ứng dụng kỹ thuật pcr genotyping (orf75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DIỆP THỊ DIỆU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR GENOTYPING (ORF75) TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy – Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa - Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản – trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội học tập và nắm bắt thêm các phương pháp nghiên cứu khoa học. Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Xin cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy Sản Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe và thành đạt. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ii TÓM TẮT Bệnh do tác nhân là virus gây ra trên tôm đang là một vấn đề nan giải cho nuôi trồng thủy sản Việt Nam và thế giới. Trong đó, bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi. Các nghiên cứu về đặc điểm dịch tể của WSSV được thực hiện nhằm đề ra những biện pháp phòng ngừa hiệu qủa nhất để hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do WSSV gây ra. Và kỹ thuật PCR là một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu dịch tể học của WSSV. Do vậy đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR- genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện. Qui trình PCR genotyping (ORF75) thực hiện với kết quả được ghi nhận: (i) thành phần hóa chất tham gia phản ứng là: PCR buffer nồng độ là 1X, nồng độ MgCl 2 là 1,5 mM, nồng độ dNTPs là 200µM, nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 20 pmol, nồng độ taq ADN polymerase là 2 U, nồng độ ADN chiết tách 1 µl. Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 25 µl, (ii) điều kiện phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt là: máy được làm nóng đến 85 o C. Sau đó đến giai đoạn 94 o C trong 3 phút, 94 o C trong 30 giây, 49 o C trong 30 giây, 72 o C trong 60 giây lặp lại 30 chu kỳ và cuối cùng là 72 o C trong 7 phút. Tổng thời gian khuếch đại khoảng 1giờ 20 phút. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới 3 2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3 2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới 3 2.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở nước ta 4 2.2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 4 2.2.2 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam 6 2.3. Sơ lược về bệnh đốm trắng 8 2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV 9 2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý 10 2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm 10 2.3.4 Phương thức lây nhiễm 11 2.3.5 . Một số phương pháp phát hiện WSSV 12 2.3.6 Một số kết quả nghiên cứu dịch tể về bệnh đốm trắng 12 2.4. Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 14 2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 14 2.4. 2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 15 2.4.3 Ứng dụng của PCR 16 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iv CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 18 3.1.1 Địa điểm 18 3.1.2 Thời gian thực hiện 18 3.2 Vật liệu nghiên cứu 18 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 18 3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Qui trình phát hiện WSSV 19 3.3.2 Qui trình PCR genotyping (ORF75) 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 22 4.1. Ứng dụng qui trình PCR genotyping (ORF75) 22 4.2 Chu kỳ nhiệt 23 4.2.1 Chu kỳ phản ứng 23 4.2.2 Nhiệt độ gắn mồi 24 4.3 Hàm lượng ADN khuôn 25 4.4. Nồng độ mồi 25 4.5 Nồng độ MgCl 2 26 4.6. Nồng độ taq ADN polymerase 27 4.7 Điều kiện phản ứng 28 4.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau khi đã tối ưu 29 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề xuất 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 38 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 : Quá trình bộc phát bệnh đốm trắng ở châu Á và châu Mỹ (Escobedo- Bonilla C. M. et al.,2008) 9 Bảng 4.1 Cường độ nhiễm WSSV của các mẫu tôm dùng trong nghiên cứu 21 Bảng 4.2 : Thành phần hóa chất được sử dụng để ứng dụng 30 Phụ lục 1: Thành phần hóa chât của phản ứng PCR genotyping (ORF75) trước khi tối ưu 38 Phụ lục 2: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ taq 38 Phụ lục 3: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 20 pmol 39 Phụ lục 4: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 40 pmol 39 Phụ lục 5: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 60 pmol 40 Phụ lục 6: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ MgCl 2 : ( nồng độ MgCl 2 được thực hiện từ 0.5- 5 mM) 40 Phụ lục 7: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu chu kỳ nhiệt 41 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Diện tích nuôi nước lợ qua các năm 5 Hình 2.2 Sơ đồ của phản ứng PCR 16 Hình 4.1: Kết quả 3 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF75 22 Hình 4.2: Kết quả 10 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF 75) 23 Hình 4.3: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau 24 Hình 4.4: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ mồi 28 Hình 4.5: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ MgCl 2 27 Hình 4.6: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ taq ADN polymerase 28 Hình 4.7: kết quả ba mẫu có cường độ nhiễm khác nhau 29 Hình 4.8: Kết quả ứng dụng 8 mẫu nhiễm WSSV thu ở Cà Mau 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU Việt Nam là một nước có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc phát triển thủy sản. Ngành thuỷ sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của quốc gia. Trong những năm gần đây phong trào nuôi tôm ở Việt Nam đã đạt những thành tựu khả quan. Tuy nhiên, song song với việc tăng diện tích nuôi, tăng sản lượng, tăng mức độ thâm canh thì bệnh dịch thủy sản là một mối nguy lớn đối với nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh do virus gây ra đã làm sản lượng tôm giảm một cách đáng kể. Với khả năng lan truyền bệnh và gây chết tôm hàng loạt, bệnh virus đã gây thiệt hại lớn và ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của nhiều quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển. Đặc biệt là bệnh đốm trắng (White spot disease-WSD), bệnh đầu vàng (Yellow head disease - YHD), bệnh đỏ đuôi (do Taura syndrome virus- TSV)…. Vì hiện nay bệnh virus trên tôm chưa có thuốc đặc trị, nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là điều rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên dấu hiệu bệnh lý bên ngoài không giúp phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc ứng dụng công nghệ sinh học vào trong chẩn đoán bệnh là một bước phát triển giúp người nuôi tôm có những giải pháp kịp thời nhằm làm giảm thiệt hại do virus gây ra. Kỹ thuật PCR là một trong những kỹ thuật chẩn đoán bệnh khá nhạy. Kỹ thuật này không những giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm mà còn được dùng như là 1 công cụ để nghiên cứu dịch tể học của bệnh và tác nhân gây bệnh. Qua đó, các phương pháp phòng và trị bệnh được xây dựng để giúp ngươi nuôi hạn chế thiệt hại đến mức thấp nhất do dịch bệnh gây ra và nâng cao năng suất nuôi. Do vậy, đề tài “ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện. Mục tiêu đề tài Chuẩn hóa qui trình PCR- genotyping (ORF 75) để góp phần vào việc nghiên cứu dịch tể học của tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2 Nội dung thực hiện Xác định chu kỳ nhiệt, thành phần và nồng độ hóa chất thích hợp cho phản ứng PCR- genotyping (ORF75). Xác định khả năng ứng dụng của qui trình PCR- genotyping (ORF75) sau khi đã tối ưu để phân tích một số mẫu tôm bị nhiễm WSSV. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 3 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới 2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới Hiện nay, nghề nuôi tôm biển đã và đang giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới. Từ những năm 1980 với sự phát triển mạnh mẽ của nghề nuôi tôm biển cả về qui mô và mức độ thâm canh đã làm cho sản lượng tôm tăng vọt. Trong giai đoạn 2000-2003, sản lượng nuôi trồng thủy sản của châu Á hiện chiếm tới 90% về sản lượng và 80% về giá trị nuôi trồng thủy sản của thế giới. Theo thống kê của FAO (2004), hàng năm tỉ lệ tăng trung bình của nuôi trồng thủy sản tính từ năm 1970 đến năm 2002 là 8,9 %. Sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới năm 2002 đạt 51,4 triệu tấn. Trong đó sản lượng tôm đạt khoảng 1,29 triệu tấn (trích dẫn bởi Phạm Minh Đức, 2004). Các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) và tôm chân trắng (Penaeus vannamei). Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới. Tôm sú hiện nay được nuôi ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở khu vực Châu Á Thái Bình Dương (chiếm 72%) và Mỹ La Tinh (chiếm 28%). Năm 2003, hai loài tôm sú và tôm thẻ chân trắng chiếm tới 77% tổng sản lượng tôm nuôi (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản, sô 4/2003) 2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới Do việc gia tăng hoạt động nuôi trồng thủy sản đã dẫn tới sự bùng nổ dịch bệnh, bệnh do vi khuẩn và virus trên tôm, gây tổn thất lớn về kinh tế trong ngành thủy sản. Bệnh trên tôm, nhất là bệnh do virus luôn là nỗi lo của người nuôi trồng và là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học. Mặc dù virus gây bệnh trên tôm thì không có ảnh hưởng gì đến sức khỏe con người nhưng nó gây tổn thất lớn cho người nuôi tôm. Trong những năm 1980 Đài Loan dẫn đầu thế giới về sản lượng tôm. Nhưng đến 1988 dịch bệnh xảy ra đã làm sụp đổ nghề nuôi tôm của nước này. Còn Indonesia là một nước có nghề nuôi tôm xuất hiện lâu đời nhất ở Châu Á và là một trong những nước dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi trong vùng. Tốc độ phát triển của PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... này có thể phát hiện được mẫu có cường độ nhiễm nhẹ tốt 4.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau khi đã tối ưu Sau khi tiến hành chuẩn hóa một số thành phần hóa chất và điều kiện phản ứng thì thành phần hóa chất và điều kiện phản ứng của qui trình PCR genotyping (ORF75) được chọn để ứng dụng trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú như sau: 29 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro... cho bệnh lây lan càng nhanh hơn Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẫu thừa vào ao nuôi Theo ông bệnh đốm trắng không có khả năng lây truyền qua theo phương thẳng ứng vì trứng bị bệnh đốm trắng thì không thể thành thục được Nhưng trong quá trình đẻ trứng tôm bố mẹ thải ra các virus đốm trắng từ trong buồng trứng, do đó ấu trùng tôm. .. Sơ lược về bệnh đốm trắng Trong những năm 90 sản lượng nuôi tôm trên thế giới tăng chậm Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự suy giảm này là do virus gây ra (Lotz, 1997) Những tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng có thể dùng kháng sinh hoặc vacxin để trị, còn tác nhân gây bệnh là virus thì không thể dùng cách như vậy để trị (Teunissen et al., 1998) Bệnh đốm trắng là một trong những bệnh nguy... lên tới 9095% tôm bị nhiễm bệnh, đặc biệt là ở những vùng nuôi trên cát (Quang, 2007) Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu NTTS II trong năm 2004 tại các tỉnh Nam Bộ - khu vực nuôi tôm lớn nhất của cả nước, tỉ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%, còn bệnh MBV là 50% Bệnh virus đốm trắng gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của khu vực... lần lặp lại trên một ORF thì có số lần lặp lại không giống nhau trên một hoặc cả hai ORF khác Từ những kết quả trên cho thấy cả 3 ORFs trên đều có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu dịch tể học của virus đốm trắng Trong 3 ORFs trên thì ORF94 có vai trò lớn nhất trong nghiên cứu dịch tể học, tiếp theo là ORF125 và ORF75 (Pradeep B, 2007) 2.4 Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 2.4.1... đốm trắng có đường kính từ 0,5 -2,0 mm (Lightner, 1996) Những đốm trắng thường xuất hiện ở phần đầu ngực và ở phần đuôi (đốt bụng thứ 5 và 6) Các đốm trắng thường có kích thước đều nhau tròn và có tâm trong Ngoài ra, khi tôm bị bệnh còn có các dấu hiệu khác như: khi tôm bị bệnh đốm trắng ở giai đoạn đầu tôm thường tập trung ở gần bờ ao, cơ thể và phụ bộ có màu hơi đỏ, tôm giảm ăn, virus đốm trắng gây. .. Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com bị bệnh đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết Trong năm 2004 các tỉnh miền Trung và Nam Trung Bộ thì Ninh Thuận là tỉnh có có tỉ lệ diện tích nuôi tôm bị bệnh cao nhất (52,4%) Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực này tuy có giảm nhưng bệnh phân trắng, ... lượng tôm của Việt Nam ứng hàng thứ 3 trên thế giới Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm he mùa (Penaeus merguiensis), tôm nương (Penaeus orientalis), tôm đất/rảo (Metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản số 2/2005) Theo thông tin do Bộ Thủy sản (2008) đưa ra tại hội nghị tổng kết công tác nuôi... lẫn nhau (tôm khỏe ăn thịt tôm bệnh, hoặc ăn các thức ăn bị nhiễm WSSV), hoặc lây nhiễm theo nguồn nước (Chou et al., 1998) Theo Bùi Quang Tề (2006) bệnh đốm trắng lây truyền theo phương ngang là chủ yếu Virus này chủ yếu lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay bên trong ao nuôi tôm Những con tôm khỏe ăn những con tôm bị bệnh đốm trắng chết... nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước Nguy hiểm nhất là bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh MBV, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi Bệnh thường . DIỆP THỊ DIỆU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR GENOTYPING (ORF75) TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN. bệnh gây ra và nâng cao năng suất nuôi. Do vậy, đề tài ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú