Xây dựng được phương pháp phát hiện nhanh virus WSSV và IHHNV gây bệnh trên tôm bằng kỹ thuật LAMP (Loopmediated isothermal amplification)Thiết ke primer và tối ưu hóa phương pháp LAMPKhảo sát độ nhạy của phương phápKhảo sát độ đặc hiệu của phương pháp và so sánh với phương pháp PCR
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHẠM THỊ HUYỀN TRANG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAMP (LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION) TRONG PHÁT HIỆN NHANH VIRUS WSSV VÀ IHHNV GÂY BỆNH TRÊN TƠM « Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - ĐHQG Tp-HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tấn Trung Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ •••• Họ tên học viên: Phạm Thị Huyền Trang MSHV: 7140871 Ngày, tháng, năm sinh: 04/07/1988 Nơi sinh: Nghệ An Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201 TÊN ĐỀ TÀI: Ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) I phát nhanh virus WSSV IHHNV gây bệnh tôm II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xây dựng phương pháp phát nhanh virus WSSV IHHNV gây bệnh tôm kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) - Thiết ke primer tối ưu hóa phương pháp LAMP - Khảo sát độ nhạy phương pháp - Khảo sát độ đặc hiệu phương pháp so sánh với phương pháp PCR III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/01/2018 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 10/12/2018 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Tấn Trung Tp HCM, ngày tháng năm 2018 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS Nguyễn Tấn Trung CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn: - TS Nguyễn Tấn Trung hướng dẫn tận tình giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu luận văn Thạc sĩ - Các thầy cô Khoa Kỹ Thuật Hóa học, Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, sau đại học trường Đại học Bách Khoa TPHCM - Các anh chị bạn phòng xét nghiệm thuộc Viện Sinh học phân Tử Loci tạo điều kiện tốt để thực luận văn tốt nghiệp - Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đĩnh động viên, hỗ trợ mặt để tơi hồn thành tốt nghiên cứu TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Chúng tơi thực nghiên cứu nhằm mục đích xây dựng phương pháp phát nhanh virus WSSV IHHNV gây bệnh tôm kỹ thuật LAMP, giúp cho phòng thí nghiệm với trang thiết bị đơn giản thực xét nghiệm bệnh tôm Trong nghiêm cứu tiến hành thiết kế cặp mồi cho phản ứng LAMP phát tác nhân WSSV IHHNV Tối ưu hóa nồng độ betaine cho vào phản ứng LAMP-WSSV IM LAMP-IHHNV 0.8M xác định độ nhạy phản ứng LAMP 25 copy DNA virus Đồng thời với mồi thiết kế cho phản ứng LAMP WSSV IHHNV theo khảo sát số mẫu thực nghiệm có độ đặc hiệu 100%, tương đồng với kết PCR We conducted this study in order to develop a rapid detection method for wssv and IHHNV by LAMP technique, enabling simple laboratory equipment to perform Disease testing on shrimp In this study we have designed pairs of primers for each LAMP reaction to detect wssv and IHHNV Optimization of betaine concentration in LAMP-WSSV reaction was 1M and for LAMP-IHHNV was 0.8M The sensitivity of the LAMP reaction is 25 copies of the DNA virus Simultaneously with the primer design for LAMP wssv and IHHNV reactions according to our survey in some specimens has a specificity of 100%, similar to the PCR results LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng Các số liệu sử dụng phân tích luận văn có nguồn gốc rõ ràng, công bố theo quy định Các kết nghiên cứu luận văn tụ tìm hiểu, phân tích cách trung thục, khách quan phù hợp với thục tiễn Việt Nam Các kết chua đuợc công bố nghiên cứu khác Học viên Phạm Thị Huyền Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU Mục tiêu đề tài CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát thực trạng nghề nuôi tôm Việt Nam 1.1.1 Tình hình ni tơm Việt Nam 1.1.2 Tình hình dịch bệnh tơm 1.2 Virus gây bệnh đốm trắng tôm (WSSV) 1.2.1 Phân loại cấu tạo Virus 1.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 11 1.2.3 Cơ chế gây nhiễm Kiểu lan truyền 12 1.3 Bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô 14 1.3.1 Phân loại cấu trúc virus 15 1.3.2 Dấu bệnh lý 16 1.3.3 Phân bố lan truyền 17 1.4 Các phương pháp phát 18 1.4.1 Phương pháp mô học: 18 1.4.2 Phương pháp lai phân tử 19 1.4.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 20 1.4.4 Phương pháp DNA Real time PCR 21 1.4.5 Phương pháp LAMP 22 1.4.5.1 Nguyên tắc phương pháp 22 1.4.5.2 Cơ chế phản ứng LAMP 23 1.4.5.3 Hiển thị kết LAMP 28 1.4.5.4 Ưu điểm phương pháp LAMP 30 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGIÊN CỨU 33 2.1 Vật liệu nghiên cứu 33 2.1.1 Mầu thí nghiệm 33 2.1.2 Máy móc, trang thiết bị 33 2.1.3 2.2 Hóa chất, vật tư dùng cho thí nghiệm: 34 Phương pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Thiết kế primer (thiết kế mồi) 36 2.2.2 Tối ưu hóa phản ứng LAMP 36 2.2.3 Tiến hành kiểm tra độ nhạy phản ứng LAMP PCR 38 2.2.4 Tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu phưong pháp LAMP 39 2.2.4.1 Thu nhận xử lý mẫu 39 2.2.4.2 Tách chiết DNA tổng số 40 2.2.4.3 Thực phản ứng LAMP tất mẫu thực nghiệm 41 2.2.4.4 Thực phản ứng PCR kiểm chứng kết phản ứng LAMP 41 2.2.4.5 Đối chiếu kết LAMP kết PCR 43 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 44 3.1 Thiết kế primer 44 3.2 Kết tối ưu hóa phản ứng LAMP 48 3.2.1 Kết tối ưu hóa nồng độ betaine 48 3.2.2 Xác định thời gian phản ứng LAMP 52 3.2 Khảo sát độ nhạy phản ứng LAMP 56 3.3 Khảo sát độ đặc hiệu độchọn lọc phương pháp LAMP 59 3.3.1 Thực phản ứng LAMP mẫu thực nghiệm 59 3.3.2 Ket chạy mẫu thực nghiệm phương pháp PCR 65 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1 Kết luận 71 4.2 Kiến nghị 72 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT LAMP Loop-mediated isothermal amplification wssv White spot syndrome virus IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus EMS Early Mortality Syndrome MBV Monodon Baculovirus PCR ISH Polymerase Chain Reaction In-situ hybdridization NHB Hydroxy Naphthol blue Disodium VASEP Vietnam Association of Seafood Exporters and Producers DNA DeoxyriboNucleic Acid DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng thông kê dịch bênh tôm từ năm 2014-2016 Bảng 1.2 Thống kê dịch bệnh WSSV từ năm 2014-2016 Bảng 1.3 Những ưu nhược điểm phương pháp phát 31 Bảng 2.1 Kích thước mẫu thí nghiệm 33 Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng LAMP WSSV IHHNV 37 Bảng 2.3 công thức pha mix PCR phát WSSV 42 Bảng 2.4 công thức pha mix PCR phát IHHNV 42 Bảng 3.1 Thông tin gene chủng virus WSSV virus IHHNV 45 Bảng 3.2 Trình tự primer cho phản ứng LAMP phát WSSV 48 Bảng 3.3 Trình tự primer cho phản ứng LAMP phát IHHNV 48 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng LAMP-WSSV 53 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng LAMP-IHNV 54 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất phản ứng LAMP cho chứng nội DEC A 59 Bảng 3.7 Phân tích kết LAMP 60 Hình 3.14 Kết điện di cho sản phẩm phản ứng LAMP cho 10 mẫu dương tính WSSY (tương ứng với hình 3.13) Giếng mẫu chứng dương, tơm nhiễm WSSV Từ giếng đến giếng 11 mẫu tơm dương tính với WSSV Giếng 12 13 mẫu tơm âm tính với WSSV Hình 3.15 Kết điện di cho sản phẩm phản úng LAMP chứng nội tạỉ cho 10 mẫu dương tính WSSV (tương ứng với hình 3.12) 62 Sau chạy phản ứng LAMP với mẫu dương tính tác nhân tiến hành chạy xác định độ đặc hiệu phương pháp LAMP Đe kiểm tra độ đặc hiệu phương pháp LAMP phát WSSV Trong thí nghiệm này, sử dụng phản ứng LAMP cho WSSV chạy 10 mẫu tơm nhiễm vói IHHNV, hay nhiễm với M baculovirus (MBV), hay nhiễm với V parahaemolytỉcus (EMS) MIX LAMP - wssv ề jf f * v f * h f s ir ề 41 41 Các mẫu dương tính vói IHHNV; MBV; EMS (■) (-) WSSV t1 rrr****^*** ket q chạy chứng nơi Hình 3.16 Kết LAMP dùng để phát WSSV chạy cho 10 mẫu tơm nhiễm với IHHNV (từ vị trí đến 4) hay M baculovirus (MBV) (từ vị trí đến 7), V parahaemolytỉcus (EMS) (từ vị trí đến 10) Các ống tương ứng bên kết LAMP chạy chứng nội DEC A 10 mẫu tôm (+) mẫu chứng dương với tôm nhiễm WSSV (-) mẫu tơm khoẻ mạnh âm tính với WSSV Màu tím phản ứng LAMP khơng xảy màu xanh phản ứng LAMP xảy diện HNB Dung dịch ống phản ứng tất mẫu dương tính vói tác nhân khác mà khơng phải WSSV có màu tím với chứng âm Các mẫu chạy với hỗn hợp phản ứng LAMP gen nội DECA tơm tất có màu xanh hiển thị phản ứng LAMP có xảy kết âm tính khắng định chắn (hình 3.16) Ket cho thấy phản ứng LAMP đặc hiệu đối 63 với mẫu dương tính với WSSV mà khơng có phản ứng chéo với tác nhân gây bệnh khác Tương tự tiến hành thực phản ứng LAMP 10 mẫu tơm chẩn đốn dương tính với IHHNV Kết cho thấy tất 10 mẫu cho phản ứng dương tính với IHHNV, dung dịch ống phản ứng chuyển thành màu xanh trùng khớp với ống đối chứng dương Mẩu đối chứng âm có màu tím (hình 3.17) [tf T ĩ L ĩ ĩ y III (+) II 12 13 14 15 16 17 18 ẼI* ■ 19 110 (-) (-) Hình 3.17 Kết LAMP cho 10 mẫu tơm dương tính với IHHNV (+) mẫu chứng dương với tôm nhiễm IHHNV Từ II đến 110 mẫu tơm dương tính với IHHNV (-) mẫu tơm khoẻ mạnh âm tính với IHHNV Màu tím phản ứng LAMP khơng xảy màu xanh phản ứng LAMP xảy diện HNB Sau khỉ tiến hành chạy kiểm tra 10 mẫu dương tính EHHNV phản ứng LAMP cho IHHNV nghiên cứu chạy mẫu dương tính với tác nhân khác IHHNV, hay M baculovỉrus (MBV), hay V parahaemolyticus (EMS) để kiểm tra độ chọn lọc phản ứng LAMP đối vối tác nhân IHHNV 64 MIX LAMP-IHHNV (+) IHHNV Các mầu dương tính với WSSV; MBV; EMS ÍT V V If Mí tV»t Ket chứng nội mẫu Hình 3.18 Kết LAMP dùng để phát IHHNV chạy cho 10 mẫu tơm nhiễm với WSSV (từ vị trí đến 4) hay M baculovỉrus (MBV) (từ vị trí đến 7), V parahaemolytỉcus (EMS) (từ vị trí đến 10) Các ống tương ứng bên dưói kết LAMP chạy chứng nội DECA 10 mẫu tôm (+) mẫu chứng dương với tôm nhiễm IHHNV (-) mẫu tơm khoẻ mạnh âm tính với IHHNV Màu tím phản ứng LAMP khơng xảy màu xanh phản ứng LAMP xảy diện HNB Kết thu nhận cho thấy ống đối chứng dương IHHNV có màu xanh Tất ống phản ứng mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh khác IHHNV có màu tím giống với mẫu đối chứng âm chứng tỏ khơng có phản ứng LAMP xảy ống phản ứng Ket chạy chứng nội tơm cho kết dương tính Như phản ứng LAMP cho IHHNV đặc hiệu tác nhân IHHNV mà khơng có phản ứng chéo khuếch đại tác nhân gây bệnh khác tôm 3.3.2 Kết chạy mẫu thực nghiệm phương pháp PCR Để kiểm tra độ đặc hiệu phương pháp LAMP phát WSSV mẫu tơm dương tính với WSSV, chúng tơi tiến hành chạy song song, độc lập 65 phương pháp PCR để đối chiếu kết với phản ứng LAMP Tất mẫu gồm 10 mẫu dương tính với wss V mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh khác chạy phản ứng PCR với hỗn hợp phản ứng PCR đặc hiệu cho WSSV (xem Vật liệu - Phương Pháp) Hình 3.19 Kết chạy PCR cho 10 mẫu WSSV dương tính sử dụng cho phản ứng LAMP với WSSV (sử dụng kit LOCI) Vị trí băng sản phẩm khuyếch đại chuyên biệt cho WSSV chửng nội DECA rõ hình Giếng M thang DNA lkb Giếng mẫu chứng dương tơm nhiễm WSSV có vạch 139 bp WSSV 190 bp chứng nội DECA Giếng đến giếng 11 làio mẫu tơm bệnh dương tính với WSSV cho vạch giống chứng dương Giếng 12 mẫu chứng âm Theo hướng dẫn sử dụng kit PCR cho WSSV nhà sản xuất mẫu dương tính với WSSV có vạch khoảng 139bp vạch chạy chứng nội khoảng 190 bp Kết điện di gel agarose tất 10 mẫu tôm khảo sát có vạch 139 bp WSSV 190 bp gene nội DECA tơm (hình 3.19), chứng tỏ mẫu tơm khảo sát dương tính vói WSSV, cho kết độc lập phù hợp vód kết từ phản ứng LAMP cho WSSV 66 Các mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh lại bao gồm IHHNV, hay M bacuỉovirus (MBV), hay V parahaemolyticus (EMS) chạy phản ứng PCR phát WSSV cho kết âm tính (hình 3.20) Hình 3.20 Kết chạy PCR cho 10 mẫu tôm nhiễm tác nhân khác với IHHNV (từ vị trí đến 5) hay M bacuỉơvirus (MBV) (từ vị trí đến 8), V parahaemoỉyticus (EMS) (từ vị trí đến 11) sử dụng cho phản ứng LAMP với WSSV bên (sử dụng kit LOCI cho PCR) VỊ trí băng sản phẩm khuyếch đại chuyên biệt cho WSSV chứng nội DECA rõ hình Giếng M thang DNA lkb Giếng mẫu chứng dương tơm nhiễm WSSV có vạch 139 bp WSSV 190 bp chứng nội DECA Giếng 12 mẫu chứng âm Kết chạy PCR trùng khớp với kết phát WSSV mẫu tôm nhiễm bệnh phương pháp LAMP Như độ đặc hiệu phương pháp LAMP phát WSSV tương tương với phương pháp PCR Tương tự chúng tối tiến hành chạy phản ứng PCR phát IHHNV 10 mẫu dương tính với IHHNV mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh khác wssv, hay M baculovỉrus (MBV), hay V, parahaemoỉyticus (EMS) 67 Hình 3.21 Kết chạy PCR cho 10 mẫu IHHNV dương tính sử dụng cho phản ứng LAMP với IHHNV (sử dụng kit cùa LOCI) Vị trí băng sản phẩm khuyếch đại chuyên biệt cho WSSV chứng nội DECA rõ hình Giếng M thang DNA lkb Giếng mẫu chứng dương tơm nhiễm IHHNV có vạch 309 bp WSSV 190 bp chứng nội DECA Giếng đến giếng 11 10 mẫu tôm bệnh dương tính với IHHNV cho vạch giống chứng dương Giếng 12 mẫu chứng âm 34 6M7 10 11 12 Hình 3.22 Kết chạy PCR cho 10 mẫu tôm nhiễm tác nhân khác vối WSSV (từ vị trí đến 5) hay M baculovirus (MB V) (từ vị trí đến 8), V parahaemolyticus (EMS) (từ vị trí đến 11) sử dụng cho phản ứng LAMP với IHHNV bên (sử dụng kỉt LOCỈ cho PCR) Vị trí cảc băng sản phẩm khuyếch đại chuyên biệt cho IHHNV chứng nội DECA IÕ hình Giếng M thang 68 DNA lkb Giếng mẫu chứng dương tơm nhiễm IHHNV có vạch 309 bp WSSV 190 bp chứng nội DECA Giếng 12 mẫu chứng âm Theo hướng dẫn sử dụng kit PCR cho IHHNV nhà sản xuất, mẫu dương tính với IHHNV điện di có vạch 309 bp, chứng nội có vạch 190 bp Kết chạy 10 mẫu tôm nhiễm IHHNV có vạch 190 bp chứng nội DECA 309 bp IHHNV điều có nghĩa mẫu dương tính với IHHNV Các mẫu tôm nhiễm tác nhân gây bệnh khác có vạch 190 bp chứng nội không xuất vạch 309 bp IHHNV tất mẫu âm tính chạy với hỗn họp PCR phát IHHNV Kết hồn tồn trùng khóp với kết khảo sát phương pháp LAMP phát IHHNV mẫu tôm bệnh phẩm nhiễm IHHNV mẫu tôm nhiễm với tác nhân khác Như nghiên cứu phương pháp LAMP phát IHHNV mà khảo sát có độ đặc hiệu tương đương với phương pháp PCR sử dụng kit thương mại 69 Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận Thông qua kết thu nhận từ đề tài bước đầu xây dựng thành công phương pháp LAMP giúp phát nhanh mẫu tôm bị nhiễm bệnh wss V hay IHHNV Phản ứng LAMP tối ưu hóa để phát WSSV hay IHHNV sau Thành phần Thể tích Nồng độ cuối 2.5 pl phản ứng IX dNTP Mix (10 mM) 3.5 pl 1.4 mM FIP Primers (40 pM) lpl 1.6 pM BIP Primers (40 pM) lpl 1.6 pM F3 Primers (5pM) lpl 0.2 pM B3 Primers (5pM) lpl 0.2 pM lpl 0.32 u/ul 10X Isothermal Amplification Buffer Bst 2.0 DNA Polymerase (8,000 u/ml) Betaine (0.8MchoWSSV hay 0.6M cho lpl IHHNV) NHB (3mM) lpl DNA mẫu pl H20 8pl Tong thể tích phản ứng 25 pl 120 pM Phản ứng LAMP thực điều kiện nhiệt độ 65 °c thời gian 80 phút cho kết nhanh hiển thị thay đối màu sắc rõ nét Độ nhạy phương pháp LAMP khảo sát từ 25 copy DNA hay IHHNV Phương pháp có độ nhạy thấp so với phương pháp 70 wssv PCR đảm bảo độ nhạy cho việc xét nghiệm mẫu tôm nhiễm bệnh wssv hay IHHNV Độ đặc hiệu phưong pháp LAMP nghiên cứu tưong đưong với độ đặc hiệu phưong pháp PCR Như với ưu điểm nhanh, dễ thực hiện, sử dụng trang thiết bị đon giản, với giá thành phù hợp đảm bảo độ nhạy độ đặc hiệu, phưcmg pháp LAMP phát WSSV IHHNV mà nghiên cứu có ý nghĩa thiết thực cho ngưòi dân ni tôm, kết hợp với phưcmg pháp tách chiết mẫu tôm bệnh phẩm đon giản nêu phần vật liệu - phưong pháp 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát thêm nhiều mẫu tôm thực nghiệm (nhiễm bệnh bất kỳ, hay wssv hay IHHNV) để tăng độ tin cậy việc xác định độ đặc hiệu phản ứng LAMP - Tiến hành thử nghiệm thêm độ bền hóa chất phản ứng để tiến hành xây dựng thành kit thưong phẩm 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Quang Tề (2004): Giáo trình bệnh học thủy sản VIỆN NGHIÊN cứu NI TRỒNG THỦY SẢN I Bùi Thị Bích Hằng Timothy w Fleg 2007 Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu vỏ (IHHNV) tơm Penaeid Tạp chí khoa học 2008(1): 170- 175 Chen, L.L., Wang, H.C., Huang, C.J., Peng, S.E., Chen, Y.G., Lin, S.J., Chen, W.Y., Dai, C.F., Yu, H.T., Wang, C.H Lo, C.F.* and Kou, G.H (2002) Transcriptional analysis of the DNA polymerase gene of shrimp white spot syndrome virus (WSSV) Virology, 301, 136-147 Chou HY, Huang CY, Wang CH, Chiang HC, Lo CF (1995) Pathogenicity of a baculovirus infection causing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan Dis Aquat Org 23:165-173 Christopher M A Caipang, May Flor s Muegue and Jane s Geduspan Utilization of the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of pathogens in shrimp and fish aquaculture in the Philippines Research Signpost 37/661 (2), Fort p.o Trivandrum-695 023 Kerala, India C.M Escobedo-Bonilla, V Alday-Sanz, M Wille, p Sorgeloos, M.B Pensaert, H.J Nauwynck A review on the morphology, molecular characterization, morphogenesis and pathogenesis of white spot syndrome virus J Fish Dis., 31 (2008), pp 1-18 Đặng Thị Hoàng Oanh (2009) Prevalence of White Spot Syndrome Virus (WSSV) and Monodon Baculovirus (MBV) Infection in Penaeus monodon Postlarvae in Vietnam Tạp chí khoa học ĐẠÍ Hoc Can Thơ Đặng Thị Hồng Oanh (2008) Giáo trình ngun lý kỹ thuật chấn đoán bệnh thủy sản Đại Học cẩn Thơ 72 Durand, s., Lightner, D.V., Redman, R.M., Bonami, J.R., 1997 Ultrastructure and morphogenesis of white spot syndrome baculovirus (WSSV) Dis Aquat Org 29, 205- 211 10 Eiken GENOME SITE ( Eiken chemical CO.Ltd website) The LAMP methode provides a “simple, rapid, specific and cost effective" genetic test method for detecting known genes 11 Goto M., Honda E., Ogura A., Nomoto A and Hanaki K.-L, 2009, Colorimetric detection of loop- mediated isothermal amplifcation reaction by using hydroxy naphthol blue BioTechniques, 46, 167-172 12 George, G., Mony, p & Kenneth, J Comparison of the efficacies of loop- mediated isothermal amplification, fluorescence smear microscopy and culture for the diagnosis of tuberculosis PloS one 6, e21007 doi: 10.1371/journal.pone.0021007 (2011) 13 Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn (2012) Kỹ thuật LAMP hướng việc tạo kit phát nhanh bệnh truyền nhiễm Tạp chí KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ 90(02) 43 - 48 14 Karunasagar, I., Otta, S.K., Karunasagar, I., 1997 Histopathological and bacteriological study of white spot syndrome of Penaeus monodon along the west coast of India Aquaculture 153, 9-13 15 Leu, J.-H., Tsai, J.-M., Wang, H.-C., Wang, A H.-J., Wang, C.-H., Kou, G.- H & Lo, C.-F (2005) The unique stacked rings in the nucleocapsid of the white spot syndrome virus virion are formed by the major structural protein VP664, the largest viral structural protein ever found J Virol 79, 140-149 16 Li, L J., J F Yuan, c A Cai, w G Gu, and z L Shi 2006 Multiple envelope proteins are involved in white spot syndrome virus (WSSV) infection in crayfish Arch Virol 151:1309-1317 n.Lightner, D V 1999 The Penaeid Shrimp Viral Pandemics due to IHHNV, wssv, TSV, and YHV History in the Americas and Current Status in the Americas, available diagnostic methods and management strategies Journal of Applied Aquaculture 9: 27-52 73 18 Lightner D.V., RedmanR.M., Bell T.A & Brock J.A (1988) Detection of IHHN virus in Penaeus stylirostris and p vannamei imported into Hawaii J World Mariculture Soc., 14, 212-225 19 Lo CF, Ho CH, Peng SE, Chen CH, Hsu HC, Chiu YL, Chang CF, Liu KF, Su MS, Wang CH, Kou GH (1996) White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimp, crabs and other arthropods Dis Aquat Org 27:215-225 20 Mori Y., Nagamine K., Tomita N and Notomi T., 2001, Detection of Loop- Mediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation Biochem Biophys Res., 289(1), ISO- 154 21 Motoki Gotol, Eiichi Honda, Atsuo Ogura, Akio Nomoto, and Ken-Ichi Hanaki Colorimetric detection of loopmediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue BioTechniques 46:167-172 (March 2009) 22 Njiru, z K Rapid and sensitive detection of human African trypanosomiasis by loop- mediated isothermal amplification combined with a lateral-flow dipstick Diagn Microbiol Infect Dis 69, 205-209 (2011) 23 Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N and Hase T., 2000 Loop-mediated isothermal amplification of DNA Nucleic Acids Res., 28(12), 24 Ngô Hong Anh (2011): So sánh hiệu xác định gen giới tính đơng vật hữu nhũ phương pháp PCR phương pháp LAMP Luận văn thạc sĩ sinh học, trường đại học Khoa Học Tự Nhiên 25 Parida M., Sannarangaiah s., Dash p K., Rao p V L and Morita K., 2008, Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases Reviews in Medical Virology, 18(6), 407-421 26 Phạm Hùng Vân (2003) PCR vẩn đề Sinh học phân tử Nhà xuất Y học 74 27 Phạm Hùng Vân (2009) PCR real-time PCR: Các vẩn đề áp dụng thường gặp Sinh học phân tử Nhà xuất Y học Trang 9-35 28 Rai et al., 2009 p Rai, B Pradeep, M.p Safeena, I Karunasagar, I Karunasagar Simultaneous presence of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) and Type A virus-related sequence in Penaeus monodon India Aquaculture, 295 (2009), pp 168-174 29 Tang K.F.J., Poulos B.T., Wang J., Redman R.M., Shih, H.H & Lightner D.v (2003) Geographic variations among infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) isolates and characteristics of their infection Dis Aquat Org 53, 91-99 30 Thinnarat Srisuvan Tuangthong Patchimasiri Chainarong Kunchim Supansa Tangdee Nittaya Sisathan (2013) Rapid and visual detection of white spot syndrome virus by loop-mediated isothermal amplification Thai-NIAH eJournal: ISSN 1905-5048 31 Tsai, J.-M., H.-C Wang, J.-H Leu, H.-H Hsiao, A H.-J Wang, G.-H Kou, and C.F Lo 2004 Genomic and proteomic analysis of thirty-nine structural proteins of shrimp white spot syndrome virus J Virol 78:11360-11370 32 van Hulten, M c w., Tsai, M F., Schipper, c A., Lo, c F., Kou, G H & Vlak, J M (2000a) Analysis of a genomic segment of white spot syndrome virus of shrimp containing ribonucleotide reductase genes and repeat regions J Gen Virol 81, 307-316 33 Van Hulten MCW, Goldbach RW, Vlak JM (2001) Three functionally diverged major structural proteins of white spot syndrome virus evolved by gene duplication J Gen Virol 81:2525-2529 34 Xiangjiu Kong, Wentao Qin, Xiaoqing Huang, Fanfang Kong, Cor D Schoen, Jie Feng, Zhongyue Wang & Hao Zhang (2016) Development and application of loopmediated isothermal amplification (LAMP) for detection of Plasmopara viticola Scientific Reports I 6:28935 I DOI: 10.1038/srep28935 75 35 Xie, X., L Xu, and F Yang 2006 Proteomic analysis of the major envelope and nucleocapsid proteins of white spot syndrome virus J Virol 80:10615- 10623 36 Zhibing Lin, Yanlei Zhang, Houshuang Zhang, Yongzhi Zhou, Jie Cao, Jinlin Zhou Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis Veterinary Parasitology 185 (2012) 296- 300 37 Zhu Y.B., Li H.Y & Yang F (2006) Identification of an envelope protein (VP39) gene from white spot syndrome virus Archives of Virology 151,71- 82 38 Zhu Y., Ding Q & Yang F (2007) Characterization of a homologous-regionbinding protein from white spot syndrome virus by phage display Virus Research 125, 145- 152 39 Arturo SA 'NCHEZ-PAZ White spot syndrome virus: an overview on an emergent concern INRA, EDP Sciences, 2010 40 Witteveldt J., Vlak J.M., van Hulten M.C.W., Protection ofPenaeus monodon against white spot syndrome virus using a wssv subunit vaccine, Fish Shellfish Immunol (2004) 16:571-579 41 Wu c., Yang F., Localization studies of two white spot syndrome virus structural proteins VP51 and VP76, Virol J (2006) 3:1-8 42 Wang C.H., Lo C.F., Leu J.H., Chou C.M., Yeh P.Y., Chou H.Y., et al„ Purification and genomic analysis of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) of Penaeus monodon, Dis Aquat Organ (1995) 23:239- 242 43 Christopher M A Caipangl, May Flor s Muegue2 and Jane s Geduspan2 Utilization of the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection of pathogens in shrimp and fish aquaculture in the Philippines Biotechnological Advances in Shrimp Health Management in the Philippines, 2015: 149-163 81-308-0558-0 76 ISBN: 978- ... Ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) I phát nhanh virus WSSV IHHNV gây bệnh tôm II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Xây dựng phương pháp phát nhanh virus WSSV IHHNV gây bệnh tôm. .. việc phát bệnh gây vi khuẩn hay virus Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn nêu tiến hành thực đề tài “ ứng dụng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) phát nhanh virus WSSV IHHNV gây bệnh. .. môi trường sinh thái gây ô nhiễm môi trường bùng phát dịch bệnh Virus gây bệnh tôm đối tượng gây thiệt hại đáng kể cho người ni tơm, virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) virus gây bệnh hoại tử quan tạo