Ứng dụng kỹ thuật lamp (loop mediated isothermal amplification) trong phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm

I.: Xây dựng được phương pháp phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm bằng kỹ thuật LAMP (Loopmediated isothermal amplification)Thiết kế primer và tối ưu hóa phương pháp LAMPKhảo sát độ nhạy của phương pháp Khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp và so sánh với phương pháp PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM THỊ HUYỀN TRANG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) TRONG PHÁT HIỆN NHANH VIRUS WSSV VÀ IHHNV GÂY BỆNH TRÊN TƠM Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp-HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tấn Trung Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Phạm Thị Huyền Trang MSHV: 7140871 Ngày, tháng, năm sinh: 04/07/1988 Nơi sinh: Nghệ An Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) phát nhanh virus WSSV IHHNV gây bệnh tôm II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xây dựng phương pháp phát nhanh virus WSSV IHHNV gây bệnh tôm kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) - Thiết kế primer tối ưu hóa phương pháp LAMP - Khảo sát độ nhạy phương pháp - Khảo sát độ đặc hiệu phương pháp so sánh với phương pháp PCR III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/01/2018 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/12/2018 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Tấn Trung Tp HCM, ngày tháng năm 2018 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS Nguyễn Tấn Trung PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC LỜI CẢM ƠN Tơi xin trân trọng cảm ơn: - TS Nguyễn Tấn Trung hướng dẫn tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian nghiên cứu luận văn Thạc sĩ - Các thầy cô Khoa Kỹ Thuật Hóa học, Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, sau đại học trường Đại học Bách Khoa TPHCM - Các anh chị bạn phòng xét nghiêm thuộc Viện Sinh học phân Tử Loci tạo điều kiện tốt để thực luận văn tốt nghiệp - Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình động viên, hỗ trợ mặt để tơi hồn thành tốt nghiên cứu TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Chúng thực nghiên cứu nhằm mục đích xây dựng phương pháp phát nhanh virus WSSV IHHNV gây bệnh tôm kỹ thuật LAMP, giúp cho phòng thí nghiêm với trang thiết bị đơn giản thực xét nghiệm bệnh tôm Trong nghiêm cứu tiến hành thiết kế cặp mồi cho phản ứng LAMP phát tác nhân WSSV IHHNV Tối ưu hóa nồng độ betaine cho vào phản ứng LAMP-WSSV IM LAMP-IHHNV 0.8M xác định độ nhạy phản ứng LAMP 25 copy DNA virus Đồng thời với mồi thiết kế cho phản ứng LAMP WSSV IHHNV theo khảo sát số mẫu thực nghiệm có độ đặc hiệu 100%, tương đồng với kết PCR We conducted this study in order to develop a rapid detection method for wssv and IHHNV by LAMP technique, enabling simple laboratory equipment to perform Disease testing on shrimp In this study we have designed pahs of primers for each LAMP reaction to detect wssv and IHHNV Optimization of betaine concentration in LAMP-WSSV reaction was IM and for LAMP-IHHNV was 0.8M The sensitivity of the LAMP reaction is 25 copies of the DNA virus Simultaneously with the primer design for LAMP wssv and IHHNV reactions according to our survey in some specimens has a specificity of 100%, similar to the PCR results LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng tơi Các số liệu sử dụng phân tích luận văn có nguồn gốc rõ ràng, cơng bố theo quy định Các kết nghiên cứu luận văn tơi tự tìm hiểu, phân tích cách trung thực, khách quan phù hợp với thực tiễn Việt Nam Các kết chưa công bố nghiên cứu khác Học viên Phạm Thị Huyền Trang MỤC LỤC MỞ ĐẰU Mục tiêu đề tài .2 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LỆU 1.1 Khái quát thực trạng nghề nuôi tôm Việt Nam 1.1.1 Tình hình ni tơm Việt Nam 1.1.2 Tình hình dịch bệnh tơm 1.2 Virus gây bệnh đốm trắng tôm (WSSV) 1.2.1 Phân loại cấu tạo Virus .7 1.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 11 1.2.3 Cơ chế gây nhiễm Kiểu lan truyền 12 1.3 Bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô .14 1.3.1 Phân loại cấu trúc virus 15 1.3.2 Dấu bệnh lý 16 1.3.3 Phân bố lan truyền 17 1.4 Các phương pháp phát 18 1.4.1 Phương pháp mô học: 18 1.4.2 Phương pháp lai phân tử .19 1.4.3 Phương pháp PCR (PolymeraseChain Reaction) 20 1.4.4 Phương pháp DNA Real time PCR .21 1.4.5 Phương pháp LAMP .22 1.4.5.1 Nguyên tắc phương pháp 22 1.4.5.2 Cơ chế phản ứng LAMP 23 1.4.5.3 Hiển thị kết LAMP 28 1.4.5.4 Ưu điểm phương pháp LAMP 30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGIÊN CỨU .33 2.1 Vật liệu nghiên cứu 33 2.1.1 Mẩu thí nghiệm .33 2.1.2 Máy móc, hang thiết bị 33 2.1.3 Hóa chất, vật tư dùng cho thí nghiệm: 34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Thiết kế primer (thiết kế mồi) .36 2.2.2 Tối ưu hóa phản ứng LAMP 36 2.2.3 Tiế n hành kiểm tra độ nhạy phản ứng LAMP PCR 38 2.2.4 Tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu phương pháp LAMP 39 2.2.4.1 Thu nhận xử lý mẫu 39 2.2.4.2 Tách chiết DNA tổng số 40 2.2.4.3 Thực phản ứng LAMP tất mẫu thực nghiêm 41 2.2.4.4 Thực phản ứng PCR kiểm chứng kết phản ứng LAMP 41 2.2.4.5 Đối chiếu kết LAMP kết PCR 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 44 3.1 Thiết kế primer 44 3.2 Kết tối ưu hóa phản ứng LAMP 48 3.2.1 Kết tối ưu hóa nồng độ betaine .48 3.2.2 Xác định thời gian phản ứng LAMP 52 3.2 Khảo sát độ nhạy phản ứng LAMP 56 3.3 Khảo sát độ đặc hiệu độ chọn lọc phương pháp LAMP 59 3.3.1 Thực phản ứng LAMP mẫu thực nghiệm .59 3.3.2 Ket chạy mẫu thực nghiệm phương pháp PCR .65 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1 Kết luận 71 4.2 Kiến nghị 72 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT LAMP wssv Loop-mediated isothermal amplification White spot syndrome virus IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus EMS Early Mortality Syndrome MBV Monodon Baculovirus PCR ISH Polymerase Chain Reaction In-situ hybdridization NHB Hydroxy Naphthol blue Disodium VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers DNA DeoxyriboNucleic Acid DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng thông kê dịch bênh tôm từ năm 2014-2016 Bảng 1.2 Thống kê dịch bệnh WSSV từ năm 2014-2016 .6 Bảng 1.3 Những ưu nhược điểm phương pháp phát 31 Bảng 2.1 Kích thước mẫu thí nghiêm 33 Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng LAMP WSSV IHHNV 37 Bảng 2.3 công thức pha mix PCR phát WSSV 42 Bảng 2.4 công thức pha mix PCR phát IHHNV 42 Bảng 3.1 Thông tin gene chủng virus WSSV virus IHHNV 45 Bảng 3.2 Trình tự primer cho phản ứng LAMP phát WSSV 48 Bảng 3.3 Trình tự primer cho phản ứng LAMP phát IHHNV .48 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng LAMP-WSSV 53 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng LAMP-IHNV 54 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất phản ứng LAMP cho chứng nội DECA 59 Bảng 3.7 Phân tích kết LAMP 60 ức chế phản ứng LAMP, mẫu DNA tơm cần phải xử lý lại pha loãng trước cho vào phản ứng Phản ứng LAMP chạy khuếch đại gen nội tơm phòng nghiên cứu viện sinh học phân tử LOCI nghiền cứu thành công (bảng 3.7) Bảng 3.6 Thành phần hóa chất phản ứng LAMP cho chứng nội DECA Thành phần Thể tích IC- LAMP mix 20 pl DNA tơm pl Tổng thể tích 25 pl Bảng 3.7 Dự đốn phân tích kết LAMP cho phát wssv hay IHHNV kèm với phản ứng LAMP cho chứng nội cho loại mẫu xét nghiệm khác Mẩu LAMPLAMP Kết luận WSSV/IHHNV mix DECA mix Chứng âm Tím Tím Khơng ngoại nhiễm Chứng dương Xanh Xanh Hỗn hợp cho phản ứng LAMP (hỗn hợp DNA cho WSSV/IHHNV đạt tiêu tách chiết từ tôm chuẩn nhiễm WSSV/IHHNV) Chứng nội (DNA Tím Xanh Hỗn hợp cho phản ứng LAMP tách chiết từ tôm cho chứng nội tôm đạt khoẻ mạnh) tiêu chuẩn Mẩu Tím Xanh Mẩu âm tính với WSSV/IHHNV Mẩu Xanh Xanh Mẩu dương tính WSSV/IHHNV Mẩu Tím Tím Mẩu khơng đạt chất lượng cho phản ứng LAMP, cần thực lại bước tách chiết Mẩu dương tính wssv hay IHHNV cần kiểm tra lại phản ứng LAMP cho Mẩu Xanh tím chứng nội Có thể sử dụng phương pháp khác độc lập để kiểm tra mẫu PCR CHỨNG NỘI TẠI MẪU TÔM WSSV BTV W DECA W2 DECA W3 DECA V W4 DECA TT V lí t * W5 W6 W7 DECA DECA DECA W8 _ DECA DECA W10 DECA Hình 3.12 Kết LAMP chạy chứng nội DECA mẫu tôm nhiễm WSSV Màu tím phản ứng LAMP khơng xảy màu xanh phản ứng LAMP xảy Hình 3.13 Kết LAMP cho 10 mẫu tơm dương tính với WSSV (+) mẫu chứng dương, tơm nhiễm WSSV Từ W1 đến W10 mẫu tôm dương tính với WSSV (-) mẫu tơm khoẻ mạnh âm tính với WSSV Màu tím phản ứng LAMP không xảy màu xanh phản ứng LAMP xảy diện HNB Tất 10 mẫu tơm chẩn đốn dương tính với WSSV cung cấp viện sinh học phân tử LOCI tiến hành chạy phản ứng LAMP cho WSSV cho kết dương tính, phản ứng LAMP gen nội tôm xảy Để kiểm tra lại kết LAMP tiến hành điện di ống phản ứng LAMP gel agarose 2% kết hiển thị phù hợp với kết quan sát thay đổi màu sắc (hình 3.14 hình 3.15) Hình 3.14 Kết điện di cho sản phẩm phản úng LAMP cho 10 mẫu dương tính WSSV (tương ứng với hình 3.13) Giếng mẫu chứng dương, tôm nhiễm WSSV Từ giếng đến giếng 11 mẫu tơm dương tính với WSSV Giếng 12 13 mẫu tôm âm tính với WSSV Hình 3.15 Kết điện di cho sản phẩm phản úng LAMP chứng nội cho 10 mẫu dương tính WSSV (tương ứng với hình 3.12) Sau chạy phản ứng LAMP với mẫu dương tính tác nhân chúng tơi tiến hành chạy xác định độ đặc hiệu phương pháp LAMP Để kiểm tra độ đặc hiệu phương pháp LAMP phát WSSV Trong thí nghiêm này, chúng tơi sử dụng phản ứng LAMP cho WSSV chạy 10 mẫu tôm nhiễm với IHHNV, hay nhiễm với M baculovirus (MBV), hay nhiễm với V parahaemolyticus (EMS) MIX LAMP - wssv V' 1’ (+) WSSV 1' I