng đặt đ ng để chế gel cần sử dụng các tấm thủy tinh cho có kết cấu chuyên dụng kể làm khuôn

Rửa sạch các tấm thủy tinh kỹ bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằng ethanol Táp các tấm thủy tinh được bịt ín ba phía để không làm chảy nguyên liệu tạo gel khi rót vào

Trước tiên đặt tấm thủy tinh nguyên, đặt các thanh cách dcoj theo mép tấm thủy tinh đó,

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM PROTEIN ENZYME GVHD: TS HUỲNH NGỌC OANH SVTH: NHÓM 3 – BUỔI SÁNG 54

rồi đặt tấm thủy tinh có tai lên trên sao cho các cạnh của hai tấm thủy tinh này trùng khít với nhau, dán các mép bên và khe hở đáy bản gel bằng băng eo rồi dùng kẹp để kẹp các tấm thủy tinh (kẹp trước để các tấm thủy tinh ổn dịnh, dán từng cạnh rồi thay kẹp) Bảng 2 Công th c của gel phân tách

Đệm gel phân tách 0.5ml

H2O 1.18ml

Dung dịch Acrylamide 0.3ml

SDS (10%) 20l

Amonium persulfate 1l

Lắc nhẹ cho tan hết

TEMED 4l

- Khi cho TEMED lắc nhẹ cho tan hết sau dó dùng pipette hoặc micropipette bơm

dung dịch gel phân tách vào khoảng hẹp của hai tấm kính (khuôn) mà không tạo bọt khí sao cho m c dung dịch gel cao 8 cm, nhẹ nh ng đặt một lớp nước cất trên lớp gel, cho cho gel c ng

- Chuẩn bị gel gom:

Bảng 3 Công th c của gel gom

Đệm gel gom 0.5ml

H2O 1.18ml

Dung dịch Acrylamide 0.3ml

SDS (10%) 20l

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM PROTEIN ENZYME GVHD: TS HUỲNH NGỌC OANH SVTH: NHÓM 3 – BUỔI SÁNG 55

Amonium persulfate 1l

Lắc nhẹ cho tan hết

TEMED 1l