Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm xác định thành phần dinh dưỡng, dược tính quan trọng các loài nấm. Xác định một số thành phần dược tính quan trọng trong nấm dược liệu, thí nghiệm độc tính bán trường diễn và tác dụng kháng ung thư trên tế bào ung thư máu và ung thư đại trực tràng của loại nấm dược liệu;
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Mã ngành: 94 20 201 HỒ THỊ THU BA THU THẬP TU N CHỌN V N HI N C U QU TR NH NU I TRỒN HAI LOẠI NẤM N V NẤM D C LI U HOAN DẠI TỪ V N THẤT S N AN IAN Cần Thơ 2019 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN NH N D NG TS B I TH MINH DI U Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trƣờng Họp tại:……………………………, Trƣờng Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thƣ viện: Trung tâm Học liệu, Trƣờng Đại học Cần Thơ Thƣ viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Hồ Thị Thu Ba, Trần Nhân Dũng, Trịnh Tam Kiệt Trƣơng Trần Thuận, 2017 Kết nuôi trồng nấm Linh Chi Tầng Ganoderma applanatum phát Tịnh Biên An Giang Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 102-105 Hồ Thị Thu Ba, Trần Nhân Dũng, Trƣơng Trần Thuận, 2018 Khảo sát độc tính bán trƣờng diễn cao chiết từ nấm Thƣợng Hoàng (phellinus sp ) hoang dại chuột nhắt trắng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 50-53 CH N MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết luận án Trong vi sinh vật có ích đƣợc s dụng nhi u, gần gũi với ngƣời phải kể đến nấm Nấm lồi sinh vật nhân thật khơng có chất diệp lục, dị dƣ ng Trong hệ thống phân loại năm giới nấm ếp hàng th ba ngang với th c vật động vật Trần Văn M o, 2004) Công nghệ sản uất giống, nuôi trồng chế biến nấm đƣợc du nhập từ Nhật Bản, Đài Loan nƣớc Châu u Trong trình nghiên c u triển khai sản uất có s thay đổi để phù hợp với u kiện t nhiên Việt Nam Nguyễn Hữu Đống ctv, 2000) Việt Nam nƣớc nơng nghiệp, đồng thời có nhi u u kiện cho việc phát triển ngh trồng nấm, đặc biệt tỉnh phía Nam Với yếu tố nguyên liệu, lao động dồi thời tiết, khí hậu gần nhƣ ổn định quanh năm, nấm đƣợc cung cấp suốt bốn mùa Trung tâm Unesco phổ biến kiến th c văn hóa giáo dục cộng đồng, 2004) Ngồi ra, Việt Nam đất nƣớc nhi u rừng núi với nguồn tài nguyên sinh học đa dạng Vùng Thất Sơn, An Giang khí hậu mát mẻ quanh năm với nhi u loại nấm ăn nấm dƣợc liệu có giá trị nhƣng chƣa đƣợc nghiên c u nuôi trồng Đ ng trƣớc việc thay đổi khí hậu tồn cầu việc bảo tồn nguồn tài ngun quí giá việc cần phải làm Xuất phát từ lý trên, luận án “Thu thập, tuyển chọn nghiên c u quy trình ni trồng hai loại nấm ăn nấm dƣợc liệu hoang dại vùng Thất Sơn, An Giang” đƣợc th c 1.2 Mục tiêu 1.2.1 Mục tiêu chung: Đƣa vào ni trồng lồi nấm ăn lồi nấm dƣợc liệu thu thập hoang dại vùng Thất Sơn, An Giang 1.2.2 Mục tiêu cụ thể: 1) Sƣu tầm số loài nấm lớn vùng Thất Sơn An Giang, u tra mẫu nấm s dụng đƣợc từ ngƣời dân địa phƣơng, định danh mẫu nấm đƣợc chọn theo hình thái bên ngồi; (2) Xác định độc tính cấp, phân lập giữ giống nấm môi trƣờng PDA, định danh phân t lồi nấm khơng ch a độc tính; (3) Xác định thành phần dinh dƣ ng, dƣợc tính quan trọng lồi nấm Xác định số thành phần dƣợc tính quan trọng nấm dƣợc liệu, th nghiệm độc tính bán trƣờng diễn tác dụng kháng ung thƣ tế bào ung thƣ máu ung thƣ đại tr c tràng loại nấm dƣợc liệu; 4) Nghiên c u quy trình cơng nghệ ni trồng hồn chỉnh loại nấm ăn loại nấm dƣợc liệu đƣợc chọn 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Các loài nấm ăn nấm dƣợc liệu hoang dại đ đƣợc ngƣời dân s dụng nhƣng chƣa đƣợc nghiên c u nuôi trồng thu từ vùng rừng núi Thất Sơn, An Giang 1.4 Thời gian địa điểm thí nghiệm Th c từ tháng 10/2013 đến tháng 8/2017 Trƣờng Đại học Cần Thơ 1.5 Những đóng góp luận án Luận án mang tính nghiên c u v hai lồi nấm hoang dại diện địa phƣơng nấm dai Lentinus Squarosolus nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp Trong nấm dai lồi nấm ăn đƣợc nhân giống ni trồng thành cơng từ lồi nấm hoang dại thiên nhiên u hƣớng đến việc bƣớc ây d ng thƣơng hiệu nấm ăn chủng Việt Nam Luận án nuôi trồng thành công nấm Thƣợng Hồng lồi nấm dƣợc liệu có giá trị cao khơng gây độc tính bán trƣờng diễn chuột th nghiệm Đây loài nấm hoang dại đƣợc thu thập, phân lập nghiên c u Đặc biệt nấm Thƣợng Hồng có khả gây c chế s tăng sinh gây chết dòng tế bào ung thƣ đại tr c tràng Đi u h a hẹn ý nghĩa to lớn việc u trị bệnh ung thƣ nói chung bệnh ung thƣ đại tr c tràng nói riêng 1.6 Bố cục luận án Luận án dài 192 trang, gồm phần giới thiệu, tổng quan tài liệu, phƣơng pháp nghiên c u, kết thảo luận, kết luận đ nghị phụ lục Luận án có 56 bảng, 36 hình 178 tài liệu tham khảo Chương PH N PHÁP N HI N C U 3.1 Vật liệu thí nghiệm Giống nấm hoang dại thu thập từ thiên nhiên vùng Thất Sơn, An Giang 3.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu Luận án th c nội dung nghiên c u tổng quát Trong nội dung nghiên c u lớn có nội dung th c nhỏ, tƣơng ng với nội dung chi tiết kèm phƣơng pháp th c Cụ thể đƣợc trình bày phần dƣới 3.2.1 Thu thập số loài nấm lớn vùng rừng núi Thất Sơn An iang Sau tiến hành điều tra khảo sát người dân địa phương tìm loài nấm sử dụng định danh loài nấm 3.2.1.1 Thu thập mẫu nấm lớn Mục đích: Sƣu tầm 20 lồi nấm lớn vùng rừng núi Thất Sơn An Giang, lập sƣu tập giống Định danh sơ d a vào hình thái bên ngồi, với quy trình dành cho u tra nấm thiên nhiên theo chuẩn quốc tế Trịnh Tam Kiệt, 2011; Trịnh Tam Kiệt, 2012; Trịnh Tam Kiệt, 2013) * Chỉ tiêu theo dõi: hình ảnh giá thể nơi phát nấm lớn; phân loại nhóm nấm thu thập đƣợc (nấm đƣợc ếp vào bốn nhóm: Nấm ăn, nấm dƣợc liệu, nấm độc chƣa biết ếp vào đâu) 3.2.1.2 Điều tra khảo sát loài nấm người dân sử dụng Mục đích: Sơ tuyển loại nấm đ đƣợc ngƣời dân địa phƣơng s dụng nhƣng chƣa đƣợc nuôi trồng Việt Nam 3.2.1.3 Định danh theo hình thái mẫu nấm Các mẫu nấm thu thập đƣợc định danh hình thái bên ngồi, với quy trình dành cho u tra nấm thiên nhiên theo chuẩn quốc tế Trịnh Tam Kiệt, 2011; Trịnh Tam Kiệt, 2012; Trịnh Tam Kiệt, 2013) 3.2.2 Xác định độc tính cấp phân lập giải trình tự ITS lồi nấm ăn nấm dược liệu hoang dại không chứa độc tính 3.2.2.1 Xác định độc tính cấp mẫu nấm ăn có giá trị dược liệu chọn từ người dân địa phương Quá trình ác định độc tính cấp đƣợc th c theo quy trình xác định độc tính cấp theo Viện Dƣợc liệu, Bộ Y tế: Phƣơng pháp nghiên c u tác dụng dƣợc lý thuốc từ dƣợc thảo 2006) d a theo phƣơng pháp ác định độc tính cấp thuốc theo Đỗ Trung Đàm (1996) Chọn mẫu không ch a độc tính tiến hành thí nghiệm 3.2.2.2 Phân lập giống nấm khơng chứa độc tính chọn Các mẫu nấm khơng gây độc tính cấp đƣợc phân lập giống khảo sát hệ sợi môi trƣờng thạch PDA - Potato Dextrose Agar Nguyễn Lân Dũng, 2003) 3.2.2.3 Định danh mẫu nấm chọn phương pháp sinh học phân tử 3.2.3 Xác định thành phần dinh dưỡng dược tính độc tính bán trường diễn thử tác động kháng ung thư loài nấm dược liệu dòng tế bào ung thư máu ung thư đại trực tràng Mục đích: tuyển chọn loại nấm ăn có giá trị dinh dƣ ng cao loại nấm dƣợc liệu có dƣợc tính cao Tất thí nghiệm nội dung đƣợc th c Viện Sâm Dƣợc liệu Thành phố Hồ Chí Minh 3.2.3.1 Xác định thành phần dinh dưỡng lồi nấm tuyển chọn Mục đích: Xác định thành phần dinh dƣ ng có lồi nấm đ đƣợc sơ tuyển nội dung Qua đó, tuyển chọn loại nấm ăn lồi nấm dƣợc liệu có dinh dƣ ng cao Cách tiến hành: Định lƣợng thành phần giá trị diện mẫu b ng phƣơng pháp sắc ký mỏng sắc ký lỏng cao áp Xác định hàm lƣợng chất b o, chất đạm, loại vitamin A, thành phần amino acid khoáng vi lƣợng can i, sắt, kẽm, kali 3.2.3.2 Xác định hàm lượng dược tính Mục đích: Xác định thành phần có dƣợc tính hai loài nấm dƣợc liệu đ đƣợc sơ tuyển nội dung Qua đó, tuyển chọn lại loại nấm dƣợc liệu có dƣợc tính cao Cách tiến hành: Định lƣợng thành phần giá trị diện mẫu nhƣ định lƣợng triterpenoid, hàm lƣợng đƣờng kh đƣờng t polysaccharide Chọn loại nấm có hàm lƣợng cao tiến hành đánh giá độc tính bán trƣờng diễn 3.2.3.3 Đánh giá độc tính bán trường diễn nấm Mục tiêu: ác định dòng nấm hoang dại đƣợc tuyển chọn khơng có độc tính bán trƣờng diễn để tiếp tục nghiên c u Cách tiến hành: Xác định tiêu v dinh dƣ ng dƣợc lý theo “Phƣơng pháp nghiên c u tác dụng dƣợc lý thuốc từ Dƣợc thảo” Viện Dƣợc liệu – Bộ Y Tế, 2006) Tuyển chọn loại nấm ăn có giá trị dinh dƣ ng cao lồi nấm dƣợc liệu có dƣợc tính cao Khảo sát độc tính bán trƣờng diễn lồi nấm dƣợc liệu đƣợc tuyển chọn 3.2.3.4 Đánh giá khả ức chế tăng trưởng tế bào ung thư dịch cao chiết nấm Mục tiêu: ác định khả c chế s tăng trƣởng gây chết tế bào ung thƣ máu, ung thƣ đại tr c tràng dịch cao chiết nấm Cách tiến hành: thí nghiệm đƣợc tiến hành đĩa 96 giếng với nồng độ khác dịch cao chiết nấm Đánh giá theo hình thái tế bào ung thƣ sau lý thuốc; khả sống tế bào đƣợc lý với nồng độ khác 3.2.4 Nghiên cứu quy trình cơng nghệ ni trồng hồn ch nh chủng nấm đ tuyển chọn Mẫu nấm đƣợc nhân giống cấp I, cấp II, ni trồng theo quy trình Nguyễn Lân Dũng 2003) Mục tiêu: Hồn thiện quy trình ni trồng loài nấm ăn loài nấm dƣợc liệu đƣợc chọn Cách tiến hành: thí nghiệm với loại môi trƣờng chất khác để tìm mơi trƣờng thích hợp cho q trình sinh trƣởng, phát triển hệ sợi tơ, hình thành thể nhanh hiệu 3.2.4.1 Quy trình cơng nghệ ni trồng nấm ăn a) Thí nghiệm 1: Xác định môi trƣờng cấy chuy n nấm ăn tốt Mục đích: chọn đƣợc mơi trƣờng cấy chuy n hóa giống nấm ăn tốt Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi s lan tơ giống nấm mơi trƣờng độ lan tơ trung bình môi trƣờng 4.1.2 Điều tra khảo sát mẫu nấm chọn Trong 28 mẫu nấm hoang dại thu đƣợc khảo sát thông tin từ ngƣời dân địa phƣơng, có năm mẫu nấm ăn đƣợc s dụng làm dƣợc liệu nấm Linh Chi Tầng , nấm Vân Chi, nấm Thƣợng Hoàng, nấm dai nấm Mộc Bá Huê) 4.1.3 Định danh loài nấm chọn theo hình thái 4.1.3.1 Nấm Linh Chi Tầng Tên địa phƣơng: Linh Chi Tầng Sống thân cây, hệ len lỏi mơ đ chết tƣơi, phát núi Cấm Bào t hình tr ng cụt đầu Hình 4.1: Bào t Nấm Linh Chi Tầng m số 20) Linh Chi Tầng loại nấm có nhi u tầng, thể có hình quạt hay hình tròn, đƣờng kính từ 6-100 cm, dày từ 3-8 cm Nấm khơng có vỏ bóng mặt mũ nấm, không cuống, màu từ nâu dất đến nâu đen, nâu sẫm, vân tăng trƣởng đồng tâm rõ không tạo thành mấu lồi gồ gh mặt mũ nấm Nấm hóa gỗ, hóa sừng, sần sùi tạo nên vẻ cũ kỹ, m p nấm màu đen giống mũ nấm uốn lƣợn chi u dày từ 0,5-1 cm 4.1.3.2 Nấm Vân Chi Tên địa phƣơng nấm Vân Chi Nấm Vân Chi loại nấm không cuống, phát triển bên Khi non thể dạng nhi u u lồi tròn, mọc thành dạng vành với m p tán màu trắng kem Nấm trƣởng thành có dạng 10 giả, chất da hóa gỗ Quả thể hình nan quạt có nhi u vân đồng tâm, chồng chất en kẽ nhƣ ngói lợp, mũ nấm mỏng, phẳng quăn hình bán nguyệt, mọc thành cụm kích thƣớc 40-50 cm Mặt tai nấm khơng có lơng, có vòng màu trắng đục đồng tâm, thịt nấm màu trắng Mặt dƣới nấm có ống nhỏ, ống nhỏ khoảng 4-5 ống/mm Miệng ống tròn hay tròn chƣa thu nhận đƣợc bào t D a đặc điểm hình thái bên ngồi nấm thấy r ng chúng có đặc điểm tƣơng đồng với nấm Vân Chi thuộc chi Trametes đƣợc Trịnh Tam Kiệt 2011) mô tả nấm lớn Việt Nam tập Hình 4.2: Nấm Vân Chi m số 10) 4.1.3.3 Nấm Thượng Hoàng Tên địa phƣơng: nấm Thƣợng Hồng Hình 4.3: Nấm Thƣợng hồng bào t m số 22) Nấm Thƣợng Hoàng sống thân cổ thụ sống, độ cao khoảng đến 10 m Quả thể không cuống với nhi u lớp ống, mô ống màu nâu gỉ sắt, sống đơn độc, dạng 11 thon dài, gỗ m m Mặt trên, nâu sẫm tới đen, có r nh, lớp vỏ c ng màu nâu đậm tới đen, đôi chút n t nẻ tƣơng đối sâu Mặt mũ ban đầu phủ lớp lông măng nhung màu vàng, dần trở nên sẫm màu từ nâu đen tới đen, có nhi u mấu nhỏ, n t thành vùng nhỏ M p mũ từ màu nâu vàng thịt nấm màu nâu gỉ sắt già màu vàng non, thể sinh sản dạng ống, tầng sinh tầng cũ Bào t hình tròn vách dày D a đặc điểm nhận thấy loài tƣơng đồng với loài Phellinus linteus, loài Phellinus igniarius Phellinus lamaensis Theo mơ tả Trịnh Tam Kiệt 2011) kết luận loài thuộc chi Phellinus nhƣng chƣa thể ác định đƣợc tên loài, tạm thời nhận định loài nấm thu thập hoang dại m số 22 loài Phellinus sp 4.1.3.4 Nấm Dai Tên địa phƣơng: nấm Xồi Nấm dai có mũ hình phễu, đƣờng kính 2-15 cm, màu trắng, mặt phủ vẩy dạng lông màu nâu sáng Thịt nấm màu trắng, phiến nấm màu trắng, men dài uống cuống hẹp; cuống lệch, dài 3-5 cm, màu trắng đục, có phủ vẩy nhƣ mũ, khơng có vòng bao gốc Nấm uất vào tháng 3-11 Hình 4.4: Nấm Dai m số 14) bào t Nấm mọc riêng lẻ hay thành cụm lớn thân gỗ hay ồi mục Khi nấm non ăn m m, 12 Khi nấm già ăn dai nên thƣờng nấu lấy nƣớc làm canh ăn Bào t nấm có dạng hình que D a vào đặc điểm v hình thái thể nấm mọc núi Cấm, thấy r ng chúng có đặc điểm tƣơng đồng với loại nấm dai Lentinus squarosolus đƣợc Trịnh Tam Kiệt 2011) mô tả Nấm lớn Việt Nam tập 4.1.3.5 Nấm Mộc Bá Huê Tên địa phƣơng: Mộc Bá Huê Hình 4.5: Nấm Mộc Bá Huê m số 27) Là loài nấm sống rễ cây, thân n m đất, có thân đƣa lên, ung quanh thể nấm màu vàng nghệ hình trái tim, thể có chấm màu đen nhƣ hạt cát, từ thân nấm mọc rễ màu vàng nghệ, chƣa thu nhận đƣợc bào t Đây lồi nấm chƣa có tác giả mơ tả v hình thái bên ngồi nhƣ định danh 4.2 Xác định độc tính cấp phân lập giữ giống nấm môi trường PDA định danh phân tử lồi nấm khơng chứa độc tính 4.2.1 Xác định độc tính cấp mẫu nấm có giá trị chọn từ người dân địa phương Sau 72 th nghiệm li u tối đa, cao chiết nƣớc cao chiết cồn đ u không gây chết chuột Li u s dụng loại cao chiết loại nấm nhƣ bảng sau: Bảng 4.1: Tổng hợp liều tối đa cho chuột uống cao loại nấm 13 Tên nấm Dmax(g) g nấm khô/kg thể trọng chuột Cao chiết nƣớc Cao chiết cồn Cao chiết nƣớc Cao chiết cồn Linh chi tầng 23,41 28,66 137,7 391,9 Thƣợng hoàng 22,86 27,97 134,5 383,4 Vân chi 23,42 28,80 132,9 388,2 Nâm Dai 23,51 29,72 111,1 338,9 Mộc bá huê 23,26 29,27 111,3 332,1 Tiếp tục theo dõi chuột 14 ngày sau dùng cao chiết, không ghi nhận đƣợc triệu ch ng bất thƣờng nào, cho thấy loài nấm khơng gây độc tính cấp chuột th nghiệm Các mẫu nấm đƣợc phân lập để giữ giống 4.2.2 Phân lập loài nấm chọn lọc nội dung 4.2.1 Môi trƣờng PDA đƣợc s dụng để phân lập loại nấm thu đƣợc với u kiện nhiệt độ thời gian Kết cho thấy mơi trƣờng PDA thích hợp để phân lập nấm Linh Chi Tầng, Thƣợng Hoàng, Vân Chi nấm Dai nhƣng không phù hợp để phân lập nấm Mộc Bá H Sau đó, tiến hành giải trình t ITS để định danh loài nấm phân lập đƣợc 4.2.3 iải trình tự ITS xác định lồi 4.2.3.1 Nấm Vân Chi Đoạn gen giải trình t dài 666 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng 93% với số loài chi Trametes sở liệu NCBI Cùng với mô tả hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012) Bƣớc đầu đánh giá mẫu nấm thu thập đƣợc thuộc chi Trametes 4.2.3.2 Nấm Dai Đoạn gen giải trình t dài 567 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng 96% với lồi Lentinus squarrosulus sở liệu NCBI 14 Cùng với mơ tả hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012) mẫu nấm Lentinus squarrosulus 4.2.3.3 Linh Chi Tầng Đoạn gen giải trình t dài 631 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng 97%, với loài Ganoderma applanatum Kết hợp với mơ tả hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012) mẫu nấm Ganoderma applanatum 4.2.3.4 Nấm Thượng Hồng Đoạn gen giải trình t dài 653 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng 92%, độ phủ 91% với loài Phellinus linteus sở liệu NCBI Cùng với đánh giá hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012) tạm thời kết luận loài thuộc chi Phellinus Tạm thời gọi tên Phellinus sp Qua hai nội dung nghiên c u lớn, bốn loài nấm đƣợc chọn để tiếp tục tiến hành nghiên c u nấm dai Lentinus squarrosolus, nấm Linh Chi Tầng Ganoderma applanatum, nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp nấm Mộc Bá Huê 4.3 Xác định thành phần dinh dưỡng dược tính độc tính bán trường diễn thử tác động kháng ung thư lồi nấm dược liệu dòng tê bào ung thư máu ung thư đại trực tràng 4.3.1 Xác định thành phần dinh dưỡng dược tính loài nấm tuyển chọn Bảng tổng hợp thành phần chất dinh dƣ ng có nấm b ng sắc ký lỏng cao áp đƣợc tổng hợp bảng sau: 15 Bảng 4.2: Thành phần dinh dưỡng dược tính lồi nấm Thành phần % hàm lƣợng ác định /kg nấm Tên loài nấm Mộc bá huê Nấm dai Thƣợng hoàng Linh chi tầng Béo 7,01 vết Không xác định Không ác định mg/kg Protein 0,79 0,75 Không xác định Không ác định mg/kg 4Hydroxyprolin 193 Không phát 376 186 mg/kg Acid aspartic 624 695 2510 891 mg/kg Acid glutamic 759 693 1780 767 mg/kg Alanin 68,8 72,8 1460 623 mg/kg Cystine 1470 Không phát 355 338 mg/kg Glycin 419 331 1810 566 mg/kg Histidin 176 169 520 259 mg/kg Isoleucin 106 113 829 421 mg/kg Leucin 439 432 1480 671 mg/kg Lysin 172 309 540 349 mg/kg Methionine 237 262 Không phát 103 mg/kg Phenylalanin 244 245 658 470 mg/kg Prolin 649 495 1470 550 mg/kg Serin 245 313 1550 623 mg/kg Threonin 507 537 1610 563 mg/kg Tyrosin 117 165 158 193 mg/kg Valin 298 248 1190 494 mg/kg 16 Tro tổng 3,31 0,28 5,78 2,20 mg/kg Canxi 216 602 5370 2060 mg/kg Sắt 312 13,5 1650 2210 mg/kg Kali 3880 255 Không xác định Không ác định mg/kg Kẽm 20,8 23,4 25,9 36,4 mg/kg Vitamin A Không xác định Không xác định 1,04 0,91 mg/kg 4.3.2 Xác định thành phần dược tính có hai mẫu nấm Linh Chi Tầng Thượng Hồng Bảng 4.3 Thành phần dược tính hai loài nấm dược liệu Mẫu nấm Linh chi tầng Thƣợng hồng Hàm lƣợng triterpenoid có mẫu (%) Hàm lƣợng polysaccharid có mẫu (%) Hàm lƣợng đƣờng t trung bình (%) 1,10 0,46 29,42 2,11 4,0 40,17 Hàm lƣợng đƣờng kh trung bình (%) 22,07 57,14 Khi so sánh số giá trị dƣợc tính kết hợp bảng đánh giá thành phần dinh dƣ ng Bảng 2) diện mẫu nghiên c u chọn nấm Dai Thƣợng Hồng để tiến hành thí nghiệm 4.3.3 Xác định độc tính bán trường diễn nấm Thượng Hoàng Chuột đƣợc th nghiệm chuột đ c chuột cái, tuần tuổi Chuột đƣợc cho uống cao nấm Thƣợng Hoàng với li u 0,4 g/kg ngày, liên tục tháng Thể trọng chuột lô ch ng lô uống cao nấm Thƣợng Hoàng tăng so với trƣớc th nghiệm; đồng thời, khơng có s khác biệt v s tăng trọng lƣợng thể hai lô, cho 17 thấy cao nấm Thƣợng Hồng khơng ảnh hƣởng đến s phát triển chuột thời gian cho uống Các thông số huyết học đƣợc so sánh hai nhóm chuột bao gồm: hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, công th c bạch cầu, tiểu cầu, số liên quan đến hồng cầu nhƣ MCV, MCH, MCHC, RDW), thông số thuộc ch c gan GOT, GPT), protein toàn phần, triglyceride, thông số thuộc ch c thận creatinin, urea), khảo sát vi thể gan thận Kết cho thấy, thơng số v huyết học, số sinh hóa thuộc v ch c gan - thận n m giới hạn bình thƣờng hai lơ chuột Kết giải phẫu vi thể mô gan, mô thận hai lô chuột đ u không ghi nhận đƣợc s bất thƣờng 4.3.4 Xác định khả tác dụng với tế bào ung thư nấm Thượng Hoàng Phellinus sp Sau 72 tiếp úc với dịch cao chiết nấm thƣợng hoàng Phellinus sp., tế bào ung thƣ máu dòng K562 khơng đáp ng Nồng độ cao chiết đƣợc s dụng thí nghiệm lần lƣợt 5000 µg/ml; 2500 µg/ml, 1250 µg/ml; 625 µg/ml; 312 µg/ml; 156 µg/ml 78 µg/ml Ở tất nồng độ cao chiết s dụng, tế bào ung thƣ máu gần nhƣ phát triển bình thƣờng nhƣ nhóm đối ch ng Đối với tế bào ung thƣ đại tr c tràng HCT116, sau 72 tiếp úc với dịch cao chiết nấm thƣợng hoàng Phellinus sp., tế bào ung thƣ đại tr c tràng HCT116 đ có biểu bị c chế s sống Kết cho thấy hiệu c chế rõ rệt nồng độ 16 µg/mL Từ nồng độ 250 µg/mL trở lên thấy đƣợc s c chế gia tăng rõ rệt Độ hợp dòng tế bào HTC116 lý với cao chiết Phellinus sp 16 µg/mL; 31 µg/mL; 62,5 µg/mL; 125 µg/mL; 250 µg/mL; 500 18 µg/mL 1000 µg/mL lần lƣợt 50%, 40%, 45%, 40%, 20%, 15% 10% Các kết thí nghiệm hồn tồn phù hợp với nghiên c u tác giả khác dòng tế bào ung thƣ máu ung thƣ đại tr c tràng Alla,2010; Ji Hun, 2015) Tùy loại tế bào khác mà biểu thay đổi khác nhau, s thay đổi cao chiết Phellinus sp tác động gây apoptosis trƣờng hợp HCT116) hỗ trợ gây apoptosis tế bào trƣờng hợp K562) Hình 4.6: Đáp ng dòng tế bào K562 cao chiết Phellinus sp Quan sát kính hiển vi đảo ngƣợc độ phóng đại 10X a) tế bào K562, b) đĩa ch a tế bào K562 thêm CCPL nồng độ 500 µg/mL, c) thêm CCPL nồng độ 250 µg/mL, d) nồng độ 125 µg/mL, e) nồng độ 61,5 µg/mL 19 Hình 4.7: Đáp ng HCT 116 với cao chiết Phellinus sp dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc, độ phóng đại 10X a) đối ch ng b) HCT 116 thêm CCPL nồng độ 16 µg/mL c) nồng độ 31 µg/mL d) nồng độ 62,5 µg/mL e nồng độ 125 µg/mL f) nồng độ 250 µg/mL g) nồng độ 500 µg/mL h) nồng độ 1000 µg/mL 4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu quy trình cơng nghệ ni trồng hồn ch nh chủng nấm đ tuyển chọn Trên môi trƣờng cấy chuy n, số liệu đƣợc ghi nhận b ng cách đo độ lan tơ cm) sau ngày, ngày ngày môi trƣờng ống thạch nghiêng Đối với môi trƣờng nhân giống môi trƣờng nuôi trồng ghi nhận số ngày tơ lan 50% 100% hai loài Số liệu đo đƣợc đƣợc lý b ng phần 20 m m SAS kết trung bình đƣợc thể bảng b ng phƣơng pháp DUNCAN với độ tin cậy 95% 4.4.1 Nghiên cứu quy trình trồng nấm dai L squarrosolus Mơi trƣờng PDD PDA bổ sung nƣớc dừa) đƣợc chọn để cấy chuy n nấm Dai Môi trƣờng hạt lúa – cám gạo 5% phù hợp cho tơ nấm Dai phát triển Môi trƣờng mùn cƣa bổ sung bột bắp 5% cám gạo 5% có số ngày lan tơ nhanh nhất, đạt khoảng 70 ngày Sau thí nghiệm tổng hợp qui trình ni trồng hóa nấm dai L squarrosolus hoang dại nhƣ sau: Hình 4.8: Qui trình ni trồng nấm dai Lentinus squarrosolus 21 4.4.2 Nghiên cứu quy trình ni trồng nấm Thượng Hồng Phellinus sp Môi trƣờng PDA môi trƣờng để nhân giống cấp nấm Thƣợng Hồng Mơi trƣờng hạt lúa bổ sung 5% cám môi trƣờng đƣợc l a chọn để nhân giống cấp nấm Thƣợng Hồng Mơi trƣờng mùn cƣa bổ sung 5% bột bắp 5% cám gạo có số ngày lan tơ nhanh nhất, đạt khoảng 50 ngày 70 ngày sau thể Sau q trình nghiên c u, qui trình ni trồng hóa giống Thƣợng Hồng Phellinus sp hoang dại nhƣ sau: Hình 4.9: Quy trình nhân giống nấm Thượng Hồng (Phellinus sp.) 22 CH N 5: KẾT LUẬN V KIẾN N HỊ 5.1 Kết luận Luận án thu thập đƣợc 28 mẫu nấm hoang dại từ t nhiên có mẫu nấm ăn, mẫu nấm dƣợc liệu, loài nấm độc 11 loài chƣa thể phân loại Theo kết u tra khảo sát ngƣời dân địa phƣơng, l a chọn định danh mẫu nấm theo hình thái nấm Dai, nấm Linh Chi Tầng, nấm Thƣợng Hoàng, nấm Vân Chi nấm Mộc Bá Huê Cả mẫu nấm đ u khơng gây độc tính cấp th nghiệm chuột Phân lập đƣợc bốn loài Thƣợng Hoàng, Linh Chi Tầng, nấm Dai Vân Chi Giải trình t gen bốn loài nấm ác định tên khoa học theo trình t DNA nấm Thƣợng Hồng Phellinus sp., Linh Chi Tầng G applanatum, nấm Vân Chi Trametes sp , nấm Dai Lentinus squarrosolus Kết sau ác định thành phần dinh dƣ ng dƣợc tính chọn đƣợc nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp nấm Dai Lentinus squarrosolus Th nghiệm độc tính bán trƣờng diễn cao nấm Thƣợng Hồng chuột, chuột hồn tồn bình thƣờng thời gian th nghiệm Th nghiệm cao chiết nấm thƣợng hoàng dòng tế bào ung thƣ Dòng tế bào ung thƣ máu K562 khơng bị ảnh hƣởng dòng tế bào HCT116 bị c chế tăng sinh tăng nồng cao chiết Nghiên c u quy trình ni trồng lồi nấm ăn nấm dai Lentinus squarrosolus khoảng 120 ngày nấm dƣợc liệu nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp khoảng 150 ngày kể từ ngày cấy chuy n 5.2 Kiến nghị Đối với nấm Mộc Bá Huê, lồi nấm lạ có triển vọng cao cần đƣợc nghiên c u sâu Nấm Linh Chi Tầng, loài nấm cổ linh chi đa niên loài nấm dƣợc liệu quý cần đƣợc nghiên c u sâu Riêng nấm Dai Lentinus squarrosolus loài nấm ăn hoang dại đ đƣợc nuôi trồng thành công nên có chiến lƣợc nhân giống đại trà, phổ 23 biến cho ngƣời dân nuôi trồng s dụng để bổ sung đa dạng loài nấm ăn địa phƣơng chủng Việt Nam Đối với nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp lồi nấm dƣợc liệu hoang dại hiếm, có triển vọng u trị ung thƣ cao nên cần th nghiệm số dòng tế bào ung thƣ khác Đặc biệt nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp vị thuốc h a hẹn hỗ trợ u trị ung thƣ đại tr c tràng chúng có khả c chế khối u hỗ trợ trình chết theo chƣơng trình Những thí nghiệm sâu nhƣ th nghiệm động vật mơ hình th nghiệm lâm sàng thuốc từ nấm Thƣợng Hoàng cần phải đƣợc th c Vấn đ cuối nguồn tài nguyên nấm khu v c Thất Sơn An Giang vô phong phú với nhi u loài nấm lạ, quý cần phải đƣợc bảo tồn đ ng trƣớc việc thị hóa nơng thơn mi n núi thay đổi khí hậu tồn cầu 24 ... trên, luận án Thu thập, tuyển chọn nghiên c u quy trình ni trồng hai loại nấm ăn nấm dƣợc liệu hoang dại vùng Thất Sơn, An Giang đƣợc th c 1.2 Mục tiêu 1.2.1 Mục tiêu chung: Đƣa vào nuôi trồng. .. vào nuôi trồng loài nấm ăn loài nấm dƣợc liệu thu thập hoang dại vùng Thất Sơn, An Giang 1.2.2 Mục tiêu cụ thể: 1) Sƣu tầm số loài nấm lớn vùng Thất Sơn An Giang, u tra mẫu nấm s dụng đƣợc từ... loại nấm dƣợc liệu; 4) Nghiên c u quy trình cơng nghệ ni trồng hồn chỉnh loại nấm ăn loại nấm dƣợc liệu đƣợc chọn 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu Các loài nấm ăn nấm dƣợc liệu hoang dại đ đƣợc