Tối ưu hóa quá trỡnh tỏch chiết catechins trong là chố tỉa và ứng dụng trong nuụi cấy mụ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI “Tối ưu hóa q trình tách chiết catechins chè tỉa ứng dụng nuôi cấy mô” Giáo viên hướng dẫn : TS Lại Thị Ngọc Hà Sinh viên thực Msv Lớp TS Đinh Trường Sơn : Đặng Thị Tươi : 580964 : K58_CNSHA HÀ NỘI, 26/12 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn thơng tin trích dẫn khóa luận rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Đặng Thị Tươi i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận, ngồi nỗ lực thân nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình tập thể, cá nhân trường Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới T.S Lại Thị Ngọc Hà, giảng viên môn Hóa sinh - Cơng nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam dành nhiều thời gian tâm huyết, tận tình hướng dẫn bảo tơi suốt q trình nghiên cứu Tiếp đến muốn gửi lời cảm ơn trân trọng tới T.S Đinh Trường Sơn, môn Công nghệ sinh học thực vật, khoa Công nghệ sinh học người tận tình kiên nhẫn giảng giải, hướng dẫn tận tình theo sát tơi bước thực nuôi cấy mô số vấn đề chưa rõ thầy giải đáp giúp cho hiểu rõ vấn đề Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học Học viện Nông nghiệp Việt Nam xin cảm ơn chị Trần Thị Hồi làm việc Phòng thí nghiệm mơn Hóa sinh – Cơng nghệ sinh học thực phẩm Phòng thí nghiệm trung tâm, Khoa cơng nghệ thực phẩm, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp dạy việc chạy thiết bị HPLC Tôi xin chân thành cảm ơn bạn Hà Thị Thùy CNTPB-K58 bạn nhóm thực tập khóa luận tập thể lớp CNSHA – K58 nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình làm khóa luận tốt nghiệp Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln bên tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khố luận Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2016 Sinh Viên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU C (+) – Catechin EC (-) - epicatechin ECG (-) - epicatechin gallate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EGC (-) - epigallocatechin EGCG (-) - Epigallocatechin gallate EU Liên minh Châu Âu Euro Đồng tiền chung Châu Âu HPLC High performance liquid phase CK Chất khơ CT Cơng thức Đvt Đơn vị tính SD Standard Deviation TB Trung bình iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Diễn biến diện tích, sản lượng chè giới giai đoạn 1999-2008 (FAO, 2011) Error: Reference source not found Bảng 2.2 Kim ngạch xuất chè Việt Nam sang EU số thị trường lớn 2012 – 2014 [16] .Error: Reference source not found Bảng 2.3 Thành phần hóa học chè [22] Error: Reference source not found Bảng 2.4 Hàm lượng dạng catechins chè [22] .Error: Reference source not found Bảng 2.5 Thành phần pha chế môi trường MS Error: Reference source not found Bảng 3.1 Ma trận thực nghiệm Error: Reference source not found Bảng 3.2 Thời gian cung cấp dung mơi phân tích mẫu HPLC Error: Reference source not found Bảng 3.3 Các đường cong chuẩn catechins caffeine Error: Reference source not found Bảng 4.1 Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ đến trình tách chiết catechins Error: Reference source not found Bảng 4.2 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến trình tách chiết catechins 26 Bảng 4.3 Ảnh hưởng yếu tố nồng độ đến trình tách chiết catechins Error: Reference source not found Bảng 4.4 Các mức thí nghiệm .Error: Reference source not found Bảng 4.5 Ma trận thực nghiệm .Error: Reference source not found Bảng 4.6 Kết ma trận thực nghiệm với biến thực Error: Reference source not found Bảng 4.7.Tổng hợp phân tích mơ hình Error: Reference source not found iv Bảng 4.8 Kết thí nghiệm kiểm tra mơ hình .Error: Reference source not found Bảng 4.9 Kết nuôi cấy mô bạch đàn bổ sung catechins Error: Reference source not found Bảng 4.10 Kết nuôi cấy mô lan hồ điệp bổ sung catechins Error: Reference source not found v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu tạo catechin Error: Reference source not found Hình 2.2 Cơng thức cấu tạo số catechins [22] Error: Reference source not found Hình 2.3 Cơ chế chống oxi hóa nhóm có chức chống oxi hóa polyphenol [22] .Error: Reference source not found Hình 3.1 Giống chè Phúc Vân Tiên .Error: Reference source not found Hình 3.2 Nồi hấp thiết bị sấy khô nhiệt Error: Reference source not found Hình 3.3 Sơ đồ chiết catechins từ bột chè .Error: Reference source not found Hình 3.4 Sắc ký đồ hỗn hợp chất chuẩn cactehins caffeine nhiệt độ Error: Reference source not found 50 µg/ ml Error: Reference source not found Hình 4.1 Kết dự báo hàm mục tiêu EGCG catechin tổng số Error: Reference source not found Hình 4.2 Bột catchines thu sau trích ly Error: Reference source not found vi PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Cây chè có tên khoa học Camellia sinensis Lindl O.Kuntze, tiếng Latinh sinensis có nghĩa “Trung Quốc” Chè thuộc ngành hạt kín (Angiospermae), lớp hai mầm (Dicotyledonae), chè (Theales), họ chè (Theaceae), chi chè ( Camellia), loài Camellia sinensis Trong năm gần đây, nhờ áp dụng phương pháp nghiên cứu khoa học đại tìm thấy tác dụng sinh học nước chiết chè chủ yếu polyphenol, quan trọng chủ yếu dẫn xuất catechins Tác dụng sinh học hợp chất polyphenol từ chè xanh giải thích chúng có tác dụng khử gốc tự do, giống tác dụng chất chống oxi hóa Các gốc tự sinh tích lũy q trình sống, nguyên nhân dẫn đến bệnh tật làm tăng tốc độ q trình lão hóa thể người Ngày nay, nghiên cứu khoa học tìm thấy tác dụng catechins từ chè mức độ khác bệnh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường ruột, bệnh miệng có tác dụng làm chậm q trình lão hóa, giảm béo, tăng tuổi thọ Catechins từ chè sử dụng có hiệu an tồn cơng nghiệp thực để thay chất chống oxi hóa tổng hợp dễ gây tác dụng phụ có hại Ngồi ra, catechins sử dụng cơng nghiệp nhẹ cơng nghiệp hóa mỹ phẩm… Nhờ tác dụng quý catechins từ chè có giá trị cao thị trường Chè xanh trở thành nguyên liệu quan trọng đẻ chế biến nhiều loại thức ăn, đồ uống khác nhiều quốc gia giới Các loại bánh kem chè xanh, bánh gato, kem chè xanh, thạch chè xanh,… Đặc biệt polyphenol chiết xuất từ chè xanh ngày sử dụng rộng rãi, thường xuyên nhằm mục đích chữa bệnh bổ sung thực phẩm chức Hiện để sản xuất chè khô sử dụng chè búp chè non, lại lượng lớn chè già bị bỏ phí, làm cho hiệu canh tác chè thấp Thêm vào đó, hàng năm, lượng chè tỉa bị bỏ chè bị đốn bỏ để hạ thấp chiều cao vào cuối năm Ngoài ra, nhà máy chè trình sản xuất tạo lượng lớn chè phế phẩm chè xanh vụn có giá trị sử dụng thấp Như vậy, chè già ruộng chè không đạt tiêu chuẩn nhà máy nguồn nguyên liệu lớn khai thác catechins có giá trị sinh học cao sử dụng làm thuốc, phụ gia thực phẩm bổ sung thực phẩm chức năng… Cho đến nay, việc khai thác catechins từ chè xanh nghiên cứu theo phương pháp khác Tuy nhiên đến phương pháp trích ly catechins có hỗ trợ kỹ thuật đại Việt Nam tỏ chưa phù hợp vốn đầu tư lớn dừng phạm vi nghiên cứu Bên cạnh việc khai thác catechins từ chè xanh theo phương pháp trích ly thông thường tỏ chưa đem lại hiệu kinh tế cao giá thành chế phẩm catechins cao, độ tinh khiết chế phẩm chưa tốt Việc tìm phương pháp trích ly hay sâu vào nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly từ phương pháp cụ thể góp phần cao khả hiệu trích ly hợp chất catechins chè Do thời gian điều kiện thí nghiệm, phạm vi đề tài, tiến ảnh khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, thời gian, nhiệt độ ethanol đến trình tách chiết catechins từ chè tối ưu hóa q trình Tiếp đến, đề tài thực khảo sát ảnh hưởng việc bổ sung catechins tách chiết từ chè vào môi trường nuôi cấy lan hồ điệp bạch đàn 1.2 Mục tiêu, yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục tiêu - Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, thời gian, nồng độ ethanol đến kết trích ly catechins chè Mơ hình hóa tối ưu hóa q trình tách chiết với ba yếu tố tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian - Khảo sát ảnh hưởng bột chiết catechins từ trà đến môi trường nuôi cấy mô lan hồ điệp bạch đàn 1.2.2 Yêu cầu Đánh giá ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ, thời gian, nồng độ ethanol đến trình chiết catechins chè tỉa Đưa mơ hình hóa q trình chiết catechins chè tỉa điều kiện tối ưu cho trình tách chiết Sử dụng bột chiết catechins từ chè để đánh giá tách động catechins lên môi trường nuôi cấy lan hồ điệp bạch đàn PHẦN THỨ – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chè 2.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố chè Tên khoa học: Camellia sinensis (L) O.Kuntze Chè xếp phân loại thực vật sau: Ngành hạt kín (Angiospermatophyta), lớp Ngọa Lan (Magnoliopsida), chè Theales, họ chè Theaceae chi chè Camellia [2] Cây chè sinh trưởng điều kiện tự nhiên có thân chính, chia làm loại: thân gỗ, thân bụi, thân nhỡ (bán gỗ) Cành chè mầm sinh dưỡng phát triển thành, cành chia nhiều đốt, chiều dài biến đổi từ – 10 cm Đốt chè dài biểu giống chè có suất cao Lá chè mọc cách cành, đốt có lá, hình dạng kích thước thay đổi tùy giống Lá chè mọc cách cành, đốt có lá, hình dạng kích thước thay đổi tùy giống Lá chè có gân rõ, rìa có cưa Búp chè giai đoạn cành chè, gồm có tơm (phần non đỉnh chưa xòe) non Kích thước búp chè thay đổi tùy giống kỹ thuật canh tác Cây chè sau sinh trưởng 2-3 tuổi bắt đầu hoa, mọc từ chồi sinh thực nách [6] Về phân loại thực vật nay, có 23 chi 380 loài, nhiên để dễ phân loại người ta chia làm giống chè [3]: Giống chè Ấn Độ (Camellia sinensis Var assamica): Đặc điểm: thuộc loại độc thân, to dài tới 20-30 cm, mỏng, mềm, thường có màu xanh đậm, dáng hình bầu dục, phiến gợn sóng, đầu dài Có trung bình 1215 đơi gân lá, hoa quả, không chịu rét, hạn, suất, phẩm chất tốt Có hàm lượng tanin lớn phù hợp cho sản xuất chè đen [3] Giống chè Trung Quốc (Camellia sinensis Var sinensis): Đặc điểm: nhỏ cứng, dày nhiều gợn sóng, màu xanh đậm, dài từ 3,5 – 6,5 cm Có -7 đơi gân khơng rõ, cưa nhỏ, không Búp nhỏ, hoa nhiều, suất thấp, phẩm chất bình thường Có thể chịu rét nhiệt độ -12°C đến -15°C Tanin khơng cao nên thích hợp cho sản xuất chè xanh [4] Chè cho suất không cao vào mùa mưa từ tháng – tháng 11, sau 10 -15 ngày thu hoạch lần Nguyên liệu sử dụng công nghiệp chế biến chủ yếu tôm -3 non [2] Về phân bố chè, vùng chè nguyên sản vùng chè dại nằm khu vực núi cao, có điều kiện sinh lý thái lý tưởng Vân Nam ( Trung Quốc), Assam (Ấn Độ), có độ cao 1500m so với mặt nước biển Tại Việt Nam chè The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values Nongdo 20 40 50 60 80 96 Number of observations 18 The SAS System 00:54 Saturday, December 25, 2016 41 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TongCatechin Source DF Model Error Sum of Squares 12 Corrected Total Mean Square 1790.026894 358.005379 266.379933 22.198328 17 Coeff Var Root MSE 0.870463 4.144396 4.711510 DF Nongdo Pr > F 16.13 F 358.005379 16.13