Trình bày tổng quan tài liệu về tình hình sốt xuất huyết. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Kết quả và thảo luận Trình bày tổng quan tài liệu về tình hình sốt xuất huyết. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Kết quả và thảo luận Trình bày tổng quan tài liệu về tình hình sốt xuất huyết. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu. Kết quả và thảo luận
LÂM TÚ QUỲNH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI CÔNG NGHÊ SINH HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP RT-LAMP (REVERSE TRANSCRIPTION LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS DENGUE - LÂM TÚ QUỲNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT 2010 - 2012 Hà Nội 2013 NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2013 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sốt xuất huyết giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình sốt xuất huyết giới 1.1.2 Tình hình sốt Dengue, sốt xuất huyết Dengue Việt Nam 1.2 Đặc điểm virus Dengue 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc điểm di truyền .10 1.3 Chẩn đoán virus Dengue .10 1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 11 1.3.2 Chẩn đoán qua xét nghiệm huyết .11 1.3.2.1 Phương pháp ngăn ngưng kết hồng cầu 11 1.3.2.2 Phương pháp miễn dịch enzyme phát kháng thể IgM 12 1.3.2.3 Phương pháp phân lập virus .13 1.3.2.4 Phương pháp ELISA – NS1 .14 1.3.3 Chẩn đoán dựa nucleic acid .14 1.3.3.1 Phương pháp RT-PCR 14 1.2.3.2 Phương pháp Real-time RT-PCR 15 1.4 Phương pháp RT-LAMP 16 1.4.1 Cơ chế hoạt động RT-LAMP 16 1.4.2 Ứng dụng phương pháp RT-LAMP 19 1.4.2.1 RT-LAMP chẩn đoán SD/SXHD 19 1.4.2.2 Các ứng dụng khác LAMP, RT-LAMP .20 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên vật liệu 21 2.1.1 Mẫu vật 21 2.1.2 Hóa chất .21 2.1.3 Trang thiết bị 22 i 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Quy trình tách chiết RNA 22 2.2.2 Phương pháp RT-PCR 23 2.2.2.1 Phương pháp tạo cDNA 23 2.2.2.2 Phương pháp PCR 24 2.2.2.3 Phương pháp Nested-PCR 25 2.2.3 Phương pháp RT-LAMP 25 2.2.3.1 Khảo sát điều kiện nhiệt độ: 27 2.2.3.2 Khảo sát điều kiện thời gian: 27 2.2.3.4 Khảo sát điều kiện nồng độ Mg2+: 27 2.2.3.5 Khảo sát điều kiện nồng độ Betaine: .27 2.2.3.6 Khảo sát tính đặc hiệu phương pháp: .27 2.2.3.7 Khảo sát khả phát virus Dengue 28 2.2.3.8 Khảo sát nồng độ khuôn mẫu phát virus Dengue: 28 2.2.4 Phương pháp điện di Agarose: 28 2.2.5 Phương pháp bổ sung MgSO Ethidium Bromide .29 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Thiết lập phản ứng RT-LAMP .30 3.2.1 Khảo sát điều kiện nhiệt độ 32 3.2.2 Khảo sát điều kiện thời gian 33 3.2.3 Khảo sát điều kiện nồng độ dNTPs 34 3.2.4 Khảo sát điều kiện nồng độ Mg2+ 35 3.2.5 Khảo sát điều kiện nồng độ Betaine 36 3.3 Phát triển phương pháp xác định sản phẩm phản ứng LAMP 37 3.4 Xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP 38 3.5 Khả phát virus Dengue phương pháp RT- LAMP .39 3.5.1 Phản ứng RT-PCR xác định virus Dengue từ huyết 39 3.5.2 Phản ứng Nested-PCR .40 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 KẾT LUẬN 45 KIẾN NGHỊ .45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các quốc gia khu vực có nguy lây truyền Dengue, 2012 Hình 1.2 Số mắc Dengue Dengue nặng báo cáo hàng năm cho WHO giai đoạn 1995 -2007 số ca báo cáo giai đoạn 2008-2010 Hình 1.3 Số ca mắc SD/SXHD 30 quốc gia có SD/SXHD cao Hình 1.4 Số quốc gia có SD/SXHD với số ca mắc giai đoạn 1955- 2008 Hình 1.5 Cấu trúc tổ chức gen virus Dengue [20] Hình 1.6 Sơ đồ chế hoạt động phản ứng Mac-ELISA 13 Hình 3.1 Phổ điện di sản phẩm LAMP (giếng + ), đối chứng (giếng - ), thang DNA chuẩn 100 bp Fermentas (giếng M) 31 Hình 3.2 Phản ứng LAMP nhiệt độ khác 59, 61, 63, 65oC; thang DNA chuẩn 100 bp Fermentas (M) .32 Hình 3.3 Phản ứng RT-LAMP thực khoảng thời gian khác 15, 30, 45, 60 phút nhiệt độ tối ưu 61oC; thang DNA chuẩn 100 bp Fermentas (M) 33 Hình 3.4 Phản ứng LAMP thực nồng độ dNTPs khác 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mM; thang DNA chuẩn 100 bp Fermentas (M) 34 Hình 3.5 Phản ứng LAMP thực với nồng độ Mg2+ khác 2, 4, 6, 8, 10 mM; thang DNA chuẩn 100 bp Fermentas (M) 36 Hình 3.6 Phản ứng LAMP thực với nồng độ Betaine khác 37 Hình 3.7 Phát sản phẩm LAMP điện di gel agarose 1,5% (A) .38 quan sát kết tủa mắt thường (B), bổ sung MgSO ethidium bromide (C) đèn UV 38 Hình 3.8 Phản ứng RT-LAMP sử dụng khuôn RNA virus dengue (giếng 1), virus sởi (giếng 2, 3) virus rubella (giếng 4, 5); thang DNA 100 bp Fermentas (giếng M) .39 Hình 3.9: Phổ điện di sản phẩm PCR giếng – đối chứng, giếng 2, 3, 4, tương ứng cho sản phẩm PCR từ mẫu bệnh; giếng M - DNA chuẩn 100 bp Fermentas 40 iii Hình 3.10: Phổ điện di sản phẩm PCR giếng1, 2, 3, 4, tương ứng cho mẫu dương tính Dengue; giếng – đối chứng âm, giếng M - DNA chuẩn 100bp Fermentas 41 Hình 3.11 Khả phát virus Dengue phản ứng RT-LAMP với RNA typ (giếng 1), typ (giếng 2), typ (giếng 3) typ (giếng 4) tách từ huyết 42 Hình 3.12 Ảnh hưởng lượng mẫu RNA tách từ huyết đến phản ứng LAMP 0,1 µl mẫu (giếng 1-4) µl mẫu (giếng 5-8) bệnh nhân với typ (1-4) tương ứng .43 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 So sánh hai phương pháp phát virus Dengue (chưa phân typ) 43 Bảng 3.2 So sánh phương pháp phát virus Dengue Parida cộng với phương pháp đề tài 44 v MỞ ĐẦU Sốt Dengue (SD), sốt xuất huyết Dengue (SXHD) hội chứng sốc Dengue virus Dengue gây muỗi lây truyền, chủ yếu xảy vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Nước ta quốc gia có tỉ lệ mắc SD/SXHD cao giới Cũng nước khác, SD/SXHD Việt Nam bệnh gây tử vong hàng đầu cho trẻ em, tập trung chủ yếu trẻ 15 tuổi [7] Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán SD/SXHD phổ biến bao gồm: phương pháp huyết học (phân lập virus, Mac-ELISA) thường cho kết chậm, không phù hợp chẩn đoán điều trị, chủ yếu phục vụ cho công tác giám sát dịch tễ Kỹ thuật sinh học phân tử Nested RT-PCR, realtime RT-PCR phát triển ứng dụng chẩn đoán, nhiên phương pháp chưa áp dụng phổ biến ứng dụng thực tiễn chi phí cao, trang thiết bị phức tạp, nhân viên phải đào tạo tốt Gần đây, kỹ thuật ELISA kháng nguyên NS1 sử dụng để phát protein NS1 virus Dengue, nhiên phương pháp xác định typ giá sinh phẩm đắt LAMP phương pháp cho phép khuếch đại acid nucleic điều kiện nhiệt độ thời gian ngắn Kỹ thuật LAMP sử dụng mồi bắt cặp vị trí khác nhau, tính đặc hiệu cao vượt trội so với kỹ thuật PCR thông thường Hơn nữa, kỹ thuật LAMP yêu cầu thiết bị ổn nhiệt thơng thường sản phẩm LAMP quan sát mắt (không cần thực điện di) Kỹ thuật phát triển thành kit sử dụng cho phát nhiều loại virus, vi khuẩn, ký sinh trùng [7] [8] [24] Phương pháp RTLAMP nghiên cứu để phát virus Dengue Nhật Bản Tuy nhiên đặc điểm miễn dịch học phân tử virus Dengue vùng địa lý khác khác Xuất phát từ tình hình đó, thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp RT-LAMP (Reverse Transcription Loopmediated isothermal amplification) để phát virus Dengue” phục vụ phát triển sinh phẩm chẩn đoán nhanh virus Dengue phù hợp điều kiện Việt Nam Mục tiêu đề tài: - Thiết lập ứng dụng phương pháp RT-LAMP cho xác định nhanh virus Dengue từ mẫu huyết Nội dung nghiên cứu: - Tách chiết RNA từ mẫu huyết - Thiết lập phản ứng RT-LAMP - Khảo sát điều kiện phản ứng RT-LAMP - Ứng dụng phương pháp RT-LAMP để xác định virus Dengue từ mẫu huyết CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình sốt xuất huyết giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình sốt xuất huyết giới Sốt Dengue (SD), sốt xuất huyết Dengue (SXHD) hội chứng sốc Dengue (HCSD) bệnh virus Dengue có muỗi Aedes aegypti truyền Trong suốt nhiều thập kỷ qua, mức độ xuất SD, SXHD HCSD với vụ dịch tăng lên đáng lo ngại toàn cầu, đồng thời tỷ lệ mắc bệnh tăng lên, chưa có vắc xin phịng ngừa chưa có thuốc đặc trị Theo Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) có khoảng 2,5- tỷ người có nguy mắc SD, ước tính có tới 50-100 triệu trường hợp mắc SD năm Hằng năm, 500.000 trường hợp SD phải nhập viện, 90% trẻ em 15 tuổi Tỷ lệ tử vong trung bình trường hợp mắc SD/SXHD 2,5% Dịch có tính chất chu kỳ [31] Dịch SXHD ghi nhận vào năm 1950 Philippines Thái Lan Ngày nay, SXHD ảnh hưởng hầu châu Á châu Mỹ la tinh, trở thành nguyên nhân hàng đầu tỷ lệ trẻ em nhập viện tử vong quốc gia thuộc khu vực [31] Trước năm 1970, SD/SXHD xuất chín quốc gia Hiện tại, SD/SXHD lan rộng 100 quốc gia, có 20 nước châu Phi, 42 nước Châu Mỹ, nước Đông Nam Á, nước phía đơng Địa Trung Hải 29 nước thuộc khu vực Tây Thái Bình Dương Hiện nay, khu vực có khí hậu nhiệt đới vùng có nguy bị dịch cao với tất bốn typ virus lưu hành đồng thời, khu vực châu Mỹ, châu Á Thái Bình Dương châu Phi [31] Năm 2008 số ca mắc SD/SXHD ghi nhận Châu Mỹ, Đơng Nam Á, Tây Thái Bình Dương vượt 1,2 triệu số 2,3 triệu vào năm 2010 Gần đây, số ca mắc SD/SXHD báo cáo ngày gia tăng Riêng châu Mỹ năm 2010 ghi nhận 1,6 triệu trường hợp sốt Dengue 49000 trường hợp sốt Dengue nặng [31] Không số ca mắc SD tăng lên hàng năm khu vực có SD, mà ngày có nhiều khu vực có bệnh nhân mắc SD, số gia tăng tốc độ bùng nổ Năm 2010 ca SD ghi nhận Pháp Croatia Năm 2012 đảo Madeira Bồ Đào Nha dịch SXH bùng phát với 1800 ca ghi nhận thêm năm quốc gia khác châu Âu ghi nhận trường hợp SD du nhập Năm 2012 SD xem dịch bệnh dịch virus lây truyền qua muỗi nguy hiểm giới [31] Vùng thích hợp lây truyền Dengue Nguy cao Nguy thấp Khơng có dịch/ Khơng thích hợp Hình 1.1: Các quốc gia khu vực có nguy lây truyền Dengue, 2012 Nguồn: WHO - Global strategy dengue prevention and control 2012-2020 [22] dài 72oC (60 giây) Phản ứng PCR thường gồm 35 chu kỳ nhiệt, ban đầu cần phút để gia nhiệt cho máy đạt 95oC, cuối cần thêm khoảng phút để hoàn thiện sản phẩm Như để phát virus Dengue phản ứng PCR khoảng bao gồm giai đoạn cDNA PCR Dengue Vì thế, điểm vượt trội phản ứng RT-LAMP thời gian ngắn nhiều so với PCR thông thường, kéo dài Như vậy, dùng phương pháp RT-LAMP để phát virus Dengue tiết kiệm so với phương pháp PCR áp dụng phổ biến phịng thí nghiệm giới Điều góp phần quan trọng cho việc cung cấp thông tin việc điều trị cho bệnh nhân 3.2.3 Khảo sát nồng độ dNTPs Khác với phản ứng PCR thông thường (nồng độ dNTPs tối ưu 0,2 mM tăng lên kích thước gen đích lớn), phản ứng LAMP địi hỏi nồng độ dNTPs cao lượng sản phẩm LAMP sinh lớn 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,0 - 0,5 - 0,2 Hình 3.4 Phản ứng LAMP thực nồng độ dNTPs khác 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mM; thang DNA chuẩn 100 bp Fermentas (M) 34 Theo nhiều công bố LAMP, nồng độ dNTPs thay đổi từ 0,4 – 1,4 mM [6, 8-13] Phản ứng RT-LAMP nghiên cứu thực nồng độ dNTPs khác 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 1,0 mM Kết cho thấy với nồng độ thấp (0,2 mM) phản ứng RT-LAMP thực sản phẩm sinh so với nồng độ khác (hình 3.4) Với nồng độ 0,4 mM sản phẩm phản ứng RT-LAMP xuất rõ ràng tương tự phản ứng có nồng độ cao nên nồng độ dNTPs lựa chọn cho nghiên cứu 0,4 mM 3.2.4 Khảo sát nồng độ Mg2+ Ion Mg2+ cofactor cho DNA polymerase bền nhiệt Trong phản ứng PCR, ion Mg2+ cịn có vai trị làm ổn định DNA sợi đơi làm tăng giá trị nhiệt độ nóng chảy (Tm) Do đó, nồng độ ion Mg2+ đóng vai trị quan trọng tính đặc hiệu hiệu suất phản ứng Thông thường phản ứng PCR, nồng độ ion Mg2+ tối ưu 2,0 mM Tuy nhiên, ion Mg2+ lại bị bắt giữ dNTPs nên thay đổi nồng độ dNTPs đòi hỏi cần phải thay đổi nồng độ Mg2+ cho phù hợp Trong phản ứng LAMP nhu cầu dNTPs lớn so với phản ứng PCR thông thường [26] Theo nghiên cứu Parida cộng sự, nồng độ dNTPs Mg2+ sử dụng 1,4 mM mM tương ứng[14], nồng độ dNTPs sử dụng nghiên cứu 0,4 mM Vì thế, nồng độ Mg2+ khảo sát nghiên cứu mức 2, 4, 6, 8, 10 mM Kết cho thấy nồng độ mM không thấy xuất sản phẩm phản ứng RT-LAMP (hình 5) sản phẩm phản ứng RT-LAMP xuất tăng nồng độ lên mM cao Với nồng độ tăng lên đến 10 mM hiệu suất phản ứng không tăng lên đáng kể so với mM Vì vậy, nồng độ Mg2+ mM lựa chọn cho nghiên cứu 35 10 M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,0 - 0,5 - 0,2 Hình 3.5 Phản ứng LAMP thực với nồng độ Mg2+ khác 2, 4, 6, 8, 10 mM; thang DNA chuẩn 100 bp Fermentas (M) 3.2.5 Khảo sát nồng độ Betaine Betaine yếu tố giúp tăng cường khả tách mạch sợi DNA có tỷ lệ G C cao betaine đóng vai trị khơng phần quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất tính đặc hiệu phản ứng Trong lúc đó, enzyme DNA polymerase lại xúc tác tổng hợp DNA theo chiều từ 5’ 3’, để tham gia vào trình chép sửa sai phân tử DNA Các DNA polymerase tổng hợp mạch DNA bổ sung từ đầu OH’ tự mồi Tuy nhiên, nồng độ betaine cao lại làm giảm hoạt tính enzyme DNA polymerase, dẫn tới hiệu suất phản ứng giảm Vì vậy, với tính có lợi bất lợi phản ứng PCR, tiến hành khảo sát với nhiều nồng độ betaine khác không sử dụng betaine phản ứng RT-LAMP Kết cho thấy khơng có khác biệt sản phẩm RT-LAMP khơng có tham gia betaine có betaine với nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 M (hình 3.6) Do đó, betaine khơng cần thiết cho phản ứng RT-LAMP nghiên cứu 36 0, 0, 0, 0,8 1,0 M Kb - 3,0 - 2,0 - 1,0 - 0,5 - 0,2 Hình 3.6 Phản ứng LAMP thực với nồng độ Betaine khác 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 M; thang DNA chuẩn 100 bp plus Fermentas (M) 3.3 Phát triển phương pháp xác định sản phẩm phản ứng LAMP Những phương pháp xác định sản phẩm LAMP bao gồm: điện di gel agarose, quan sát độ đục, quan sát màu mắt thường ống chứa sản phẩm sau bổ sung SYBR Green I Calcein; quan sát đèn UV sau bổ sung ethidim bromide bán định lượng thông qua hệ thống turbidimeter [13] Phương pháp xác định cách điện di gel agarose đòi hỏi thời gian lâu phương pháp khác (khoảng 60 phút) cần thời gian chạy điện di thời gian nhuộm gel cần phải có đủ trang thiết bị (hình 3.7 A) Phương pháp quan sát độ đục mắt thường thiếu xác lượng sản phẩm Tuy nhiên, ống sản phẩm mang ly tâm để thu cặn lắng Mg P O đáy (hình 3.7 B) Khi bổ sung MgSO ethidium bromide vào ống sản phẩm quan sát đèn UV cho kết rõ ràng, có khác biệt mẫu âm tính dương tính (hình 3.7 C) Để áp dụng RT-LAMP sở y tế khơng địi hỏi trang thiết bị phức tạp, 37 nhanh chóng cho kết quả, phương pháp bổ sung MgSO ethidium bromide vào ống sản phẩm quan sát đèn UV áp dụng + + + - A B C Hình 3.7 Phát sản phẩm LAMP điện di gel agarose 1,5% (A) quan sát kết tủa mắt thường (B), bổ sung MgSO ethidium bromide (C) đèn UV 3.4 Xác định độ đặc hiệu phản ứng RT-LAMP Trong thực tế xét nghiệm, biểu lâm sàng sốt loại virus Dengue, virus Sởi hay Rubella gây giai đoạn đầu tương đối giống nhau, cần phải phân biệt người có biểu sốt tác nhân Trên sở phản ứng RT-LAMP kiểm tra phản ứng chéo hai loại virus Sởi Rubella Kết phản ứng RT-LAMP hoàn toàn âm tính với hai mẫu virus Sởi hai mẫu virus Rubella (hình 3.8) Điều chứng tỏ phản ứng RT-LAMP thiết lập nghiên cứu hoàn toàn khơng có phản ứng chéo với virus Sởi Rubella 38 M Kb 3,0 – 2,0 – 1,0 – 0,5 – 0,2 – Hình 3.8 Phản ứng RT-LAMP sử dụng khuôn RNA virus dengue (giếng 1), virus sởi (giếng 2, 3) virus rubella (giếng 4, 5); thang DNA 100 bp Fermentas (giếng M) 3.5 Khả phát virus Dengue phương pháp RT- LAMP 3.5.1 Phản ứng RT-PCR xác định virus Dengue từ huyết RNA tổng số tách chiết từ huyết bệnh nhân có biểu lâm sàng sốt 1- ngày phản ứng dương tính với xét nghiệm ELISA-NS1 Mẫu RNA sử dụng làm khuôn để tổng hợp cDNA theo phương pháp mô tả mục 2.2.2.1 Với sản phẩm cDNA vừa thu được, thực phản ứng PCR theo quy trình Lanciotti cộng (1992), với thành phần hóa chất, sinh phẩm nêu phần phương pháp; phản ứng thực máy luân nhiệt, khoảng gần (97,5 phút) Sản phẩm điện di gel agarose 2%, chụp ảnh đèn UV, kết thu thể hình 3.9 Kết cho thấy có sản phẩm PCR từ tất mẫu, điều chứng tỏ RNA tách chiết thành công từ mẫu huyết bệnh nhân 1-5 ngày sau sốt, đồng thời tạo cDNA từ mẫu RNA 39 M Hình 3.9: Phổ điện di sản phẩm PCR giếng – đối chứng, giếng 2, 3, 4, tương ứng cho sản phẩm PCR từ mẫu bệnh; giếng M - DNA chuẩn 100 bp Fermentas 3.5.2 Phản ứng Nested-PCR Dùng sản phẩm bước PCR để làm khuôn, thực phản ứng Nested-PCR theo quy trình Lanciotti cộng (1992) với thành phần hóa chất, sinh phẩm nêu phần phương pháp để phân typ mẫu Phản ứng thực máy luân nhiệt, khoảng (83,75 phút) Sản phẩm điện di gel agarose 2%, chụp hình đèn UV, kết thu hình 3.4 Dựa kết điện di theo kích thước lý thuyết mong đợi, typ virus Dengue xác định: mẫu thuộc typ 4, mẫu thuộc typ 3, mẫu thuộc typ 1, mẫu thuộc typ Các mẫu sử dụng để kiểm chứng phản ứng RT-LAMP cho việc phát typ virus Dengue 40 M Hình 3.10: Phổ điện di sản phẩm PCR giếng1, 2, 3, 4, tương ứng cho mẫu dương tính Dengue; giếng – đối chứng âm, giếng M - DNA chuẩn 100bp Fermentas Việc phát triển phương pháp RT-LAMP với mong muốn ứng dụng để phát virus Dengue bệnh nhân có biểu lâm sàng sốt Do phản ứng RT-LAMP thử nghiệm RNA tổng số tách chiết từ mẫu huyết bệnh nhân dương tính với virus dengue (dương tính với NS1) typ khác theo kết Kết cho thấy RT-LAMP xây dựng hoàn toàn xác định virus Dengue từ dịch huyết thử nghiệm (hình 3.11) 41 M Kb - 3,0 -2,0 - 0,5 - 0,2 Hình 3.11 Khả phát virus Dengue phản ứng RT-LAMP với RNA typ (giếng 1), typ (giếng 2), typ (giếng 3) typ (giếng 4) tách từ huyết Tại sở, việc xác định nồng độ RNA tổng số dịch chiết từ huyết tương đối khó khăn hạn chế thiết bị Do đó, phương pháp RTLAMP thử với lượng khuôn đưa vào khác để đưa điều kiện ổn định cho xác định có mặt virus Dengue mẫu bệnh phẩm Kết cho thấy giảm lượng khn (0,1 µl) xác định mẫu (hình 3.12, giếng 3, 4) Khi tăng lượng mẫu cho vào phản ứng đảm bảo đủ dư lượng khn làm tăng lượng chất gây ảnh hưởng đến phản ứng Khi tăng lượng mẫu lên µl, kết phản ứng RT-LAMP thực tốt Từ kết cho thấy với quy trình tách chiết RNA từ mẫu huyết theo khuyến cáo hãng Qiagen ta sử dụng µl mẫu cho phản ứng Hiện phương pháp thực mẫu huyết Để khẳng định khả ứng dụng phương pháp thực tế cần khảo sát với số lượng mẫu lớn 42 M M Kb 3,0 – 2,0 – 1,0 – 0,5 – 0,2 – Hình 3.12 Ảnh hưởng lượng mẫu RNA tách từ huyết đến phản ứng LAMP 0,1 µl mẫu (giếng 1-4) µl mẫu (giếng 5-8) bệnh nhân với typ (1-4) tương ứng Chúng tiến hành so sánh sơ phương pháp RT-LAMP thiết lập nghiên cứu với phương pháp PCR thông thường phương pháp LAMP thiết lập Parida cộng Kết so sánh thể bảng 3.1 3.2 Bảng 3.1 So sánh hai phương pháp phát virus Dengue (chưa phân typ) Phương Thời gian Chế độ ủ Thiết bị Đẳng nhiệt Giá ủ nhiệt khô Thao tác pháp RT-LAMP - bước - đơn giản - khó nhiễm PCR Luân nhiệt Giá ủ nhiệt khô, - bước máy luân nhiệt - phức tạp - dễ tạp nhiễm 43 Bảng 3.2 So sánh phương pháp phát virus Dengue Parida cộng với phương pháp đề tài Parida cộng Đề tài Nhiệt độ 63 oC 61 oC Thời gian 60 phút 60 phút FIP BIP 1,6 µM 1,6 µM F3 B3 0,2 µM 0,2 µM F B 0,8 µM 0,8 µM dNTPs 1,4 mM 0,4 mM Mg2+ mM 6M Bst 16 U 8U AMV RT 0,125 U 1U Betaine 0,8 M Gel agarose 3% 1,5% Các thành phần tham gia phản ứng Như vậy, với kết thu phạm vi đề tài, phương pháp RTLAMP để phát virus Dengue tối ưu phương pháp PCR áp dụng phịng thí nghiệm mặt thời gian, tiết kiệm giờ, điều có ý nghĩa quan trọng cho cơng tác điều trị RT-LAMP bước thực RT-PCR, điều giúp giảm tỷ lệ tạp nhiễm Bên cạnh đó, với thiết bị ủ đẳng nhiệt đơn giản thay cần trang bị máy luân nhiệt giúp tiết kiệm chi phí, dễ sử dụng Trên sở đó, chúng tơi hy vọng ứng dụng phương pháp RT-LAMP kỹ thuật phát virus Dengue tuyến sở 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu được, đưa số kết luận sau: - Đã tách chiết RNA virus Dengue từ mẫu huyết bệnh nhân có biểu lâm sàng sau sốt 1-5 ngày - Đã thiết lập phản ứng RT-LAMP dùng để khuếch đại đặc hiệu gen đích virus Dengue - Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng RT-LAMP phát virus Dengue: nhiệt độ 61 oC, thời gian 60 phút, nồng độ dNTPs 0,4 mM, nồng độ Mg2+ 6M, nồng độ enzyme Bst DNA polymerase U, enzyme AMV reverse transcriptase U, không cần bổ sung betaine - Phương pháp RT-LAMP phát typ virus Dengue từ mẫu huyết KIẾN NGHỊ Từ kết đạt được, đưa số kiến nghị sau: - Khảo sát khả phát virus Dengue phương pháp RT-LAMP với số lượng lớn mẫu huyết - Tiếp tục phát triển phương pháp RT-LAMP dùng để định typ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Quang Hà (2003), Vi-rút Dengue dịch sốt xuất huyết, NXB Khoa học kỹ thuật, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Trọng Lân (2004), Sốt Dengue & sốt xuất huyết Dengue, NXB Y học chi nhánh Tp Hồ Chí Minh, Tp Hồ Chí Minh, 258 trang Tổ chức Y tế Thế giới (2001), Tài liệu hướng dẫn Phòng chống sốt dengue sốt xuất huyết dengue, NXB Y học, Hà Nội, 144 trang Phạm Hùng Vân (2009), PCR real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp, NXB Y học, chi nhánh Tp Hồ Chí Minh Tài liệu Tiếng Anh Chao DY, King CC, Wang WK, Chen WJ, Wu HL, Chang GJ (2005), “Strategically examining the full genome of dengue virus type in clinical isolates reveals its mutation spectra, Journal Virology, 72(2) Henchal E.A., Putnak J.R (1990), “The dengue viruses”, Clinical Microbiology Reviews, 3(4), pp 376 – 396 Minetaro Arita, Hua Ling, Dongmei Yan, Yorihino Nishimura, Hiromu Yoshida, Takaji Wakita and Hiroyuki Shimizu (2009) ‘Development of reverse transcription (RT-LAMP) system for a highly sensitive detection of enterovirus in the stool samples of acute flaccid paralysis cases’ BMC Infectious Diseases, 9:208 Lei CHEN, Xue-zheng FAN, Qin WANG, Lu XU, Qi-zu ZHAO, Yuanchen ZHOU, Jun LIU, Bo TANG and Xing-qi ZOU (2010), “A Novel RTLAMP Assay for Rapid and Simple Detection of Classical Swine Fever Virus”, Virologica Sinica, 25(1):59-64 Fujino, M., Yoshida, N., Yamaguchi, S., Hosaka, O., Notomi, T., and Nakayama, T (2005) “A simple method for the detection of measles virus genome by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)”, Journal of Medical Virology 76 406-413 10 Ha DQ, Huong VT, Loan HT, Ngu VTT, Dao HTN, Thang CM (2003), “Virological and Serological Surveillance of Dengue Epidemics in 19 Provinces in Southern Viet Nam during 2001” Dengue Bulletin 27:46-51 11 Ihira M, Yoshikawa T, Enomoto Y, Akimoto S, Ohashi M, Suga S, Nishimura N, Ozaki T, Nishiyama Y, Notomi T, Ohta Y, Asano Y (2004) “Rapid diagnosis of human herpesvirus infection by a novel DNA amplification method, loop-mediated isothermal amplification”, Journal of Clinical Microbiology 42: 140–145 12 Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K (2003) “Loopmediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M avium, and M intracellulare in sputum samples”, Journal of Clinical Microbiology 41: 2616–2622 13 Kuboki N,, Inoue N, Sakurai T, Di Cello F, Grab DJ, Suzuki H, Sugimoto C, Igarashi I (2003) “Loopmediated isothermal amplification for detection of African trypanosomes”, Journal of Clinical Microbiology 41 5517– 5524 14 Maruyama, F., Kenzaka, T., Yamaguchi, N., Tani, K., Nasu, M (2003), “Detection of bacteria carrying the stx2 gene by in situ loopmediated isothermal amplification”, Applied Enviromental Microbiology 69: 5023–5028 15 Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N and Hase T (2000), “Loop-mediated isothermal amplification of DNA”, Nucleic Acids Research 28 (12) e63 i-vii 16 Osawa, R., Yoshida, A., Masakiyo, Y., Nagashima, S., Ansai, T., Watari, T., Notomi, T., Takehara, T (2007) “Rapid detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans using a loop-mediated isothermal amplification method”, Oral Microbiology Immunology 22: 252-259 17 M M Parida (2008), “Rapid and real-time detection technologies for emerging viruses of biomedical importance”, J.Biosci.33(4), 617-628 18 Manmohan Parida, Kouhei Horioke, Hiroyuki Ishida, Shingo Inoue and Kouichi Morita (2004), “Rapid detection and differentiation of dengue virus serotypes by RT-LAMP”, Dengue diagnostics: proceedings of an international workshop, WHO/TDR, Geneva, Switzerland, 4-6 October 2004, pp 68-72 19 Modis Y., Ogata S., Clements D., Harrion S.C (2005), “Variable surface epitopes in the crytal structure of dengue virus type envelope glycoprotein”, Journal Virology, 79(2), pp 1223-1231 20 Marianneau P (1997), La dengue, Virologie, 2, pp 199-204 21 World Health Organization (2009) – Dengue: Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control, New edition, World Health Organization, Geneva, Switzerland, pp.98 – 100 22 World health Organization (2012), Global strategy for dengue prevention and control 2012-2020, World Health Organization, Geneva, Switzerland, pp.2 23 World health Organization (2011), Region Office for South East Asia Comprehensive Guidelines for Prevention and Control of Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever, Revised and expanded editon, SEARO Technical Publication Series No 60, pp.3-6 24 Yasuyoshi Mori, Tsugunori Notomi (2009), “Loop-mediated isithermal amplication (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases”, J Infect Chemother, 15:62-69 25 Zhang C (2004), “Problems encountered in the molecular detection of dengue viruses”, Dengue diagnostics: proceedings of an international workshop, WHO/TDR, Geneva, Switzerland, 4-6 October 2004, pp 60-66 Trang web 26 http://www.nihe.org.vn/new-vn/chuong-trinh-phong-chong-sot-xuathuyet/129/Danh-gia-ket-qua-thuc-hien-Du-an-giai-doan-2001 2005.vhtm 27 http://www.pasteur-hcm.org.vn/ng_cuu/DenSXH/chuyendeSXH.htm 28 http://suckhoedoisong.vn/20110607111029110p0c63/chan-doan-va-dieutri-sot-xuat-huyet-dengue.htm 29 http://loopamp.eiken.co.jp/e/about.html 30 http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs117/en/index.html 31 http://www.who.int/topics/dengue/en/index.html 32 http://www.huemed-univ.edu.vn/?cat_id=46&id=218 33 http://www.wpro.who.int/emerging_diseases/dengue.maps/en/index.html ... tài ? ?Nghiên cứu xây dựng phương pháp RT- LAMP (Reverse Transcription Loopmediated isothermal amplification) để phát virus Dengue? ?? phục vụ phát triển sinh phẩm chẩn đoán nhanh virus Dengue phù hợp... với RT- PCR Phương pháp RT- LAMP phát nồng độ virus khoản 0,01-10 PFU, cụ thể 10 PFU Dengue 1; 0,01 Dengue Dengue 3; 0,1 PFU Dengue Nghiên cứu mức độ phát mẫu dương tính RT- LAMP, RT- PCR phân lập virus. .. 1.3.3.1 Phương pháp RT- PCR 14 1.2.3.2 Phương pháp Real-time RT- PCR 15 1.4 Phương pháp RT- LAMP 16 1.4.1 Cơ chế hoạt động RT- LAMP 16 1.4.2 Ứng dụng phương pháp RT- LAMP