Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phát sáng do vi khuẩn Vibrio harveyi trên ấu trùng và giống cua xanh (Scylla serrata) trong trại sản xuất giống

Bệnh phát sáng là một bệnh nguy hiểm và phổ biến trong các trại sản xuất cua giống (Scylla serrata) ở miền Bắc. Tỷ lệ chết gây ra do bệnh này có thể lên tới 50 - 100% sau 2 - 3 ngày nhiễm bệnh nếu không có biện pháp chữa trị kịp thời. Bằng phương pháp định danh vi khuẩn (phương pháp thử phản ứng sinh hoá và phương pháp đọc và so sánh trình tự gen 16S rDNA) và gây cảm nhiễm nhân tạo.

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Biển; Tập 16, Số 2; 2016: 214-219 DOI: 10.15625/1859-3097/16/2/8456 http://www.vjs.ac.vn/index.php/jmst NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH PHÁT SÁNG DO VI KHUẨN VIBRIO HARVEYI TRÊN ẤU TRÙNG VÀ GIỐNG CUA XANH (SCYLLA SERRATA) TRONG TRẠI SẢN XUẤT GIỐNG Trần Thế Mưu, Vũ Văn Sáng* Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản miền Bắc-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I * E-mail: vuvansangts50@gmail.com Ngày nhận bài: 21-4-2015 TÓM TẮT: Bệnh phát sáng bệnh nguy hiểm phổ biến trại sản xuất cua giống (Scylla serrata) miền Bắc Tỷ lệ chết gây bệnh lên tới 50 - 100% sau - ngày nhiễm bệnh khơng có biện pháp chữa trị kịp thời Bằng phương pháp định danh vi khuẩn (phương pháp thử phản ứng sinh hoá phương pháp đọc so sánh trình tự gen 16S rDNA) gây cảm nhiễm nhân tạo, xác định tác nhân gây bệnh phát sáng ấu trùng cua giống vi khuẩn Vibrio harveyi phương pháp trị bệnh hiệu thơng qua hai bước: Dùng hố chất Pemanganat kali, Chlorine, Formalin khử trùng nước, cua mẹ, thức ăn (artemia) dụng cụ chuyên dụng sau dùng loại kháng sinh Neomycin, Erythromycin Doxycyclin với nồng độ ppm/ngày ngày đầu liên tiếp giai đoạn (Zoea, Megalop cua giống) để phòng bệnh ppm/ngày ngày liên tiếp kể từ ấu trùng nhiễm bệnh để trị bệnh Từ khóa: Ấu trùng giống cua xanh, Scylla serrata, bệnh phát sáng, vi khuẩn ĐẶT VẤN ĐỀ Cua xanh đối tượng ni thuỷ sản có giá trị kinh tế Việt Nam Kỹ thuật nuôi cua đơn giản, tốc độ sinh trưởng nhanh giá cua thương phẩm thị trường tương đối ổn định (từ 120.000 - 180.000 đồng/kg) Hàng năm ước tính cần khoảng tỷ giống cua để thả nuôi hàng ngàn hecta diện tích ao đầm, giống khai thác từ tự nhiên đáp ứng khoảng 10 - 20% so với nhu cầu cua giống cho nuôi thương phẩm [1] Việc nghiên cứu sản xuất giống cua xanh thành cơng góp phần thúc đẩy nghề ni cua phát triển Tuy vậy, trước tình hình thực tiễn trại sản xuất giống cua biển gặp số vấn đề dịch bệnh làm ấu trùng cua giống chết hàng loạt, tỷ lệ sống trung bình từ Zoea đến cua giống thấp đạt 4% [2] Bệnh cua nguyên nhân làm giảm tỷ lệ sống, giảm sản lượng mà làm 214 giảm chất lượng ấu trùng giống Cho đến nay, phát bệnh ấu trùng cua nhiều tác nhân gây vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng vi rút [2] Trong đó, bệnh phát sáng ấu trùng cua giống bệnh đặc biệt nghiêm trọng Bệnh xảy nhiều trại sản xuất giống cua Hải Phòng, Nam Định nhiều địa phương khác làm chết hàng loạt gây thiệt hại lớn cho trại sản xuất giống cua biển Cho đến nay, nghiên cứu bệnh phát sáng ấu trùng cua giống hạn chế Vì vậy, việc nghiên cứu tác nhân gây bệnh phát sáng vi khuẩn Vibrio ấu trùng giống cua xanh cần thiết, góp phần khơng nhỏ vào phát triển nghề nuôi cua biển Việt Nam PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để xác định xác tác nhân gây bệnh phát sáng ấu trùng cua giống, Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phát sáng … dùng phương pháp phân lập định danh vi khuẩn theo tác giả Musselius (1993), Ferich (1993) Bergey (2001) phương pháp phân tử 16s rDNA phương pháp đọc so sánh trình tự gen 16S rDNA) sau dùng chủng vi khuẩn phân lập mẫu bệnh để gây cảm nhiễm nhân tạo Vật liệu thí nghiệm ấu trùng cua giống thu trại sản xuất giống miền Bắc thu 30 mẫu cho loại Thí nghiệm thực Trạm Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản nước lợ thuộc Trung tâm Quốc gia giống Hải sản miền Bắc, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản Phương pháp đọc so sánh trình tự gen 16S r DNA chi tiết sau: Tách chiết DNA tổng số Ly tâm thu dịch tế bào tốc độ 10.000 rpm phút, thu cặn, hoà vào 567 l (l TE (10:1) để đá votex, tiếp thêm vào 30 l (l SDS 10%) trộn lần, thêm vào l (l Protease K (2 mg/ml), tiếp ủ 370C giờ, thêm 180 l (l NaCl M, ủ 560C 10 phút), thêm V Chloroform: Isoamyl (24:1), tiếp ly tâm 12.000 rpm 10 phút, lặp lại bước lần nữa, thu lấy dịch trong, bổ sung 1/10 V Sodium acetate M 2,5 V Ethanol 100%, giữ -250C giờ, sau ly tâm 12.000 rpm 20 phút để thu tủa, thu tủa hong khô, thêm 400 l (l TE - ARNase, ủ 370C giờ, cuối kiểm tra DNA tổng số điện di Agarose Tối ưu hoá điều kiện chạy PCR nhân gen 16S rDNA Thành phần phản ứng chạy PCR nhân gen 16S rDNA (bảng 1) Bảng Thành phần phản ứng nhân gen 16S rDNA Vibrio sp Thành phần PCR buffer Taq polymerase dNTPs DNA template Mồi F Mồi 1525 R Nước cất chạy PCR Nồng độ Lượng hút 10X l 0,3 l 1,5 l u/l 2,5 mM 50 ng/l 10 M 10 M l l l 12,2 l Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: Bằng phương pháp so màu dùng ống chuẩn Mc - Faland’s Để đưa phương pháp phòng trị bệnh phát sáng chúng tơi bố trí thí nghiệm theo sơ đồ khối ngẫu nhiên bể kính thể tích 10 lít, mật độ thả ấu trùng cua ban đầu 10 con/lít Ba loại kháng sinh phổ biến thị trường Erythromycin, Doxycyclin, Neomycin lựa chọn thử nghiệm với nồng độ thời gian tác dụng khác Phương pháp phân tích số liệu Sử dụng chương trình DNA STAR để xử lý trình tự vẽ phát sinh lồi KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết định danh vi khuẩn mẫu bệnh phát sáng Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Bằng phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn môi trường TCBS, xác định chủng vi khuẩn Vibrio (V1, V2, V3 V4) diện mẫu bệnh ấu trùng, cua giống phát sáng với tỷ lệ xuất tương ứng 0,00 - 18,8%; 75,0 - 100%; 11,1 - 25,0% 0,00 - 12,5% Như vậy, chủng vi khuẩn V2 coi chủng vi khuẩn chiếm ưu mẫu bệnh phát sáng Định danh vi khuẩn mẫu bệnh phát sáng Kết thử phản ứng sinh hố: Bằng phương pháp thơng dụng chúng tơi xác định chủng V1 V ordalii, chủng V2 V harveyi, chủng V3 V alginolyticus chủng V4 V parahaemolyticus Kết đọc so sánh trình tự gen 16s rDNA Căn vào kết trên, xác định chủng vi khuẩn V2 chủng vi khuẩn chiếm ưu mẫu bệnh phát sáng Do vậy, định danh chủng vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử Bằng phương pháp đọc so sánh trình tự gen 16s rDNA Viện Công nghệ Sinh học chủng vi khuẩn cần định danh V2, thu kết quả: 215 Trần Thế Mưu, Vũ Văn Sáng Đã nhân gen 16s rDNA lồi Vibrio sp với kích thước tương ứng khoảng 1,4 kb Tuy nhiên, sản phẩm chưa đặc hiệu, phải tiến hành gen tinh sản phẩm PCR trước đọc trình tự Kết sản phẩm PCR, thơi gen tinh thể hình hình 1.4 kb 1.4 kb Hình Kết nhân gen 16S rDNA loài Vibrio sp từ bệnh phát sáng Hình Kết tinh gen 16S rDNA lồi Vibrio sp từ bệnh phát sáng Đọc trình tự gen 16s rDNA loài Vibrio sp (889bp) GAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCT TCGGGGGACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCC CTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATGCCTACGGGTCA AAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTT GGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGC CACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT GCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGT TGTAAAGCACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGTAGTTAATAGCTGCATTATTTGACGT TAGCGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGG TGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAACTCAG ATGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTAC TGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAAT ACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAGATACTGACACTCAGATGCGAAAGCGTGG GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTTGGAG GTTGTGGCCTTGAGCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGCGTTAAGTAGACCGCCTGGGGAG TACGGTCGCAAGATTAAAA Sử dụng chương trình DNA STAR để xử lý trình tự, kết cho thấy loài Vibrio sp phân lập từ mẫu bệnh phát sáng tự nhiên mẫu bệnh phát sáng nhân tạo gây cảm nhiễm (Vibrio sp.) so sánh với lồi Vibrio khác có ngân hàng gen (GENBANK) cho thấy: chủng Vibrio sp (V2) có tỷ lệ phần trăm tương đồng cao so với 216 loài V harveyi 99,7% khoảng cách di truyền tương ứng 0,2; tiếp lồi V carchiariae có tỷ lệ phần trăm tương đồng 99,8% khoảng cách di truyền 0,3 Tiếp đến hai loài V alginolyticus V parahaemolyticus có tỷ lệ phần trăm tương đồng 99,3% khoảng cách di truyền 0,6 0,7 tương ứng Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phát sáng … Qua đó, chúng tơi khẳng định chủng vi khuẩn V2 (Vibrio sp.) phân lập từ mẫu bệnh phát sáng Hải Phòng Nam Định loài Vibrio harveyi Bảng Bảng phần trăm tương đồng khoảng cách di truyền chủng Vibrio với chủng Vibrio sp (V2) Kết gây cảm nhiễm ấu trùng cua giống với chủng vi khuẩn (V ordalii, V alginolyticus V parahaemolyticus) xác định chủng V parahaemolyticus, V ordalii V alginolyticus tác nhân gây bệnh phát sáng trực tiếp Rất chủng vi khuẩn kết hợp với chủng V harveyi làm bệnh phát sáng trở nên trầm trọng khó chữa trị Phân lập định danh lại vi khuẩn từ mẫu bệnh phát sáng nhân tạo Ghi chú: Divergence: Khoảng cách di truyền, Percent Identity: tỷ lệ phần trăm (%) tương đồng Trong q trình thí nghiệm gây cảm nhiễm nhân tạo, tiến hành thu mẫu bệnh phẩm bệnh phát sáng tiến hành định danh lại vi khuẩn hai phương pháp (thử phản ứng sinh hố đọc so sánh trình tự gen 16S rDNA) Kết thu mẫu phát sáng nhân tạo chủng vi khuẩn V harveyi, chủng vi khuẩn mà trước chúng tơi dùng để gây cảm nhiễm Kết xác định tác nhân gây bệnh phát sáng ấu trùng cua giống Hình Cây phát sinh chủng loại loài Vibrio Kết gây cảm nhiễm định danh lại vi khuẩn từ mẫu bệnh nhân tạo Gây cảm nhiễm vi khuẩn với ấu trùng, cua giống Kết gây cảm nhiễm ấu trùng cua giống với vi khuẩn Vibrio harveyi cho thấy: Trong giai đoạn phát triển ấu trùng (từ Zoea đến Megalop cua giống) giai đoạn Zoea giai đoạn dễ mẫn cảm với V harveyi (đặc biệt Zoea 2) Với mật độ vi khuẩn V harveyi đạt 6,0 × 103 CFU/ml, ấu trùng Zoea đến 48 xuất bệnh phát sáng Trong đó, lơ thí nghiệm cảm nhiễm Megalop cua với vi khuẩn V harveyi, ấu trùng Megalop phát sáng sau 72 với mật độ vi khuẩn đạt mức 1,0 × 105 CFU/ml, cua giống phát sáng sau 72 với mật độ vi khuẩn đạt mức 1,0 × 107 CFU/ml Qua kết định danh vi khuẩn kết thí nghiệm gây cảm nhiễm nhân tạo ấu trùng cua giống trên, xác định bệnh phát sáng ấu trùng cua xanh lồi vi khuẩn Vibrio harveyi Phòng trị bệnh Trong trình sản xuất cua giống, biện pháp phòng bệnh chữa bệnh phải kịp thời, ngồi việc phòng bệnh từ xa cách dùng hoá chất xử lý nước, thức ăn, cua bố mẹ, dụng cụ ni việc dùng kháng sinh để phòng khuẩn q trình ni cần thiết Để phòng trị bệnh phát sáng cần quan tâm đến việc xử lý nước dụng cụ chất diệt khuẩn mạnh Kali Pemanganat (nồng độ - ppm 24 giờ), Chlorine (nồng độ 50 - 60 ppm tuần) Formalin (nồng độ 20 - 30 ppm 24 giờ) Trong q trình ương ni cần kết hợp với việc phòng bệnh việc chọn loại kháng sinh (Erythromycin, Doxycyclin Neomycin) với nồng độ ppm/ngày sử dụng ngày đầu liên tiếp giai đoạn phát triển ấu trùng 217 Trần Thế Mưu, Vũ Văn Sáng Kết phòng bệnh phát sáng ấu trùng cua giống dùng loại kháng sinh (Erythromycin, Doxycyclin Neomycin) với nồng độ ppm/ngày ngày đầu liên tiếp giai đoạn (Zoea, Megalop cua giống) Kết trị bệnh loại kháng sinh (Erythromycin, Doxycyclin Neomycin) với nồng độ ppm/ngày ngày liên tiếp kể từ ấu trùng nhiễm bệnh KẾT LUẬN Kết nghiên cứu bệnh phát sáng ấu trùng cua giống, xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn V harveyi, vi khuẩn thường có mặt nước biển, nước lợ chí cua mẹ vùng biển Hải Phòng Đặc điểm lồi vi khuẩn có dạng hình que, bắt màu Gram âm, khuẩn lạc có dạng tròn, lồi màu xanh mọc mơi trường chọn lọc TCBS sau 24 nuôi cấy nhiệt độ 26 280C Khi vi khuẩn Vibrio harveyi đủ số lượng độc lực công ấu trùng đặc biệt cá thể ấu trùng yếu bể ương dẫn đến phát sáng Bệnh phát sáng xử lý việc chọn loại kháng sinh (Erythromycin, Doxycyclin Neomycin) với nồng độ ppm/ngày ngày liên tiếp TÀI LIỆU THAM KHẢO Baticados, M C L., and Pitogo, C L., 1990 Chlorination of seawater used for shrimp culture The Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh, 42(4): 128-130 Baticados, C L., 1988 Control of luminous bacterial infection in prawn hatcheries SEAFDEC Asian Aquaculture (Philippines) No 1, 2-4 Hoàng Đức Đạt, 2000 Kỹ thuật ni cua biển Nxb Nơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh Lavilla-Pitogo, C R., Leobert, D., & la Peña, D., 2004 Diseases in Farmed Mud Crabs Scylla Spp: Diagnosis, Prevention, and Control Aquaculture Department, Southeast Asian Fisheries Development Center Linda L and Mccarter, 1998 Controls Opacity of Vibrio parahaemolyticus http://linda-mccarter@uiowa.edu Nguyễn Cơ Thạch, 2000 Nghiên cứu sinh sản nhân tạo cua biển loài cua Scylla serrata (Forskal, 1775) Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn 120 tr Pitogo, C L., 1988 Isolation and identification of luminous bacteria causing mortalities in Penaeus monodon hatcheries in Panay [Philippines] SEAFDEC Asian Aquaculture (Philippines) No 1, 11 -13 http:// webmaster@watson.wustl.edu West P.A., 1996 Numerical taxonomi of Vibriosis isolated from aquatic environment Int.J syst Bacteriol.36: 531 - 543 STUDY ON PATHOGEN OF LUMINOUS DISEASE VIBRIO HARVEYI ON LARVAE AND JUVENILE OF MUD CRAB (SCYLLA SERRATA) IN HATCHERY Tran The Muu, Vu Van Sang Research Institute for Aquaculture Number ABSTRACT: Luminous disease is known as the most popularly dangerous disease in the hatcheries of mud crab (Scylla serrata) in northern provinces Without any treatment, the mortality caused by this disease may reach 50 - 100% after - days infected In this study, Vibrio harveyi 218 Nghiên cứu tác nhân gây bệnh phát sáng … has been identified as the main pathogen which causes the disease in larvae and juvenile of mud crab by using method for bacteria identification (bio-chemical reaction and comparision of the gene 16S rDNA) as well as artificial disease infection In addition, we have developed successful prevention and treatment for this disease as follows: potasium permanganate, chlorine, formaline used for treatment of water, crab spawners, living food (artemia), utensils and equipment, after that one of the three different kinds of antibiotics can be used: Neomycine, Erythromycine or Doxycyclin For prevention, the dose of ppm/day can be applied for consecutive beginning days of each development stage (Zoea, Megalope and juvenile), and ppm/day can be applied for consecutive days for disease treatment Keywords: Larvae and juvenile of mud crab, Scylla serrata, luminous disease, bacteria 219 ... loại loài Vibrio Kết gây cảm nhiễm định danh lại vi khuẩn từ mẫu bệnh nhân tạo Gây cảm nhiễm vi khuẩn với ấu trùng, cua giống Kết gây cảm nhiễm ấu trùng cua giống với vi khuẩn Vibrio harveyi cho... (Erythromycin, Doxycyclin Neomycin) với nồng độ ppm/ngày ngày liên tiếp kể từ ấu trùng nhiễm bệnh KẾT LUẬN Kết nghiên cứu bệnh phát sáng ấu trùng cua giống, xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn V harveyi, vi. .. Kết thu mẫu phát sáng nhân tạo chủng vi khuẩn V harveyi, chủng vi khuẩn mà trước chúng tơi dùng để gây cảm nhiễm Kết xác định tác nhân gây bệnh phát sáng ấu trùng cua giống Hình Cây phát sinh chủng