ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH học TRONG bảo tồn và PHÁT TRIỂN LOÀI LAN hài đặc hữu KHU vực MIỀN núi PHÍA bắc có NGUY cơ TUYỆT CHỦNG

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO TỒN VÀ PHÁT TRIỂN LOÀI LAN HÀI ĐẶC HỮU KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC CĨ NGUY CƠ TUYỆT CHỦNG Mã số: B2013-11-33 Cơ quan chủ trì đề tài: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Đơn vị thực hiện: Viện Sinh học Nơng nghiệp Hà Nội – 2015 BỘ NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI Ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn phát triển loài Lan Hài đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc có nguy tuyệt chủng Mã số: B2013-11-33 DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI TT Họ tên Chức vụ TS Hoàng Thị Nga Chủ nhiệm đề Viện sinh học Nông nghiệp- Học tài viện Nông nghiệp Việt Nam ThS Nguyễn Thị Sơn Thư ký đề tài Đỗ Thị Hương Loan Kế toán đề tài Viện sinh học Nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam GS.TS Nguyễn Quang Thạch Thành viên tham gia Viện sinh học Nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh Thành viên tham gia Viện sinh học Nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam ThS Trần Thế Mai Thành viên tham gia Viện sinh học Nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam KS Nguyễn Thị Hân Thành viên tham gia Viện sinh học Nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam ThS Nguyễn Thị Thanh Phương Thành viên tham gia Viện sinh học Nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ks Lê Văn Vy Thành viên tham gia Vườn Quốc gia Hoàng Liên i Địa công tác Viện sinh học Nông nghiệp- Học viện Nông nghiệp Việt Nam BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thơng tin chung: - Tên đề tài:Ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn phát triển loài Lan Hài đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc có nguy tuyệt chủng - Mã số: B2013-11-33 - Chủ nhiệm: TS Hồng Thị Nga - Cơ quan chủ trì: Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Thời gian thực hiện: Từ tháng 01 năm 2013 đến tháng 12 năm 2015 Tóm tắt đề tài 2.1 Mục đích nghiên cứu đề tài + Thu thập 02 loài lan Hài P.dianthum P.purpuratum có sách đỏ Việt Nam + Xây dựng quy trình nhân nhanh (01 quy trình) + Xây dựng quy trình lưu giữ in vitro cho loài lan Hài P.dianthum P.purpuratum 200 bình mẫu giống lưu giữ phòng + Xây dựng vườn mơ hình trồng (300 m 2) bảo tồn vườn mơ hình chậu lồi (mỗi chậu có 3-5 đơn vị cây) ii 2.2 Kết nghiên cứu thực 2.2.1 Nội dung cần thực STT Các nội dung công việc cần thực Thiết kế thí nghiệm, chuẩn bị vật liệu Sản phẩm Đánh giá Đề cương chi tiết cho Hoàn thành nghiên cứu việc triển khai thí nghiệm, nguyên vật liệu cần thiết Nội dung Tổng hợp thơng tin phân 01 báo cáo kết Hồn thành bố nguồn gen; điều tra, thu thập 02 loài chuyên đề Lan Hài thuộc số tỉnh miền núi phía Bắc có sách đỏ Việt Nam Nội dung Đánh giá, phân loại mẫu 01 báo cáo kết Hoàn thành giống 02 loài Lan Hài P dianthum chuyển đề P.purpuratum thu thập theo số đặc điểm nông sinh học quan trọng Nội dung Nghiên cứu nhân giống 02 Hoàn thành loài Lan Hài P.dianthum P 06 báo cáo kết purpuratum công nghệ nuôi cấy mô chuyên đề tế bào Nội dung Ứng dụng phương pháp 01 báo cáo kết lưu giữ nguồn gen 02 loài Lan Hài chuyên đề P.dianthum P purpuratum 200 bình mẫu lưu giữ Nội dung Xây dựng mơ hình trồng 02 Hồn thành lồi Lan Hài P.dianthum Hoàn thành P 01báo cáo kết purpuratum vùng đệm khu bảo tồn chuyên đề vườn Quốc gia Hoàng Liên, 300m2 Nội dung 6: Tởng hợp kết quả, viết báo 02 quy trình, báo cáo Hồn thành cáo khoa học tởng kết đề tài, báo cáo tài tởng kết, báo cáo tài 2.2.2 Sản phẩm STT Tên sản phẩm Số lượng theo thuyết minh Số lượng thực tế iii Yêu cầu khoa học Đánh giá Bộ mẫu giống thực 02 loài Lan Hài Đã thu thập lưu giữ an toàn 08 vườn tiêu loài, Viện SHNN lồi – 10 vườn mơ chậu, hình 05 chậu – chậu/lồi đơn vị Quy trình nhân 01 Quy trình giống Lan Hài công nghệ nuôi cấy mô tế bào Quy trình lưu giữ 02 lồi Lan Hài P dianthum P Purpuratum in vitro 01 quy trình Lưu giữ ống nghiệm: 200 bình Mơ hình phát triển 01 mơ hình 02 lồi Lan hài vùng đệm khu bảo tồn vườn Quốc gia Hoàng Liên quy mơ 300m2 01 mơ hình Đào tạo 02 thạc sỹ Công bố báo 02 báo 02 thạc sỹ 01 kỹ sư 02 báo chung Bộ mẫu giống có lý lịch trích ngang rõ ràng cho loài Đảm bảo hệ số nhân cao, đồng đều, đạt tiêu chuẩn kỹ thuật (cao - 5cm, có - lá, - rễ/cây) Có tính ứng dụng cao, bước qui trình, rõ ràng, chi tiết, dễ hiểu, dễ ứng dụng Đảm bảo lưu giữ, bảo quản mẫu giống Lan Hài có hiệu quả, tiết kiệm tối đa chi phí cơng lao động, điện, nước, hóa chấtvà chi phí khác Các mẫu giống trì đặc tính giống Xây dựng mơ trồng trọt có hiệu cao, Cây vườn ươm cao 6cm có - lá, - rễ Đã bảo vệ Đã đăng Hoàn thành vượt mức Hoàn thành Hoàn thành Hoàn thành Hoàn thành HT 2.3 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết nghiên cứu khả áp dụng 2.31 Hiệu giáo dục đào tạo, kinh tế - xã hội Hiện nay, loài lan Hài tự nhiên bị thu hái cạn kiệt iv đưa vào “Sách đỏ Việt Nam” sản phẩm đề tài nguồn mẫu giống có giá trị góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen lan Hài cung cấp giống cho thị trường Kết nghiên cứu đề tài mở hướng công xây dựng phát triển kinh tế hộ gia đình cho đồng bào dân tộc miền núi, góp phần xóa đói giảm nghèo Ngồi hạn chế việc khai thác lan rừng, công việc vốn đầy rủi ro nguy hiểm với người dân Nguồn nhân lực thực đề tài chủ yếu đào tạo sau đại học chuyên ngành trồng trọt, Công nghệ sinh học nên trang bị tốt kiến thức, sau thực đề tài trau dồi tay nghề lý thuyết thực hành vững vàng Sản phẩm đề tài mang lại ý nghĩa kinh tế xã hội vô quan trọng tạo nguồn lợi kinh tế tạo công ăn việc làm cho người dân tỉnh miền núi phía Bắc vốn quen sống dựa vào việc khai thác nguồn lợi sẵn có thiên nhiên, giáo dục cho người dân nâng cao hiểu biết da dạng di truyền cần bảo vệ phát triển 2.3.2 Phương thức chuyển giao kết nghiên cứu địa ứng dụng 02 loài Lan hài P dianthum P purpuratumcủa đề tài nhân lên đưa trở lại vùng phân bố đặc hữu để phát triển nguồn gen phục vụ cho việc làm phong phú nguồn gen đặc hữu phát triển nguồn gen theo hướng thương mại hóa Đề tài phối hợp đơn vị, sở khoa học công nghệ tỉnh để phát triển loài địa ưu địa phương Các hình thức chuyển giao kết nghiên cứu là: - Bán quy trình cơng nghệ, đào tạo kỹ thuật, tổ chức liên doanh, liên kết với doanh nghiệp sản xuất giống hoa theo quy trình nghiên cứu - Sản phẩm đề tài sử dụng để phát triển vào sản xuất chủ yếu thơng qua chương trình bảo tồn phát triển giống hoa đặc hữu Sở Nông nghiệp PTNT - Các chương trình ứng dụng tiến khoa học kỹ thuật v sở khoa học cơng nghệ tỉnh, chương trình dự án liên hiệp hội khoa học kỹ thuật Việt Nam để chuyển giao tiến kỹ thuật vào sản xuất - Các chương trình chuyển đởi cấu kinh tế nông thôn nhằm phát triển giống hoa đặc hữu chất lượng cao cho giá trị kinh tế triển vọng vào sản xuất Hà Nội, ngày Cơ quan chủ trì tháng năm 2015 Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên) Hoàng Thị Nga vi MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Cách tiếp cận 1.4 Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu .3 1.4.1 Vật liệu nghiên cứu 1.4.2 Nội dung: 1.4.3 Phương pháp nghiên cứu PHẦN II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 2.1 Tổng hợp thông tin phân bố nguồn gen lan Hài, điều tra, thu thập 02 loài Lan Hài thuộc số tỉnh miền núi phía Bắc có sách đỏ Việt Nam 15 2.1.1 Nguồn gốc phân bố chi Paphiopedilum .15 2.1.2 Một số đặc điểm hình thái chi Paphiopedilum 15 2.1.3 Tình hình khai thác, sử dụng loại lan Hài Việt Nam .23 2.2 Đánh giá, phân loại mẫu giống 02 loài Lan Hài P.dianthum P purpuratum thu thập theo số đặc điểm nông sinh học quan trọng 24 2.2.1 Phân loại lan Hài 24 2.2.2 Nghiên cứu đánh giá khả sinh trưởng, phát triển 02 loài P dianthum P purpuratum điều khiện nuôi trồng Hà Nội .27 2.2.3 Nghiên cứu đánh giá khả hoa, tạo 02 giống P purpuratum P dianthum điều khiện nuôi trồng Hà Nội 28 2.3 Nghiên cứu nhân giống 02 loài Lan Hài P.dianthum P purpuratum công nghệ nuôi cấy mô tế bào .29 2.3.1 Tạo nguồn vật liệu khởi đầu 29 vii 2.3.2 Quá trình nhân nhanh .40 2.3.3 Q trình tạo hồn chỉnh 49 2.3.4 Ra vườn ươm 58 2.4 Lưu giữ in vitro 02 loài lan Hài 63 2.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng agar đến khả sinh trưởng Lan Hài in vitro 64 2.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng đường manitol bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng Lan Hài in vitro 67 2.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến thời gian lưu giữ mẫu loài Lan Hài in vitro 69 2.5 Các kết trình xây dựng mơ hình 70 PHẦN III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74 3.1 Kết luận 74 3.2 Đề nghị 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 PHỤ LỤC viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Bảng thống kê sơ lược tên loài, phân bố, đặc điểm sinh học, vùng sinh thái, trữ lượng loài Lan thuộc chi Paphiopedilum 19 Bảng 2: Sự sinh trưởng, phát triển lan hài P.dianthum P.purpuratum điều kiện nuôi trồng Hà Nội (sau 04 tháng) 28 Bảng 3: Sự hoa tạo nhân tạo 02 loài lan hài thu thập điều kiện nuôi trồng Hà Nội (sau 04 tháng) 29 Bảng 4: Tỷ lệ nảy mầm hạt 02 loài Lan Hài P.dianthum P.purpuratum.31 (sau 12 tuần theo dõi) 31 Bảng 5: Tỷ lệ nảy mầm 02 loài lan Hài P dianthum P purpuratum môi trường (sau 12 tuần nuôi cấy) 33 Bảng 6: Ảnh hưởng 2,4-D tới phát sinh hình thái hạt lan Hài P.dianthum sau nảy mầm (sau 12 tuần) .35 Bảng 7: Ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với BA tới phát sinh hình thái hạt lan Hài P.diathum sau nảy mầm (sau 12 tuần) 36 Bảng 8: Ảnh hưởng BA đến phát sinh hình thái callus lồi P.dianthum(sau 12 tuần nuôi cấy) 37 Bảng 9: Ảnh hưởng TDZ đến phát sinh hình thái callus lồi P.dianthum (sau 12 tuần ni cấy) .38 Bảng 10: Ảnh hưởng BA đến trình nhân nhanh hai lồi lan Hài (sau 12 tuần ni cấy) 41 Bảng 11: Ảnh hưởng TDZ đến trình nhân nhanh P.dianthum P.purpuratum (sau 12 tuần nuôi cấy) 42 Bảng 12: Ảnh hưởng BA kết hợp với α-NAA đến trình nhân nhanh 02 lồi lan Hài (sau 12 tuần ni cấy) .43 Bảng 13: Ảnh hưởng TDZ kết hợp với α-NAA đến trình nhân nhanh (sau 12 tuần nuôi cấy) 44 Bảng 14: Ảnh hưởng dịch chuối bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến q trình nhân nhanh (sau 12 tuần ni cấy) 46 Bảng 15: Ảnh hưởng dịch chuối khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả nhân nhanh (sau 12 tuần theo dõi) 48 ix - T̉i thích hợp để làm nguồn vật liệu ban đầu cho nhân giống in vitro với loài lan Hài P.purpuratumlà lan tháng sau thụ phấn, cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao 3% sau 12 tuần gieo - Trong môi trường nghiên cứu, mơi trường: ½ RE + 15 gsaccarose + 100 mlND+ g agar + 0,5 gTHT cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao 7,5% sau 12 tuần gieo - Trong q trình nhân nhanh, bở sung kết hợp chất điều tiết sinh trưởng có hiệu cải thiện hệ số nhân nhanh chồi bổ sung riêng rẽ chất Môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi lan Hài P.purpuratum là: ½ RE + 2mg/l BA+ 0,3 mg/l α-NAA +15 gsaccarose + 100 mlND+ g agar + 0,5 gTHT đạt hệ số nhân 3,43 lần sau 12 tuần nuôi cấy - Bổ sung dịch nghiền chuối khoai tây vào mơi trường ni cấy có hiệu nhân nhanh Lan Hài P purpuratum bổ sung đồng thời 100g/l chuối tiêu 50g/l khoai đạt hệ số nhân 2,54 lần sau 12 tuần nuôi cấy - Môi trường thích hợp cho lan Hài P.purpuratum sinh trưởng, phát triển: ½ RE + 15 gsaccarose + 100 mlND+ g agar + 0,5 gTHT , cho giá trị chiều cao số lá/cây cao nhất, 4,51cm 4,27 lá/cây - Cây lan Hài P.purpuratum rễ đạt 100% sau tuần nuôi cấy, số rễ trung bình 3,61 rễ/cây sau 10 tuần ni cấy mơi trường có bở sung 0,5 mg/l α-NAA * Vườn ươm - Đối với hai lồi lan Hài nghiên cứu giá thể tốt để trồng vườn ươm dương xỉ Sau tháng trồng tỷ lệ sống đạt cao 82 83%, chiều cao TB đạt 6,49 cm số TB 3,81 lá/cây loài P.dianthum Chiều cao TB đạt 5,54 số TB 3,75 lá/cây loài P.purpuratum - Dinh dưỡng tốt để sinh trưởng dinh dưỡng đầu trâu 502 Sau tháng trồng sinh trưởng tốt với chiều cao TB đạt 6,87 cm số 76 TB 4,22 lá/cây loài P.dianthum Chiều cao TB đạt TB đạt 5,88cm số TB 4,15lá/cây loài P.purpuratum - Việc bón phân luân phiên hiệu lan Hài Với công luân phiên : lần bón đầu trâu 502 + lần Growmore 20:20:20 + lần dung dịch hữu Fish Emulsion + lần vitamin tổng hợp cho sinh trưởng tốt Cụ thể với chiều cao TB 8,03 cm số TB 4,67 lá/cây (loài P.dianthum); chiều cao TB 7,08 cm số TB 4,44 lá/cây (loài P.purpuratum) Hạt lan tháng tuổi * Lưu giữ in vitro - Nền môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng lan Hài Với mục đích làm giảm sinh trưởng lan Hài để tăng thời gian bảo quản nên½sửVW+15g/lsaccarose+0,5gTHT+5g/lagar+100mlND dụng mơi trường RE - Bở sung vào mơi trường ni cấy gam/lít agar làm cho tốc độ sinh trưởng chiều cao giảm từ 36 đến 39% so với đối chứng mà khơng ảnh hưởng đến chất lượng ½ VW+15g/lsaccarose+0,5gTHT+5g/lagar+100mlND+5mg2,4D+1mg/lBA - Manitol có tác dụng làm hạn chế rõ rệt sinh trưởng Để đạt sinh trưởng thấp chất lượng không bị ảnh hưởng nên bổ sung vào môi trường nuôi cấy 40 gam/l Ở hàm lượng đường tốc độ tăng ½ VW+15g/lsaccarose+0,5gTHT+5g/lagar+100mlND+2mg/lTDZ trưởng chiều cao đạt 0,33 – 0,34 cm/cây/tháng - Nhiệt độ môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến trình lưu giữ lan Hài in vitro Ở điều kiện 150C sinh trưởng kéo dài thời gian giữ lần cấy chuyển mẫu lên đến 11,5 - 12 tháng/lần PLBs: ½ VW+15g/lsaccarose+0,5gTHT+5g/lagar+100mlND+5mg2,4D+1mg/lBA 3.2 Đề½nghị Chồi: VW+15g/lsaccarose+0,5gTHT+5g/lagar+100mlND+5mg2,4D+1mg/lBA - Cần có nghiên cứu tiếp tục số đối tượng lan Hài khác QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LỒI LAN HÀI P.DIANTHUM ½ MS+15g/lsaccarose+0,5gTHT+5g/lagar+100mlND+0,5mg/lNAA Giá thể: Rễ dương xỉ 77 Dinh dưỡng : lần bón đầu trâu 502 + lần Growmore 20:20:20 + lần dung dịch hữu Fish Emulsion + lần vitamin Gieo hạt 12 tuần ( Khử trùng (cồn 700, Precept ( 1%) 5-7’, nước cất 2-3 lần) Gieo hạt 12 tuần 12 tuần 12 tuần Tạo callus Tạo chồi, protocorm Nhân nhanh Ra rễ 10 tuần 78 QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LỒI LAN HÀI P.purpuratum Quả lan tháng tuổi 12 tuần ( Khử trùng (cồn 700, Precept ( 1%) 5-7’, nước cất 2-3 lần) ½ RE + 15 g/l saccarose + 0,5 g/l THT + 5,0 g/l agar+ 100 ml ND 12 tuần Nhân nhanh chồi ½ RE + 2mg/l BA+ 0,3 mg/l α-NAA+ 15 g/l saccarose + 0,5 g/l THT + 5,0 g/l agar+ 100 ml ND Hoặc ½ RE + 100 g CT +50g KT + 15 g/l saccarose + 0,5 g/l THT + 5,0 g/l agar+ 100 ml ND Ra rễ 12 tuần ½ RE+ 0,5 mg/l α-NAA +15 g/l saccarose + 0,5 g/l THT + 5,0 g/l agar+ 100 ml ND 10 tuần Vườn ươm Giá thể: Rễ dương xỉ Dinh dưỡng : lần bón đầu trâu 502 + lần Growmore 20:20:20 + lần dung dịch hữu Fish Emulsion + lần vitamin tổng hợp 79 QUY TRÌNH LƯU GIỮ IN VITRO LỒI LAN HÀI P.purpuratum P.dianthum Quả lan 8- tháng tuổi Khử trùng (cồn 700, Johnson 1% 5-7’) t 2-3 lần ½ RE (hoặc ½ VW) + 15 g/l saccarose + 0,5 g/l THT + 5,0 g/l agar+ 100 ml ND Chồi (2-2,5 cm; 2-3 lá) 12 tuần RE + 40 g/l manitol + 0,5 g/l THT + 6,0 g/l agar 11 – 12 tháng Cấy chuyển 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997) Giáo trình cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Hồng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2012) Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng giống Lan Hài quý P.hangianum perner guss (Hài Hằng) thu thập Việt Nam Tạp chí khoa học phát triển, số 2/2012: tr 194-201 Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013) Nhân giống in vitro loài lan địa Dendrobium nobile Lindl Tạp chí khoa học phát triển, 11(7): 917 925 Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (1994) “Duy trì bảo quản in vitro”, tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học, Trung tâm cơng nghệ sinh học, tr19-25 Hồ Hữu Nhị (1993), “Nghiên cứu bảo quản tập đồn trồng nhân giống vơ tính”, kết nghiên cứu khoa học nơng nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội Đặng Xuyến Như (2006) Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống nuôi trồng giống hai loài Lan Hài Việt Nam Dương Tấn Nhựt (2007) Một số kỹ thuật nhân giống vơ tính Lan Hài (Pahhiopedilum delenatii) Báo cáo khoa học Hội thảo ứng dụng kỹ thuật nhân giống nuôi trồng hoa Lan thành phố Hồ Chí Minh, tr: 13-19 Phùng Văn Phê, Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Trung Thành (2010) Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro lan Kim tuyến Anoechilus roxburghii (Wall).Lindl.Tạp chíkhoa học ĐHQG, Khoa học tự nhiên Công nghệ, tr.248 253 Nguyễn Văn Song (2011) Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chysotoxum) loại lan rừng có nguy tuyệt chủng Tạp chí khoa học Đại học Huế, : 127- 136 10 Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc Lan, Trần Thế Mai (2012) Nhân giống in vitro loài lan Dendrobium fimbriantum Hook (Hồng thảo long nhãn) Tạp chí khoa học phát triển, 10(2): 263 – 271 11 Nguyễn Thị Sơn, Trần Thễ Mai , Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Quang Thạch, (2013) Nghiên cứu ứng dụng hệ thống bioreacto plastima nhân giống loài lan Hồng thảo Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl) Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn, 2: 28 – 34 12 Nguyễn Quang Thạch , Hoàng Thị Nga, Đỗ Đức Thịnh, Hồng Minh Tú (2008), Xây dựng quy trình nhân nhanh giống Địa lan Hồng Hoàng (Cymbidiumiridioides) kỹ 81 thuật ni cấy mơ tế bào, Tạp chí Khoa học Phát triển 13 Nguyễn Thiện Tịch (1998a) “ Phát Cây Lan Hài hương lan hoa trắng hương thơm” (New discovery: The white fragrant Huong lan Paphiopedilum) Hoa Cảnh 1998, 4:12 (in Vietnamese) 14 Nguyễn Thiện Tịch (2001) The Orchid of Vietnam1 Tp Hồ Chí Minh Nhà Xuất Bản Nông nghiệp 424 pp (in Vietnamese) 15 Sách đỏ Việt nam phần II Thực vật 2007 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 16 Arditti J, Ernst R (1993) Micropropagation of orchids John Wiley and Sons, New York 17 Averyanov, L.V.(1996a) Paphiopedilum helenae (Orchidaceae) new slipper orchid from North Vietnam Bot Journ (St, -Petersburg) 81,9:105- 110 18 Averyanov, L.V.(1998a) Paphiopedilum hiepii: a new species from Vietnam Orchid Mag Amer Orch Soc 67, 3: 260 - 263 19 Averyanov, L.V.(1998b) Familiae Orchidaceae species novae at rarae in flora Vietnamica Syst Pl Vasc (St, -Petersburg) 84, 10: 126– 130 (in Russian) 20 Averyanov, L.V (1999) New species of orchids from Vietnam Lindleyana 14, 4: 214 224 21 Averyanov, L.V (2000b) Rare species of Orchidacea in the flora of Vietnam The genera Eriab Zeuxin Bot Journ (St, -Petersburg) 85, 3: 128 – 138 (in Russian) 22 Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp (2008) Lan Hài Việt Nam Nxb Giao thông Vận tải, TP Hồ Chí Minh 23 Banziger H(1996) The mesmerizing wart: the pollination strategy of epiphytic lady slipper orchid Paphiopedilumvillosum (Lindl.) Stein (Orchidaceae) Bot J Linn Soc 121:59–90 24 Bream, G.J (1987) A new taxon for the genus Paphiopedilum Pfitzer, Paphiopedilum cerveranum Braem Orch Cult Protec 38: 28 – 30 25 Cavestro, W.&Chiron, G (1999) Un nouveau Paphiopedilum du Vietnam, P.mirabile W.Castro & G.Chiron Orchidee Culture et protection 38,2:31-34 26 ChanCand Chang W.C(2000),Micropropagation ofCymbidium ensifolium var Misericors, through callus-derived rhizonmes, In vitro Cell, Dev Biol – Plant, 36, pp 517-530zine 27 Chen TY, Chen JT, Chang WC (2004a) Plant regeneration through direct shoot bud formation from leaf cultures of Paphiopediulum orchids.Plant Cell Tiss Organ Cult 76:11– 82 15 28 Chen ZL, Ye XL, Liang CY, Duan J (2004b) Seed germination in vitro of Paphiopedilum armeniacumand P.micranthum ActaHortic Sinica 31(4):540–542 29 Chung J D (1997) Factor influence rhizome formation from shoot tip culture of temperate Cymbidium species, Kor J of Plant Tiss, Cult., 20(5): 247-257 30 Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora Appendices I, II and III (2008) Geneva, Switzerland Available at: http://www.cites.org/eng/app/E-Jul01.pdf 31 Cribb, P., Averyanov, L & Nguyễn Tiến Hiệp (2000) Paphiopedilum henryanum in North Vietnam Orchid Review 108, 1232: 124-127 32 Ding CC, Wu H, Liu FY (2004) Factors affecting the germination of Paphiopedilum armeniacum Acta Bot Yunnanica 26(6):673–677 33 Dutra D, Johnson TR, Kauth PJ, Stewart SL, Kane ME, Richardson L(2008) Asymbiotic seed germination, in vitro seedling development, and greenhouse acclimatization of the threatened terrestrial orchid Bletia purpurea Plant Cell Tiss Organ Cult 94:11–21 34 Fuchs, F & Reisinger, H.(1995) Paphiopedilum herrmanniiFuchs et Reisinger Eine neue Frauenshuhart aus Nord – Vietnam Linzer Biol Beitr 27, 2: 1213 – 1215 35 Fu CM, Zhao ZG, Huang ZL, Li F, Tang FL (2007) Preservation in vitro of medicinal plant Salvia prionitis.Guihaia 27:653–7 36 Gruss, O & Perner, H (1998) Paphiopedilum tranlienianum, a new species of Paphiopedilum from Vietnam Caesiana 11: 63 – 73 37 Gruss, O & Perner, H (1999) Paphiopedilum vietnamense, a new species of Vietnam Die Orchideae Suppl 5:1-8 38 Gu DZ, Gao HD, Lu S, Feng Y (2011) Screening of media for in vitro culture and germplasm conservation in vitro of Ophioglossum thermale Kom J Zhejiang Univ (Science Edition) 38:205–10 39 Guillamin, A (1934) Paphiopedilum Kerch (Paphiopedilum Pfitz) In Lecomte, H.&Humbert,H.eds., Flore generale de Indo-chine Fasc.5: 636-646 40 He-Ping Huang, Jian Wang, Lu-Qi Huang, Shan-Lin Gao, Peng Huang, and DianLei Wang, (2010) Germplasm preservation in vitro of Polygonum multiflorum Thunb Acta Bot Boreal Occident Sin 30:1481–4 41 Hong PI, Chen JT, Chang WC (2008) Plant regeneration via protocorm like body 83 formation and shoot multiplication from seed derived callus of a maudiae type slipper orchid Acta Physiol Plant 30:755–759 42 Huang HP, Wang J, Gao SL, Hang P (2011) Study on preservation germplasm of Dioscorea zingiberensisC.H Wright in vitro J Chin Med Mater 34:680–3 43 Kozlowska-kalisz J., et al (1979), Influence of ionzing radiation on biological activity of endodenus growth regulations in orchids (cymbidium) in tissue culture, Acta Horticulture, 91,pp 261-286 44 Lee YI (1998) The study of embryo development and seed germination in vitro in slipper orchids MSc thesis National Taiwan University, Taiwan 45 Lee YI (2007) The asymbiotic seed germination of six Paphiopedilum species in relation to the time of seed collection and seed pretreatment Acta Hortic 755:381–385 46 Lee YI, Yeung EC, Lee N, Chung MC (2006) Embryo development in the Lady’s slipper orchid, Paphiopedilum delenatii, with emphasis on the ultrastructure of the suspensor Ann Bot 98:1311–1319 47 Lin YH, Chang C, Chang WC (2000) Plant regeneration from callus culture of a Paphiopedilum hybrid Plant Cell Tiss Organ Cult 62:21–25 48 Liu ZJ, Liu KW, Chen LJ (2006) Conservation ecology of endangered species P.armeniacum (Orchidaceae) Acta Ecol Sinica 26(9):2791–2800 49 LongBo, Alex X Niemiera, Zhi-ying Cheng, Chun-lin Long (2010) In vitro propagation of four threatened Paphiopedilum species (Orchidaceae), Plant Cell Tiss Organ Cult ,101:151–162 50 Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp Averyanov, L.V (1999a) Some threatened plant communities and species of the limestone mountains of Cao Bang provine needed to be protected in new proposed protected areas Vietnam Foresty Rev (Hanoi) 12: 35 – 36 (in Vietnamese) 51 Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp Averyanov, L.V(1999b) Are there new plant records from limestone moutains of Cao Bang? In Conservation and sustainable development of forest and biodiversity on limestone areas of Vietnam: 32 – 41 Hanoi Forest Inventory and Planning Inst 132pp (in Vietnam) 52 Luckel, E.(1987) Eine neue Frauenshuhart, Paphiopedilum dollii Die orchidee 38, 5: 266 – 268 53 Nagashima T (1982) Studies in the seed germination and embryogenesis 84 ingoeringiiRchb f and Paphiopedilum insigne var.sanderae Rchb J Jpn Soc Hortic Sci 51:94–105 54 Perner, H.& Gruss, O (1999) Paphiopedilum hangianum, a new species of the genus from Vietnam Die Orchidee Suppl 6: 3-7 55 Ren L, Wang FX (1987) Embryologica studies of Paphiopedilumg odefroyae stein Acta Bot Sinica 29(1):14–21 56 Senghas, K & Schettler, R 1999 Paphiopedilum hilmari, eine ungewohnliche Entdeckung aus Vietnam.J Orchideenfr 6, 1:4 57 Shi J, Luo YB, Bernhardt P, Ran JC, Liu ZJ, Zhou Q (2008) Pollination by deceit in Paphiopedilum barbigerum (Orchidaceae): a staminode exploits the innate colour preferences of hoverflies (Syrphidae) Plant Biol 11:17–28 58 Stewart J, Button J (1975) Tissue culture studies in Paphiopedilum Am Orchid Soc Bull 44:591–599 59 Tan ML, Yan MF, Wang L, Wang LJ, Yan XC(2011) Status of special oil crops germplasm conservation in the world J Plant Gen Resour;12:339–45 60 Tay LJ, Takeno K, Hori Y (1988) Culture conditions suitable for in vitro seed germination and development of seedling in Paphiopedilum J Jpn Soc Hortic Sci 57:243–249 61 Xu Y, Chen JH, Luan MB, Wang XF, Sun ZM (2011).Research progress on conservation techniques for Ramie germplasm resources J Plant Gen Resour12:184–9 62 Zeng SJ, Chen ZL, Duan J (2006) Asepsis sowing and in vitro propagation of Paphiopedilum hirsutissimum Pfitz Plant Physiol Commun 42(2):247 85 PHỤ LỤC CÁC NỀN MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG MURASHIGE AND SKOOG – 1962 (MS) Thành phần Đa lượng Luợng pha 1l dung dịch mẹ 1l môi truờng sử dụng (g) NH4NO3 33, 00 KNO3 38,00 MgSO4.7H2O 10,00 KH2PO4 Vi luợng 3,40 (mg) H3BO3 620,00 MnSO4.4H2O 2230,00 ZnSO4.4H2O 860,00 KI 83,00 MoNa2.2H2O 25,00 CoCl2.6H2O 2,50 CuSO4.5H2O Sắt 2,50 10 ml/l (g) FeSO4.7H2O 5,56 Na2EDTA Vitamin 7,46 ml/l (mg) Glycine 400 Axit Nicotinic (B5) 100 Pyridoxin (B6) 100 Thyamin HCl (B1) CaCl2.H2O ml/l 20 (g) 6,60 Inositol 50 ml/l (mg ) 100 86 50ml/l ml/l THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VACIN AND WENT- 1949 (VW) Thành phần Đa lượng Lượng pha 1l dung dịch mẹ 1l môi truờng sử dụng (g) KNO3 10,50 KH2PO4 5,00 MgSO4 2,44 (NH4)2SO4 Ca3(PO4)2(Pha riêng) Vi lượng MnSO4.H2O Sắt 50 ml/l 10,00 4,00 (mg) 568,00 (g) FeSO4.7H2O 4,63 10 ml/l ml/l THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG ROBERT ERNST – 1979 (RE) Thành phần Đa lượng Luợng pha 1l dung dịch mẹ 1l môi truờng sử dụng (g) NH4NO3 8,00 (NH4)2SO4 3,00 KNO3 8,00 Mg(NO3)2.6H2O 2,00 KH2PO4 6,00 Ca(NO3).4H2O (Pha 3,00 riêng) Sắt 50 ml/l (g) FeSO4.7H2O 5,00 Na2EDTA 7,40 87 ml/l PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 88 PHỤ LỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 89 PHỤ LỤC KẾT QUẢ ĐÀO TẠO 90 ... NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI Ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn phát triển loài Lan Hài đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc có nguy tuyệt chủng. .. triển loài lan Hài (Paphiopedilum) đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc có nguy tuyệt chủng nhằm đưa quy trình kỹ thuật nhân giống lưu giữ số loài lan Hài đặc hữu thu thập khu vực miền núi phía bắc. .. Việt Nam, góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen quý 1.2 Mục tiêu đề tài - Mục tiêu chung: Bảo tồn phát triển lồi lan Hài đặc hữu khu vực miền núi phía Bắc có nguy tuyệt chủng cơng nghệ ni cấy mô