Nghiên cứu điều kiện lên men và phương pháp tách chiết chất kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn bacillus amyloliquefaciensb

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI BÁO CÁO TỔNG KẾT KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiêṇ lên men và phương pháp tách chiế t chấ t kháng sinh diệt nấm gây bệnh thực vật từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens Mã số đề tài: QG.13.12 Chủ nhiệm đề tài: TS Trịnh Thành Trung Hà Nội, 2016 Hà Nội, … PHẦN I THÔNG TIN CHUNG 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu điề u kiêṇ lên men và phương pháp tách chiế t chấ t kháng sinh diêṭ nấ m gây bênh ̣ thực vâ ̣t từ vi khuẩ n Bacillus amyloliquefaciens 1.2 Mã số: QG.13.12 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài TT Chức danh, học vị, họ tên Đơn vị cơng tác Vai trị thực hiện đề tài Viện Vi sinh vật Chủ nhiệm đề tài Công nghệ Sinh học Viện Vi sinh vật Ths Trịnh Thị Vân Anh Thư ký Công nghệ Sinh học Viện Vi sinh vật KS Hà Thị Hằng Thành viên Công nghệ Sinh học Viện Vi sinh vật CN Nguyễn Thị Anh Đào Thành viên Công nghệ Sinh học Viện Vi sinh vật KS Nguyễn Mạnh Hùng Thành viên Công nghệ Sinh học 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Vi sinh vật Cơng nghệ Sinh học 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: 24 tháng từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 05 năm 2015 1.5.2 Gia hạn (nếu có): 12 tháng đến tháng 05 năm 2016 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 06 năm 2013 đến tháng 09 năm 2016 TS Trịnh Thành Trung 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): (Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết nghiên cứu tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ý kiến Cơ quan quản lý) 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 160 triệu đồng PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Viết theo cấu trúc báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo đăng tạp chí khoa học ĐHQGHN sau đề tài nghiệm thu), nội dung gồm phần: Đặt vấn đề Sử dụng phân bón vơ loại thuốc hóa học phịng trừ sâu bệnh sản xuất nông nghiệp gây tác động tiêu cực đến độ mầu mỡ đất, hủy hoại môi trường sống làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người Phát triển ngành nông nghiệp theo hướng xanh bền vững vấn đề tất yếu quốc gia phân bón hữu sinh học giải pháp ưu nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ứng dụng rộng rãi toàn giới (Bhardwaj et al., 2014) Phân bón hữu sinh học khơng cung cấp loại chất dinh dưỡng nhằm trì ổn định độ phì nhiêu cho đất mà cịn cung cấp loại vi sinh vật có lợi cho phát triển trồng Các vi sinh vật thường bổ sung vào phân bón hữu sinh học bao gồm Rhizobium (vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh), Azospirillum (vi khuẩn cố định nitơ sống tự do), Bacillus (vi khuẩn phân giải phosphate khó tan sản sinh chất phòng trừ bệnh cây), Pseudomonas Trichoderma (vi khuẩn nấm sợi sản sinh chất phòng trừ bệnh cây) (Fravel, 2005) Chi Bacillus nhóm lồi vi khuẩn hiếu khí, Gram dương, hình que, phân bố rộng rãi hệ sinh thái Bacillus có khả sinh nội bào tử, dạng nghỉ tế bào để giúp vi khuẩn chống chịu tồn trước điều kiện bất lợi môi trường khô hạn thiếu dinh dưỡng Theo hệ thống phân loại nay, chi Bacillus có khoảng gần 300 loài loài phụ loài (Parte, 2014) Trong số đó, Bacillus velezensis (hay cịn gọi B amyloliquefaciens subsp plantarum, B methylotrophicus B oryzicola) tám lồi vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis (Rooney et al., 2011; Dunlap et al., 2015) Đây loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính q có lợi cho trồng khả sinh chất kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh enzyme thủy phân có khả tăng cường tính miễn dịch chống lại xâm nhiễm loại vi sinh vật gây bệnh (Chowdhury et al., 2015; Shao et al., 2015; Li et al., 2015) Do sở hữu đặc tính quý, nhiều chủng vi khuẩn B velezensis phân lập, đánh giá đặc tính có lợi ứng dụng đấu tranh sinh học bổ sung vào loại phân bón hữu sinh học Một số chủng B velezensis FZB42 sản xuất thương mại sử dụng làm chế phẩm phân sinh học chế phẩm phòng trừ bệnh (Chowdhury et al., 2015) Nhiều báo cáo công bố hiệu sử dụng chủng B velezensis phòng trừ làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh mức độ nhiễm bệnh vi khuẩn nấm gây bệnh gây (Chen et al., 2014; Huang et al., 2014; Wu et al., 2015; Kang et al., 2015) Sản lượng thu hoạch tăng lên 30% bổ sung chủng B velezensis FZB42 vào phân bón (Yao et al., 2006) Nhằm tìm kiếm chủng vi khuẩn có tiềm ứng dụng sản xuất chế phẩm làm phân hữu sinh học, nghiên cứu này, trọng tâm nghiên cứu đặc tính có lợi cho trồng từ chủng vi khuẩn B velezensis có sưu tầm vi khuẩn Bacillus thu thập vùng Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin Cơn Đảo Ngồi ra, chủng vi khuẩn B velezensis SP1901 phân lập từ mẫu đất rừng quốc gia Hoàng Liên sử dụng Bacillus velezensis số tám lồi vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus sublilis (Rooney et al., 2009) Đây loài vi khuẩn an toàn, sở hữu nhiều đặc tính q có lợi cho trồng khả sinh chất kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh cây, sản sinh hormone kích thích sinh trưởng thực vật, sản sinh enzyme thủy phân có khả tăng cường tính miễn dịch chống lại xâm nhiễm loại vi sinh vật gây bệnh (Chowdhury et al., 2015; Shao et al., 2015; Li et al., 2015) Do sở hữu đặc tính quý, vi khuẩn B velezensis nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu cấp độ từ giải mã hệ genome đến nghiên cứu chất trao đổi, nghiên cứu phân loại, nghiên cứu ứng dụng nhà kính ngồi thực địa; nhiều chủng vi khuẩn B velezensis phân lập, đánh giá đặc tính có lợi ứng dụng đấu tranh sinh học để phòng ngừa loại dịch bệnh hại trồng B velezensis sản sinh nhiều loại chất trao đổi bậc hai có hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh Các chất trao đổi bao gồm lipopeptide, polyketide, dipeptide, siderophore protein kháng khuẩn (Arguelles-Arias et al., 2009; Huang et al., 2014) Lipopeptide cấu tạo từ chuỗi peptide liên kết với acid béo, tổng hợp không cần ribosome (nonribosomally synthesized peptide) nhờ có mặt nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) Giải mã hệ gene chủng B velezensis cho thấy 9% hệ genome vi khuẩn mang gene tham gia sinh tổng hợp lipopeptide (Chowdhury et al., 2015) Dựa vào cấu trúc phân tử đặc tính sinh học, lipopeptide sản sinh từ Bacillus Paenibacillus chia thành nhóm lipopeptide mạch vịng mang điện tích dương, lipopeptide mạch vịng khơng mang điện tích dương lipopeptide mạch thẳng mang điện tích dương (Cochrance, Vederas, 2014) Surfactin, iturin fengycin lipopeptide mạch vịng khơng mang điện tích dương thường tìm thấy dịch ni cấy lồi B subtilis (Stein, 2005; Ongena, Jacques, 2008) Bên cạnh đó, nhiều chủng B velezensis cịn có khả sản sinh đồng thời polyketide difficidin, bacillaene macrolactin (Arguelles-Arias et al., 2009; Yuan et al., 2012) Trong trình tìm kiếm chủng vi khuẩn có khả ứng dụng đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh hại cây, phân lập chủng B velezensis CP 1604 đất nông nghiệp gần vườn Quốc gia Cúc Phương có khả đối kháng mạnh với nấm gây bệnh Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum vi khuẩn gây bệnh bạc Xanthomonas oryzae (Trung et al., 2016) Trong nghiên cứu này, tiến hành tách chiết, tinh xác định chất chất kháng nấm chất kháng khuẩn sinh từ chủng CP 1604 Mục tiêu - Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sinh chất kháng nấm mạnh - Nghiên cứu điều kiện lên qui mơ lít - Tách chiết thu hồi chất kháng nấm - Tinh xác định chất sinh lý hóa chất kháng nấm - Đánh giá độ an toàn chất kháng nấm Phương pháp nghiên cứu Chủng vi khuẩn nghiên cứu Từ vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử phân lập vườn Quốc gia Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin Côn Đảo, chúng tơi tiến hành so sánh tính tương đồng cao đoạn gen 16S rRNA so với chủng chuẩn loài sở liệu Eztaxon-e (http://eztaxone.ezbiocloud.net/) Dựa số liệu so sánh, lựa chọn chủng có trình tự gen 16S rRNA tương đồng cao với loài B velezensis, B amyloliquefaciens subsp plantarum, B methylotrophicus B oryzicola Từ ống lưu giữ lạnh sâu -70oC, chủng vi khuẩn lựa chọn ria hoạt hóa mơi trường thạch NA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) 30oC Sau 24 giờ, tế bào hoạt hóa thu dùng cho thí nghiệm mô tả Xác định khả sinh chất kháng nấm chất kháng khuẩn Từ tế bào hoạt hóa, chủng vi khuẩn cấy trải mặt thạch TSBA (Becton, Dickinson and Company, Pháp) ủ 30oC Hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn kiểm tra phương pháp khuếch tán thạch Theo đó, khoanh thạch đục ống nhựa vô trùng (Ø = mm) đặt lên môi trường PDA (g/L: khoai tây 200 g, dextrose 20 g thạch 15 g) cấy sẵn loài nấm kiểm định gây bệnh thực vật Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani Phytophthora capsici đặt lên môi trường NA cấy vi khuẩn kiểm định gây bệnh bạc lúa Xanthomonas oryzae Ngoài ra, phổ hoạt tính kháng nấm kiểm tra chủng nấm kiểm định Aspergillus oryzae, A niger Saccharomyces cerevisiae Bộ giống chủng vi sinh vật kiểm định lưu giữ Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Xác định khả sinh enzyme ngoại bào Từ tế bào hoạt hóa, chủng vi khuẩn cấy vào bình tam giác 250 ml chứa 100 ml mơi trường TSB (Becton, Dickinson and Company, Pháp) dịch thể Sau 48 nuôi cấy lắc 160 v/p 30oC, dịch nuôi ly tâm 8.000 v/p 10 phút nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn Khả sinh enzyme ngoại bào xác định phương pháp khuếch tán thạch Theo đó, dịch ni cấy vi khuẩn nhỏ vào giếng (Ø = mm) đục lỗ đĩa thạch chứa 0,1% loại chất tinh bột tan, CMC, xylan, chitin, casein tributyrin Sau 24 ủ đĩa thạch chứa chất 37oC, hoạt tính amylase CMCase xác định dựa vòng phân giải chất tinh bột tan CMC xung quanh khoanh thạch nhuộm với dung dịch lugol; hoạt tính xylanase chitinase quan sát nhuộm chất xylan chitin với dung dịch đỏ cơng gơ; hoạt tính protease lipase quan sát trực tiếp chất casein tributyrin Xác định khả phân giải phosphate khó tan Chủng vi khuẩn hoạt hóa cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường dịch thể PVK (g/L: glucose 10, Ca3(PO4)2 5, KCl 0,2, (NH4)2SO4 0,5, NaCl 0,2, MgSO4 7H2O 0,1, MnSO4 H2O 0,002 FeSO4 7H2O 0,002) Sau 48 nuôi lắc 160 v/p 30oC, dịch nuôi vi khuẩn ly tâm 8.000 v/p 10 phút để loại bỏ tế bào Hàm lượng phosphate vơ giải phóng từ Ca3(PO4)2 vào môi trường nuôi cấy xác định phương pháp xanh molybden dựa đường chuẩn phosphate xây dựng từ KH2PO4 (Holman et al., 1943) Xác định khả sinh chất kích thích sinh trưởng IAA Chủng vi khuẩn hoạt hóa cấy vào bình tam giác 100 ml chứa 25 ml mơi trường dịch thể NA có bổ sung L-tryptophan (Merck, Đức) tới nồng độ cuối mM Sau 48 nuôi lắc 160 v/p 30oC, dịch nuôi vi khuẩn ly tâm 8,000 v/p 10 phút để loại bỏ tế bào Khả sinh chất kích thích sinh trưởng indole-3-acetic acid (IAA) xác định dựa phản ứng tạo mầu với thuốc thử Salkowski (Glickmann Dessaux, 1995) Hàm lượng IAA sinh xác định dựa đường chuẩn xây dựng từ IAA (Merck, Đức) Dấu vân tay rep-PCR phân tích tính tương đồng kiểu gen Từ khuẩn lạc khiết, ADN tổng số tách chiết theo phương pháp Gabor et al (2003) Mức độ tinh ADN kiểm tra dựa số bước sóng A260/A280 (xấp xỉ 1,8) Sau đó, 50 ng ADN chủng vi khuẩn đưa vào ống PCR tích phản ứng cuối 25 µl chứa sẵn DreamTaqTM PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Mỹ) Phản ứng PCR thực với mồi ERIC GTG5 theo chu trình nhiệt Freitas et al (2008) mô tả Sản phẩm PCR điện di 65 V gel agarose 2% có bổ sung chất nhuộm ADN RedSafe (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Hình ảnh điện di chụp hệ thống soi gel (BioRad, Mỹ) Mơ hình băng ADN (hay kiểu gen) tạo từ chủng vi khuẩn phân tích mã hóa sang hệ ma trận nhị phân 1/0 Tính tương đồng kiểu gen tính toán theo hệ số Dice Mối quan hệ kiểu gen chủng thể theo sơ đồ sử dụng thuật toán UPGMA Tất bước phân tích tính tương đồng kiểu gen thực phần mềm NTSYSpc 2.1 Phân tích trình tự đa gen xây dựng phát sinh chủng loại Phản ứng PCR khuếch đại giải trình tự đoạn gen gyrase subunit A (gyrA), RNA polymerase subunit B (rpoB), phosphoribosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase (purH), DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat-shock protein groEL (groEL) 16S rRNA thực với cặp mồi theo mô tả Rooney et al (2009) Trình tự gen gửi lên ngân hàng gen với số hiệu KU904810, KU904811, KU904812 KU904813, KU904814 KU904810 Trình tự đa gen chủng vi khuẩn nghiên cứu có chiều dài 5.547 bp kết nối theo thứ tự đoạn 928 bp gen gyrA, đoạn 964 bp gen rpoB, đoạn 875 bp gen purH, đoạn 777 bp gen polC, đoạn 835 bp gen groEL đoạn 1,168 bp gen 16S rRNA Trình tự đa gen loài quan hệ gần gũi nghiên cứu Kobo et al (2011) tải từ ngân hàng gen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Tamura - Nei với độ lặp lại 1,000 lần phần mềm MEGA phiên 5.05 Tách chiết chất kháng nấm kháng khuẩn Từ dịch nuôi cấy loại bỏ tế bào, chất kháng nấm chất kháng khuẩn tách chiết phương pháp (i) sử dụng dung môi hữu cơ, (ii) hấp phụ với hạt amberlite-XAD7, (iii) đông khô dịch nuôi cấy kèm tách chiết ethanol (iv) tủa pH thấp Các phương pháp tách chiết lặp lại đến lần theo quy trình sau: i Phương pháp tách chiết dung môi hữu cơ: dịch nuôi cấy loại bỏ tế bào đưa vào dung mơi có độ phân cực khác benzen, 1-butanol, chloroform, ethyl acetate, hexan, 2-pentanol tuluene theo tỷ lệ : Sau đảo trộn mẫu 10 phút, hỗn hợp dung dịch ly tâm tốc độ 8.000 vòng/phút 20 phút nhằm tách rõ lớp dịch nuôi cấy dung môi Phần dung mơi phía thu lại quay nhiệt độ 60oC Sau đó, cặn kháng sinh thơ hoàn nguyên với nước cất thử hoạt tính kháng nấm vi khuẩn kiểm định ii Phương pháp hấp phụ với hạt amberlite-XAD7: hạt amberlite-XAD7 đưa vào dịch nuôi cấy theo tỷ lệ : (khối lượng/thể tích) Hỗn hợp khuấy nhẹ qua đêm máy khuấy từ nhiệt độ 4oC Sau đó, hạt amberlite thu lại rửa liên tiếp lần với nước cất, lần với ethanol 30% Hạt amberlite khuấy nhẹ với ethanol 75% (He et al., 2007) Chất kháng sinh thô ethanol thu lại cô quay nhiệt độ 60oC Sau đó, cặn kháng sinh thơ hoàn nguyên với nước cất thử hoạt tính kháng nấm vi khuẩn kiểm định iii Phương pháp đơng khơ: tiến hành đơng khơ hồn tồn dịch ni cấy Sau đó, đưa lượng thể tích ethanol 100% tương đương với lượng mẫu ban đầu vào cặn đơng khơ lắc 160 vịng/phút nhằm chiết rút chất kháng sinh thô Phần ethanol thu lại cô quay nhiệt độ 60oC Sau đó, cặn kháng sinh thơ hồn ngun với nước cất thử hoạt tính kháng nấm vi khuẩn kiểm định iv Phương pháp tủa pH thấp: dịch nuôi cấy chỉnh pH 3,0 sử dụng HCl 6N ủ qua đêm 4oC Sau đó, dịch ni cấy ly tâm 8.000 vịng/phút 10 phút Phần cặn tủa thu lại hồn ngun với nước cất Hoạt tính kháng sinh thơ cặn tủa thử với nấm vi khuẩn kiểm định Tinh chất kháng nấm kháng khuẩn Chất kháng nấm chất kháng khuẩn tinh kỹ thuật HPLC sử dụng cột Zorbax Eclipse XDB - C18 (4,6 ì 250 mm, àl, Agilent Technologies, USA) Phương pháp tinh HPLC thực theo mơ tả He et al 2007 Theo đó, pha động sử dụng methanol nước chứa 0,05% trifluoroacetic acid Sau cân cột với tỷ lệ 20% methanol, 30 µl dịch kháng sinh tách chiết theo bước dung môi - butanol hạt amberlite-XAD7 tải lên cột Dung môi hệ động thay đổi tuyến tính theo nồng độ methanol từ 20% lên 40% 10 phút, từ 40% lên 60% phút từ 60% lên 70% 10 phút Tốc độ dịng q trình sắc ký 0,5 ml/phút Sắc ký đồ ghi nhận bước sóng 220 nm Sau bị khỏi cột, phân đoạn sắc ký (0,5 ml/phân đoạn) thu nhận, cô quay loại bỏ dung mơi thử hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn Sau đó, phân đoạn có hoạt tính trộn lại với tinh lại lần theo chu trình sắc ký mơ tả Phân đoạn có hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn gửi sang Trung tâm Phương pháp Phổ Ứng dụng - Viện Hóa Học - Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ để xác định phổ khối Xác định đặc tính sinh hóa lý chất kháng nấm kháng khuẩn Khả bền nhiệt độ, bền pH bền với enzyme thủy phân chất kháng nấm chất kháng khuẩn thử nghiệm sau: i ii iii Khả bền nhiệt: dịch tách chiết chất kháng sinh xử lý nhiệt độ 60oC, 80oC 100oC Sau thời gian xử lý 30 phút, 60 phút, 90 phút 120 phút, hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn xác định phương pháp khuếch tán thạch mô tả Khả bền pH: dịch tách chiết chất kháng sinh xử lý pH từ 3,0 đến 7,0 đệm citrate-phosphate pH 8,0 đến 9,0 đệm Tris-HCl Sau 24 ủ 4oC, hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn xác định phương pháp khuếch tán thạch mô tả Khả bền với enzyme thủy phân: enzyme trypsin, α-chymotrypsin, amylase, lipase proteinase K pha đệm phosphate 25 mM (pH 7,0) tới nồng độ cuối mg/ml Sau đó, dịch tách chiết chất kháng sinh trộn với dung dịch enzyme theo tỷ lệ : ủ 37oC Sau xử lý, hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn xác định phương pháp khuếch tán thạch mơ tả Thử nghiệm tính an tồn chất kháng nấm kháng khuẩn Tính an toàn chất kháng nấm kháng khuẩn sản sinh từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 bước đầu thử nghiệm khả nảy mầm hạt thóc, hạt lạc hạt ngơ; thử nghiệm khả sinh trưởng loại lúa, lạc ngơ Qua đó, chất kháng nấm tách thơ pha lỗng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nước cất loại hạt kể ngâm trong dung dịch pha lỗng Sau đó, hạt đưa lên lớp bơng ẩm nhằm tạo điều kiện thuận lợi nẩy mầm 25oC Độ ẩm kiểm tra hàng ngày kích thước (cm) hạt nẩy mầm đo lại sau đến ngày ủ mầm Đối chứng hạt ngâm nước cất trước ủ mầm Nhằm đánh giá tính an tồn chất kháng nấm chất kháng khuẩn lên sinh trưởng non, mầm hạt mẫu đối chứng trồng đất Sau - ngày phát triển ổn định, chất kháng nấm tách thô pha loãng đến nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phun lên bề mặt Đối chứng nước cất phun lên bề mặt Màu sắc quan sát hàng ngày Sau ngày thử nghiệm, kích thước ghi lại so sánh Tổng kết kết nghiên cứu B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập các vùng sinh thái khác Từ tháng 11 năm 2012 đến tháng 10 năm 2013, nhóm nghiên cứu tiến hành thu thập 79 mẫu đất vườn Quốc gia vùng đất canh tác nông nghiệp lân cận Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin Côn Đảo 1.441 chủng vi khuẩn hiếu khí sinh nội bào tử phân lập phương pháp xử lý nhiệt [45] Dựa đặc điểm khác biệt màu sắc, kích thước, cấu trúc bề mặt mép viền khuẩn lạc, 252 (17,5%) chủng giải trình tự gen 16S rRNA (xấp xỉ 1.500 bp) So sánh sở liệu Eztaxon-e cho thấy, 14 chủng có số tương đồng gen 16S rRNA cao với chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 99,93% Gen 16S rRNA 14 chủng tương đồng sai khác nucleotide vị trí 583 (G thay A) so với chủng chuẩn FZB42 Khơng có chủng có trình tự gen 16S rRNA tương đồng cao với loài B methylotrophicus B oryzicola Trong số 14 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum, chủng phân lập Cúc Phương, chủng phân lập Bạch Mã, chủng phân lập Chư Yang Sin chủng phân lập Côn Đảo 12 (86%) chủng phân lập đất canh tác nông nghiệp; có chủng BM 1912 CĐH 1701 phân lập đất rừng Ngoài ra, B amyloliquefaciens subsp plantarum SP1901 phân lập từ mẫu đất rừng Hoàng Liên nghiên cứu Thông tin chi tiết 15 chủng trình bày bảng Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn Cùng với chủng SP 1901, 14 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum nghiên cứu sinh chất kháng nấm gây bệnh F oxysporum, S hydrophilum, R solani P capsici với kích thước vịng kháng nấm trung bình loại nấm 4,2 mm, 10,6 mm, 7,7 mm 7,4 mm Các chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum thử nghiệm sinh hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lúa X oryzae với kích thước vịng kháng trung bình 20,8 mm Ngồi ra, hoạt tính kháng nấm chủng vi khuẩn thể rõ ràng thử nghiệm với loại nấm sợi loại nấm men thường gặp A oryzae, A niger S cerevisiae (Bảng 2) Điều chứng tỏ ràng chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập mơi trường tự nhiên Việt Nam sinh chất có phổ hoạt tính rộng kháng nấm kháng khuẩn Bảng Thông tin 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum STT Tên chủng CP 1604 CP 1801 CP 1205 BM 0621 BM 0824 BM 1912 CYS 0101 Loại đất NN NN NN NN NN R NN Tọa độ 20.39730 N 20.40270 N 20.36010 N 16.09630 N 16.27200 N 15.99740 N 12.65070 N 105.58793 E 105.53779 E 105.67194 E 108.08954 E 108.00317 E 107.99320 E 108.09832 E Độ tương đồng (%) 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 Số hiệu đoạn 16S rDNA tham chiếu CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 10 11 12 13 14 15 CYS 0208 CYS 0816 CYS 0901 CYS 0911 CĐH 0101 CĐH 0102 CĐH 1701 SP 1901 NN NN NN NN NN NN R R 12.61560 N 12.49300 N 12.52710 N 12.52710 N 8.68555 N 8.68555 N 8.68916 N 22.28469 N 108.12942 E 108.28791 E 108.35777 E 108.35777 E 106.59250 E 106.59250 E 106.58861 E 103.89341 E 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 99,93 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 CP000560 NN: nơng nghiệp; R: rừng Phân tích hệ genome B amyloliquefaciens subsp plantarum cho thấy 9% hệ genome vi khuẩn chứa gen mã hóa chất kháng nấm kháng khuẩn (Chowdhury et al., 2015) Đa số chất có chất peptide tổng hợp không qua ribosome bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin bacillomycin) polyketide (difficidin, bacillaene macrolactin) Giống chủng công bố, 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái khác Việt Nam có khả sản sinh chất kháng nấm vi khuẩn gây bệnh Trong số lồi vi khuẩn ứng dụng làm chế phẩm phịng trừ loại bệnh hại trồng, Bacillus trọng nghiên cứu vi khuẩn có khả tạo nội bào tử để tồn lâu chế phẩm điều kiện bảo quản thường Nhiều chủng B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens B amyloliquefaciens công bố khả đối kháng với loại vi sinh vật gây bệnh trồng in vitro chủng L-H15 đối kháng nấm F oxysporum [22]; chủng S76-3 đối kháng nấm F graminearum [20]; chủng GR53 đối kháng nấm R solani [32]; chủng CNU114001 đối kháng với 12 loại nấm gây bệnh Alternaria panax, Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum, C orbiculare, Corynespora cassicola, F oxysporum, Penicillium digitatum, P capsici, R solani, Stemphliyum lycopersici, Pyricularia grisea Sclerotinia sclerotiorum [30] Nhiều chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum có khả phịng trừ giảm thiểu bệnh cho trồng thử nghiệm nhà kính dịch ni cấy dịch tế bào chủng NJZJSB3 bảo vệ cải dầu chống lại hoàn toàn xâm nhiễm nấm Sclerotinia sclerotiorum [48]; lạc xử lý với chủng BZ6-1 giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh R solanacearum từ 84,5% xuống 12,1% [47] Hơn nữa, bổ sung vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum vào phân hữu làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm bệnh trồng chủng S20 làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum cà tím từ 56% xuống cịn 22% [7]; chủng HR62 làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum cà chua xuống 65% [27] Chính vậy, nghiên cứu nhằm đánh giá khả thúc đẩy sinh trưởng, phát triển tạo suất cho trồng việc làm cần thiết nhằm tìm kiếm chủng B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens hữu ích sử dụng sản xuất chế phẩm phân bón hữu sinh học phù hợp với điều kiện đất canh tác nông Việt Nam Bảng Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn S hydrophilum R solani P capsici X oryzae A oryzae A niger S cerevisiae CP 1604 CP 1801 CP 1205 BM 0621 F oxysporum Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn (D - d, mm) Kháng nấm vi khuẩn gây bệnh Kháng nấm khác 5 13 11 11 12 11 10 9 23 20 21 19 7 5 BM 0824 BM 1912 CYS 0101 CYS 0208 CYS 0816 CYS 0901 CYS 0911 CĐH 0101 CĐH 0102 CĐH 1701 SP 1901 5 5 4 13 12 12 11 12 10 11 8 11 7 10 6 11 9 6 6 21 21 18 23 23 22 20 23 18 17 23 7 2 6 10 4 4 5 9 Enzyme ngoại bào Thử nghiệm dịch nuôi cấy ngoại bào cho thấy 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum sinh enzyme ngoại bào lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase chitinase Kích thước vịng phân giải loại chất tương đương thể chi tiết bảng Bảng Khả sinh loại enzyme ngoại bào Tên chủng CP 1604 CP 1801 CP 1205 BM 0621 BM 0824 BM 1912 CYS 0101 CYS 0208 CYS 0816 CYS 0901 CYS 0911 CĐH 0101 CĐH 0102 CĐH 1701 SP 1901 Lipase 11 11 10 11 10 9 10 7 Hoạt tính enzyme ngoại bào (D - d, mm) Protease CMCase Amylase Chitinase 23 20 17 23 23 20 17 23 23 17 16 24 25 18 16 23 23 19 16 21 23 15 16 23 23 17 17 22 23 19 16 21 23 19 16 21 23 18 16 21 23 20 18 23 23 20 15 22 22 19 15 22 21 20 16 22 19 16 18 22 Xylanase 20 17 17 20 17 20 16 17 20 17 17 20 18 18 19 Khả phân giải phosphate khó tan sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum có khả phân giải phosphate khó tan Ca3(PO4)2 Mức độ giải phóng phosphate vơ vào môi trường nuôi cấy giao động từ 19,64 - 74,21 µg/ml Bên cạnh đó, số chủng có khả sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA rõ ràng chủng CDH 0101 (3,28 µg/ml) SP 1901 (1,98 µg/ml); số chủng sinh hàm lượng IAA thấp CP 1604 CYS 0101 (Bảng 4) Bảng Khả phân giải phosphate khó tan sinh chất kích thích sinh trưởng IAA Tên chủng CP 1604 CP 1801 CP 1205 BM 0621 BM 0824 BM 1912 Lượng phosphate hịa tan (µg/ml; GTTB ± KBT) 49,67 ± 0,61 53,12 ± 1,96 53,25 ± 2,19 54,45 ± 5,13 63,24 ± 0,53 61,21 ± 2,99 Lượng IAA sinh GTTB ± KBT) 0,69 ± 0,09 1,41 ± 0,05 1,40 ± 0,04 1,18 ± 0,07 1,07 ± 0,08 1,44 ± 0,04 (µg/ml; CYS 0101 CYS 0208 CYS 0816 CYS 0901 CYS 0911 CDH 0101 CDH 0102 CDH 1701 SP 1901 19,64 ± 2,43 65,84 ± 1,85 64,79 ± 1,12 63,03 ± 1,34 74,21 ± 0,74 66,82 ± 1,91 61,13 ± 1,37 67,32 ± 0,73 60,85 ± 2,62 0,64 ± 0,12 1,38 ± 0,04 1,30 ± 0,11 1,55 ± 0,08 1,33 ± 0,11 3,28 ± 0,09 0,88 ± 0,06 0,89 ± 0,03 1,98 ± 0,10 Từ kết cho thấy, bên cạnh khả sinh chất kháng nấm chất kháng vi khuẩn gây bệnh hại cây, B amyloliquefaciens subsp plantarum chủng có khả phân giải phosphate khó tan số chủng CĐH 0101 SP 10901 có khả sinh chất kích thích sinh trưởng IAA rõ ràng mơi trường ni cấy (Bảng 3.4) Các đặc tính có lợi cho trồng công bố số chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum [28, 35] Ngoài ra, tất chủng B velezensis sinh enzyme thủy phân ngoại bào lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase chitinase Đây đặc tính quan trọng nhằm thúc đẩy q trình phân hủy chất hữu sở để lựa chọn chủng vi khuẩn ứng dụng sản xuất chế phẩm ủ phân compost bổ sung chủng với phân bón hữu nhằm thúc đẩy phát triển trồng Phân tích đa dạng kiểu gen chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum Phân tích dấu vân tay rep-PCR Hình Sơ đồ mối tương đồng kiểu gen xây dựng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng mồi ERIC chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái khác Việt Nam Nhằm phân tích tính đa dạng mặt di truyền chủng vi khuẩn B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái khác Việt Nam, kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng loại mồi ERIC GTG5 thực Đối với mồi ERIC, phản ứng PCR tạo 11 loại băng ADN nằm khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp Số lượng băng ADN tạo cho chủng giao động từ đến Phương pháp phân tích tính tương đồng xác định loại kiểu gen với nhóm chủng có mơ hình băng ADN chủng CP 1604, CP 1801 SP 1901; chủng BM 0621 CYS 0208; chủng BM 0824, CYS 0101, CDH 0101, CDH 0102 CDH 1701 Năm chủng lại gồm CYS 0816, CYS 0901, BM 1912, CYS 0911 CP1205 sở hữu riêng loại kiểu gen khác (Hình 1) Tương tự, mồi GTG5, phản ứng PCR tạo 15 loại băng ADN nằm khoảng kích thước từ 500 - 5.000 bp Số lượng băng ADN tạo cho chủng giao động từ đến Phương pháp phân tích tính tương đồng xác định 13 loại kiểu gen Trong đó, chủng CDH 0101 CDH 0102 xếp vào nhóm (Hình 2) Phân tích trình tự đa gen Để kiểm chứng lại khả phân tách loại mồi ERIC GTG5 kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR, trình tự đa gen chủng CP 1604 phân tích so sánh với chủng SP 1901 Trình tự ADN 5.547 bp kết nối từ gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL 16S rRNA hai chủng sai khác 83 nucleotide với số lượng sai khác cho gen 25, 8, 20, 17, 12 nucleotide Trên phát sinh chủng loại, chủng SP 1901 CP 1604 nằm tách biệt nhóm B velezensis khác (Hình 3) Điều chứng tỏ phần kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng mồi GTG5 cho kết phân tách tốt xác so với mồi ERIC phân tích đa dạng di truyền lồi B amyloliquefaciens subsp plantarum Hình Sơ đồ mối tương đồng kiểu gen xây dựng kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng mồi GTG5 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái khác Việt Nam B amyloliquefaciens subsp plantarum số loài vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis [40] Đây lồi đề xuất đặt tên vào năm 2005 với tên gọi B velezensis sau phát khả sinh chất hoạt động bề mặt lipopeptide kháng khuẩn [41] Năm 2010, Madhaiyan cộng mơ tả lồi B methylotrophicus phân lập từ đất vùng rễ lúa Hàn Quốc Bên cạnh khả sử dụng methanol, triethylamine ethanol nguồn carbon, loài vi khuẩn cịn có khả sinh chất IAA ACC deaminase kích thích trồng phát triển [35] Năm 2011, Boriss cộng phát nhóm chủng vi khuẩn gần gũi với chủng B amyloliquefaciens FZB42 có khả sống nội cộng sinh rễ Arabidopsis nhóm chủng vi khuẩn gần gũi với chủng B amyloliquefaciens DSM khả Dựa kết lai DNA, B amyloliquefaciens tách thành loài phụ B amyloliquefaciens subsp plantarum B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens [4] Gần đây, Chung cộng mô tả loài B oryzicola sống nội cộng sinh rễ lúa có khả kích thích thực vật phát triển, sinh chất kháng nấm vi khuẩn gây bệnh có khả tăng cường hệ miễn dịch thực vật [10] Do sở hữu nhiều đặc tính có lợi quan trọng cho trồng, loài 10 vi khuẩn kể nhận nhiều quan tâm nhà nghiên cứu; 30 chủng phân lập từ vùng sinh thái khác giải trình tự tồn genome để tìm hiểu mối tương tác vi khuẩn vật chủ sống nội cộng sinh [13] Song song với đó, hệ thống phân loại loài vi khuẩn kể kiểm chứng lại So sánh in silico toàn hệ genome cho thấy bốn lồi vi khuẩn kể có hệ số tương đồng ADN - ADN lớn 84% (khác với số lai ADN ADN thực nghiệm trước đây) Chính vậy, B methylotrophicus, B amyloliquefaciens subsp amyloliquefaciens B oryzicola định lại tên loài đặt ban đầu B velezensis [13] 100 Bacillus velezensis NRRL B-23189 Bacillus velezensis NRRL B-23190 0.02 Bacillus velezensis NRRL BD-621 83 Bacillus velezensis FZB42 Bacillus velezensis Mito-5-13 100 99 Bacillus velezensis Mito-7-4 Bacillus velezensis Tikusei-14-1 SP 1901 100 78 100 Bacillus velezensis Hitachioomiya-8-2 Bacillus velezensis NRRL BD-557 CP 1604 Bacillus velezensis NRRL BD-545 100 93100 Bacillus velezensis NRRL B-41580 Bacillus velezensis NRRL B-4257 100 Bacillus velezensis NRRL BD-569 100 Bacillus velezensis NRRL BD-568 100 Bacillus amyloliquefaciens NRRL BD-601 100 100 Bacillus amyloliquefaciens DSM Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-14393 Bacillus atrophaeus NRRL NRS-213 100 Bacillus mojavensis NRRL B-14698 100 Bacillus vallismortis NRRL B-14890 93 Bacillus subtilis subsp subtilis NRRL NRS-744 100 94 Bacillus tequilensis NRRL B-41771 Bacillus subtilis subsp inaquosorum NRRL B-23052 100 Bacillus subtilis subsp spizizenii NRRL B-23049 Bacillus licheniformis DSM 13 100 Bacillus sonorensis NRRL B-23154 Bacillus pumilus NRRL NRS-272 Bacillus cereus ATCC 14579 Hình Mối quan hệ chủng SP 1901 CP 1604 phát sinh chủng loại loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis xây dựng dựa đoạn ADN 5.547 bp kết nối từ gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL 16S rRNA 11 Tổ hợp kết kỹ thuật rep - PCR sử dụng loại mồi ERIC GTG5 cho thấy có 14 loại kiểu gen số 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum nghiên cứu Chỉ có chủng CĐH 0101 CĐH 0102 phân lập từ mẫu đất có kiểu gen tương đồng Kết rep - PCR kiểm chuẩn kỹ thuật giải trình tự đa gen chủng SP 1901 CĐH 1604 phân tách rõ ràng phát sinh chủng loại Điều chứng tỏ có đa dạng cao mặt di truyền chủng B velezensis phân lập vùng sinh thái khác Việt Nam Tối ưu điều kiện lên men Với môi trường nhân giống đuợc sử dụng nghiên cứu (TSB, 1/5 TSB, NA, 1/5 NA, LB, 1/5 LB), chủng CP1604 sinh trưởng tốt môi trường TSB với giá trị OD600nm sau 24 nuôi lắc đạt 2,2; đồng thời mơi trường cho hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm tốt (D-d 30 mm mm), với mơi trường 1/5 TSB chủng vi khuẩn sinh trưởng rõ rệt (OD600nm = 1,4; hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm D-d tương ứng 20 mm mm) Tương tự, môi trường LB NA, chủng vi khuẩn sinh trưởng sinh chất kháng khuẩn kháng nấm cao đáng kể so với môi trường tương ứng 1/5 LB 1/5 NA; nhiên tất số nhỏ môi trường TSB Do chọn môi trường TSB cho nghiên cứu sau Nhiệt độ xem yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả sinh trưởng khả sinh chất có hoạt tính sinh học vi sinh vật Trong nghiên cứu lựa chọn dải nhiệt độ từ 20ºC đến 40ºC để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm chủng CP1604 Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ 35ºC thích hợp cho sinh trưởng chủng CP1604 với giá trị OD 600nm=2.5; nhiên hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm lại thể tốt nhiệt độ 30ºC, giá trị D-d tương ứng 29 mm mm Với mục đích tối ưu điều kiện lên men thu chất kháng khuẩn kháng nấm, nhiệt độ 30ºC lựa chọn nghiên cứu Trong lên men, tốc độ khuấy có ảnh hưởng định đến sinh trưởng hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật Trong nghiên cứu này, chủng CP1604 sinh trưởng tốt (OD600nm=2,8) nuôi khuấy tốc độ 150 vịng/phút, điều kiện thích hợp cho khả sinh chất kháng khuẩn kháng nấm (D-d tương ứng 34 mm 12 mm) Tốc độ thơng khí yếu tố ảnh hưởng then chốt đến sinh trưởng vi sinh vật hiếu khí nói chung nhóm vi khuẩn Bacillus nói riêng Với bốn tỉ lệ thơng khí 50, 75, 100 125% nghiên cứu, kết thí nghiệm cho thấy chủng CP1604 sinh trưởng tốt tỉ lệ thơng khí 75% (OD600nm=3.0), tỉ lệ thơng khí thích hợp với khả sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm chủng vi khuẩn nghiên cứu (D-d tương ứng 37 mm 15 mm) Trong nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng khả sinh chất kháng khuẩn kháng nấm, thời điểm sau 48 lên men, chủng vi khuẩn nghiên cứu đạt giá trị OD600nm cực đại (2.9); nhiên hoạt tính kháng khuẩn lại cao sau 36 ni (D-d=34 mm), hoạt tính kháng nấm cao nuôi 36 48 (D-d=14 mm) Như vậy, nghiên cứu này, điều kiện lên men thích hợp cho chủng CP1604 môi trường TSB, nhiệt độ 30ºC, tốc độ khuấy 150 vịng/phút, tốc độ thơng khí 75%, thời gian lên men 36 12 (a) (b) (c) (d) (e) Hình Ảnh hưởng mơi trường (a), nhiệt độ (b), tốc độ khuấy (c), tốc độ thơng khí (d) thời gian ni cấy (e) đến sinh khối khả sinh chất kháng nấm chủng vi kha\uẩn CP1604 Tách chiết, tinh xác định chất sinh học chất kháng nấm chất kháng khuẩn từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 So sánh hiệu tách chiết chất kháng nấm chất kháng khuẩn Trong số chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum nghiên cứu, lựa chọn chủng CP 1604 cho nghiên cứu tách chiết tinh chất kháng sinh Nhằm tìm hiểu điều kiện ni cấy phù hợp cho chủng CP 1604 sinh chất kháng sinh, tiến hành thử nghiệm môi trường nuôi cấy TSB, 1/5 TSB, NB, 1/5 NB, LB, 1/5 LB nhiệt độ nuôi cấy khác 13 thời gian nuôi cấy khác Kết là, chủng CP 1604 sinh chất kháng nấm kháng khuẩn mạnh nuôi cấy môi trường TSB nhiệt độ 30oC sau thời gian 36 Từ dịch ni cấy chủng CP 1601, chất có hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn tách chiết phương pháp khác Đối với phương pháp tách chiết dung mơi hữu cơ, chất có hoạt tính chiết rút mạnh dung môi - butanol - pentanol Hoạt tính kháng nấm khơng xuất dịch nuôi cấy tách chiết chloroform hexan hoạt tính kháng khuẩn trì cao tách chiết chloroform Điều chứng tỏ có khác tính tan dung môi khác nên dịch nuôi cấy chủng CP 1604 chứa chất kháng nấm kháng khuẩn riêng biệt Hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn thu cao tách chiết phương pháp hấp phụ với hạt amberlite - XAD7 tách chiết với ethanol từ cặn đông khô Cặn tủa pH thấp dịch ni cấy có hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn hoạt tính kháng thấp so với phương pháp lại (Bảng 5) Tinh chất kháng nấm kháng khuẩn Từ kết thu trên, chất kháng sinh thô chuẩn bị cho tinh tách chiết liên tiếp phương pháp nhằm loại bỏ tạp chất không mong muốn Đầu tiên, dịch nuôi cấy chủng CP 1604 tách chiết với dung môi hữu - butanol Sau đó, dịch kháng sinh tiếp tục tách chiết phương pháp hấp phụ với hạt amberlite - XAD7 nồng độ ethanol 75% Kết kiểm tra máy HPLC cho thấy đường sắc ký đồ sau tách chiết lần có nhiều đỉnh rõ ràng so với dịch chiết lần - butanol Chất kháng sinh thô sau tinh kỹ thuật HPLC Kết thử nghiệm hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn phân đoạn thu cho thấy có chất rõ ràng: chất có hoạt tính kháng nấm thơi thời gian 5,328 phút chất có hoạt tính kháng khuẩn thơi thời gian 15,313 phút (Hình 4) Điều chứng tỏ chủng CP 1604 sản sinh loại chất có hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn khác Bảng Hoạt tính kháng nấm vi khuẩn dịch chiết thơ Hoạt tính đối kháng (D - d, mm) STT Phương pháp tách chiết Dung môi hữu Fusarium oxysporum Xanthomonas oryzae Benzen 22 - butanol 26 Chloroform 26 Ethyl acetate 26 Hexan 2pentanol 34 Tuluene 16 Amberlite - XAD7 10 32 Đông khô 10 30 Tủa pH thấp 24 14 5.382 15.313 DAD1 B, Sig=210,40 Ref=360,100 (TRUNG\TR126.D) mAU 60 50 40 30 20 10 -10 10 15 Hình Sắc ký đồ HPLC chất kháng nấm (5,328 phút) chất kháng khuẩn (15,313 phút) tinh từ dịch nuôi cấy chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 Xác định các tính chất chất kháng nấm kháng khuẩn Phổ khối chất có hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn phân tích (Hình 5) Trên phổ ion dương, khối lượng phân tử chất kháng nấm xác định 1042 Da (M + H+ = 1043) Trên phổ ion âm, khối lượng phân tử chất kháng khuẩn xác định 402 Da (M – H+ = 401) Khi xử lý giải nhiệt độ từ 60oC đến 100oC giờ, chất kháng nấm trì hoạt tính kháng F oxysporum hoạt tính kháng vi khuẩn X oryzae chất kháng khuẩn giảm rõ rệt, đặc biệt bị xử lý 100oC (Bảng 3.6) Cả chất kháng nấm kháng khuẩn giảm hoạt tính dung dịch đệm có pH axít hoạt tính kháng nấm vi khuẩn trì tốt dung dịch đệm có pH bazơ (Bảng 7) Hoạt tính kháng nấm kháng vi khuẩn chất không bị ảnh hưởng enzyme thủy phân trypsin, α-chymotrypsin, amylase, lipase proteinase K (Bảng 8) A) B) Hình Khối phổ phân đoạn chất có hoạt tính kháng nấm (A) phân đoạn chất có hoạt tính kháng khuẩn (B) Bảng 3.6 Khả bền nhiệt chất kháng nấm kháng khuẩn Nhiệt độ xử lý Thời gian xử lý (phút) Hoạt tính đối kháng (D - d, mm) Fusarium Xanthomonas 15 60oC 80oC 100oC oxysporum oryzae 30 25 60 25 90 25 120 25 30 24 60 20 90 20 120 20 30 20 60 15 90 10 120 8 25 Đối chứng Bảng Khả bền pH chất kháng nấm chất kháng khuẩn Hoạt tính đối kháng (D - d, mm) Giá trị pH xử lý Fusarium oxysporum Xanthomonas oryzae pH 3,0 20 pH 4,0 24 pH 5,0 25 pH 6,0 25 pH 7,0 25 pH 8,0 25 pH 9,0 25 Đối chứng 25 Bảng Khả bền với enzyme thủy phân Hoạt tính đối kháng (D - d, mm) Enzyme Fusarium oxysporum Xanthomonas oryzae Amylase 25 Chymotrypsin 25 16 Lipase 25 Protease 25 Trypsin 25 Đối chứng 25 B amyloliquefaciens subsp plantarum (hay gọi B velezensis, B methylotrophicus B oryzicola) loài vi khuẩn sở hữu nhiều đặc tính q có lợi cho trồng, đặc biệt khả sinh chất kháng nấm kháng vi khuẩn gây bệnh [13] Do đó, nhiều chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập từ vùng sinh thái khác ứng dụng đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh Nhiều chất có hoạt tính sinh học từ lồi B velezensis nghiên cứu nhằm làm rõ chất cấu trúc hóa học chế cơng chất kháng sinh đến vị trí đích vi sinh vật gây bệnh Từ sưu tầm chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng sinh thái khác Việt Nam, chủng CP 1604 chứng minh có khả sinh chất kháng nấm kháng khuẩn mạnh kháng lại loại nấm hại F oxysporum, S hydrophilum, R solani, P capsici vi khuẩn gây bệnh bạc X oryzae Chất hoạt tính tách chiết với hiệu tương đương phương pháp hấp phụ hạt amberlite-XAD7, chiết ethanol từ dịch đông khô, tủa pH thấp chiết dung môi hữu - butanol - pentanol Kết tinh HPLC cho thấy chất kháng nấm chất kháng khuẩn hai chất khác hai thời điểm khác Phân tích khối phổ cho thấy, bên cạnh mảnh phổ khối quan sát thấy phổ ion dương, mảnh có khối lượng phân tử giống iturin A (M + H+ = 1043) tìm thấy phân đoạn chất có hoạt tính kháng nấm Tương tự mảnh có khối lượng phân tử giống macrolactin A (M – H+ = 401) phát thấy phổ ion âm phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn Điều chứng tỏ chủng CP 1604 sản sinh đồng thời chất kháng nấm kháng khuẩn dịch nuôi cấy hiệp đồng chất giúp cho dịch nuôi cấy chủng CP 1604 có hoạt tính kháng nấm vi khuẩn phổ rộng A) B) Hình Hoạt tính chất kháng nấm chất kháng khuẩn xử lý nhiệt nhiệt độ khác Hoạt tính kháng nấm F oxysporum (A) xử lý nhiệt độ 60oC 90 phút (1) 120 phút (2), xử lý nhiệt độ 80oC 90 phút (3) 120 phút (4), xử lý nhiệt độ 100oC 90 phút (5) 120 phút (6) Hoạt tính kháng khuẩn X oryzae (B) xử lý nhiệt độ 100oC 30 phút (1), 60 phút (2), 90 phút (3) 120 phút (4) ĐC đối chứng 17 Lipopeptide chất kháng sinh sản sinh từ vi khuẩn Bacillus chi có quan hệ gần gũi Paenibacillus Brevibacillus Chất kháng sinh cấu tạo từ thành phần chuỗi peptide mạch thẳng vòng liên kết với phần mạch acid béo vị trí đầu N peptide Trong số lipopeptide công bố, iturin xếp vào nhóm khơng mang điện tích dương, có amino acid khép vòng liên kết amide đầu N phân tử β - amino acid béo đầu C amino acid cuối [11] Iturin thường tách chiết từ lồi vi khuẩn thuộc nhóm B subtilis, có B amyloliquefaciens subsp plantarum [37] Dựa khác thành phần cấu tạo chuỗi amino acid cấu trúc phân tử acid béo, lớp iturin chia làm nhiều loại với tên gọi khác iturin, mixirin, subtulene, mycosubtilin, mojavensin bacillomycin Kháng sinh lớp iturin có hoạt tính kháng nấm mạnh khơng có hoạt tính kháng khuẩn Iturin công vào thành phần sterol màng tế bào nấm, làm tăng tính thấm ion kali, phá vỡ màng tế bào, làm thoát bất hoạt thành phần tế bào tế bào nấm, dẫn đến tiêu diệt tế bào nấm [11, 20] Theo công bố trước đây, iturin A có phổ hoạt tính kháng nấm rộng, kháng lại loại nấm Fusarium, Rhizoctonia, Penicillium, Aspergillus Pyricularia [19, 42] Iturin A sản sinh từ chủng CP 1604 có phổ hoạt tính khang nấm mạnh kháng lại F oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger Saccharomyces cerevisiae Bên cạnh lipopeptide, polyketide chất trao đổi thường tìm thấy dịch ni cấy vi khuẩn Bacillus Polyketide thường có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus kháng tế bào ung thư [43] Phân tích ADN chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum FZB42 cho thấy hệ genome có nhóm gene pks1, pks2 pks3 quy định tổng hợp polyketide bacillaene, macrolactin difficidin [6, 43] Macrolactin lactone dạng vịng có 24 phân tử carbon liên kết với hydrocarbon vị trí carbon số Đây chất phát lần vào năm 1989 dịch ni cấy lồi vi khuẩn biển đến có khoảng gần 20 loại macrolactin cơng bố [5, 21] Trong số đó, macrolatin A có hoạt tính kháng vi khuẩn mạnh nhất, đặc biệt khả đối kháng với số loại vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh Staphylococcus aureus kháng methicillin Enterococcus kháng vancomycin [31, 39] Macrolactin A phát dịch nuôi cấy số chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum chủng GA1 [1] ESB-2 [24] Macrolactin A sản sinh từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum HR62 NJN-6 chứng minh có hoạt tính kháng lại loại vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum [27, 49] Macrolactin A sản sinh từ chủng CP 1604 chứng minh có hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh bạc X oryzae Hơn nữa, dịch nuôi cấy chủng CP 1604 có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng thuốc S aureus E faecalis Lipopeptide từ vi khuẩn Bacillus chất trao đổi bậc sản sinh theo đường sinh tổng peptide không cần ribosome (nonribosomally synthesized peptide) nhờ có mặt nhóm đa enzyme non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) Chất kháng sinh chứa hỗn hợp amino acid dạng D dạng L, giúp cho chất kháng sinh bền với enzyme thủy phân [11] Điều hồn tồn với chất kháng nấm chất kháng khuẩn sinh từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 Cả hai chất bền với loạt protease trypsin, α-chymotrypsin, proteinase K Ngồi ra, hai chất trì hoạt tính xử lý pH bazơ Iturin A bền nhiệt độ so với macrolactin A Thử nghiệm tính an toàn chất kháng nấm chất kháng khuẩn Bước đầu thử nghiệm tính an tồn chất kháng nấm chất kháng khuẩn, tiến hành đánh giá sơ ảnh hưởng chất tới sinh trưởng phát triển số loại trồng Qua đó, chất kháng nấm kháng khuẩn thơ tách chiết - butanol kết hợp với hạt amberlite - XAD7 từ dịch nuôi cấy chủng CP 1604 pha tới nồng độ ức chế tối thiểu nấm F oxysporum đưa vào thử nghiệm 18 Thử nghiệm nẩy mầm hạt Các loại hạt lúa, lạc ngô sau ngâm dịch kháng sinh thô ủ trong lớp ẩm Sau ngày ngày, độ dài mầm hạt đo lại Kết cho thấy, độ dài trung bình mầm hạt xử lý dịch kháng sinh thơ phát triển bình thường mẫu đối chứng (giá trị P > 0,05 phép so sánh) Sau ngày, độ dài mầm hạt lúa, lạc ngô xử lý 1,4 cm, 3,9 cm 6,6 cm; sau ngày, kích thước hạt tăng lên 2,8 cm, 5,6 cm 11,9 cm (Bảng 3.9) Điều chứng tỏ chất kháng nấm kháng khuẩn sản sinh từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 không ảnh hưởng tới nẩy mầm hạt Bảng Khả nẩy mầm hạt xử lý với chất kháng sinh Tốc độ nảy mầm hạt (GTTB ± KBT, cm) Sau ngày Sau ngày Đối chứng Thí nghiệm Giá trị P Đối chứng Thí nghiệm Hạt thóc 1,5 ± 0,2 1,4 ± 0,3 Hạt lạc 3,7 ± 0.3 Hạt ngô 6,7 ± 0,6 Giá trị P 0,19 2,9 ± 0,4 2,8 ± 0,7 1,00 3,9 ± 0,2 0,09 5,8 ± 0,6 5,6 ± 0,9 0,64 6,6 ± 0,5 0,84 12,1 ± 1,0 11,9 ± 1,3 0,84 GTTB = Giá trị trung bình; KBT = Khoảng biến thiên Thử nghiệm khả sinh trưởng Hạt nẩy mầm gieo vào đất tới phát triển ổn định (khoảng - ngày) Sau đó, dịch kháng sinh thơ phun trực tiếp lên vị trí bề mặt Quan sát hàng ngày cho thấy mầu sắc trạng thái khơng có hay xuất thay đổi khác biệt so với đối chứng Sau ngày, kích thước đo lại so sánh Kết qủa cho thấy khơng có khác biệt kích thước nhóm đối chứng nhóm thí nghiệm (giá trị P > 0,05 phép so sánh, Bảng 3.10) Điều chứng tỏ chất kháng nấm kháng khuẩn sản sinh từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 không ảnh hưởng tới sinh trưởng loại thử nghiệm Bảng 3.10 Khả sinh trưởng non xử lý với chất kháng sinh Tốc độ sinh trưởng non (GTTB ± KBT, cm) Đối chứng Thí nghiệm Giá trị P Lá Lá Lá Lá Lá Lá Cây lúa 15,1 ± 0,3 9,1 ± 0,3 14,8 ± 0,2 9,0 ± 0,3 0,59 0,80 Cây lạc 19,0 ± 0,3 12,7 ± 0,3 19,8 ± 0,2 13,1 ± 0,1 0,06 0,28 Cây ngô 17,3 ± 0,5 14,7 ± 0,4 17,3 ± 0,3 15,2 ± 0,3 1,00 0,15 GTTB = Giá trị trung bình; KBT = Khoảng biến thiên Sử dụng thuốc trừ sâu hóa học phịng trừ sâu bệnh hại khơng gây nhiễm mơi trường mà cịn làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người Do đó, việc tìm kiếm chất có thời gian bán hủy nhanh, tiêu diệt đặc hiệu vi sinh vật đích có nguồn gốc từ vi sinh vật nhà khoa học quan tâm [12] Vì vậy, nghiên cứu để thử nghiệm tính an tồn hiệu phòng trừ bệnh hại việc làm cần thiết nhằm tìm kiếm khả ứng dụng 19 chất kháng nấm chất kháng khuẩn từ chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 phát triển nông nghiệp xanh bền vững Đánh giá các kết đạt kết luận Đề tài thu kết sau: - Hoạt hóa nghiên cứu 15 chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập từ vùng sinh thái khác Việt Nam có đa dạng cao mặt di truyền - Các chủng có khả sinh tổng hợp chất kháng nấm vi khuẩn gây hại trồng Ngồi ra, chủng cịn có khả phân giải phosphate khó tan, sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA sản sinh hàng loạt enzyme thủy phân lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase chitinase - Chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum CP 1604 sản sinh chất kháng nấm chất kháng khuẩn Dựa phân tích khối phổ, chất kháng nấm xác định iturin A có trọng lượng phân tử 1042 Da chất kháng khuẩn macrolactin A có trọng lượng phân tử 402 Da - Chất kháng nấm bền nhiệt chất kháng khuẩn bị giảm hoạt tính bị xử lý 100oC Cả hai chất giảm hoạt tính pH axít trì hoạt tính pH bazơ Hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn không thay đổi xử lý với enzyme thủy phân trypsin, α-chymotrypsin, amylase, lipase proteinase K - Bước đầu thử nghiệm tính an toàn cho thấy chất kháng nấm chất kháng khuẩn sản sinh từ chủng CP 1604 không ảnh hưởng đến nẩy mầm sinh trưởng loại hạt thóc, hạt lạc hạt ngơ Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Tiếng Việt: Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum lồi thuộc nhóm vi khuẩn B subtilis Do sở hữu nhiều đặc tính q có lợi cho trồng, loài vi khuẩn nhận nhiều quan tâm nghiên cứu ứng dụng phòng trừ bệnh hại tăng xuất trồng 15 B amyloliquefaciens subsp plantarum phân lập vùng Hoàng Liên, Cúc Phương, Bạch Mã, Chư Yang Sin Cơn Đảo phát có hoạt tính kháng loại nấm hại Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani, Phytophthora capsici vi khuẩn gây bệnh bạc Xanthomonas oryzae Hơn nữa, chủng có khả phân giải phosphate khó tan, sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA sản sinh nhiều enzyme thủy phân lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase chitinase Phân tích đa dạng di truyền dựa kỹ thuật dấu vân tay rep - PCR sử dụng mồi ERIC GTG5 cho thấy mồi GTG5 phân tách tốt mồi ERIC với số lượng kiểu gen tạo tương ứng 13 Tổ hợp mơ hình băng ADN loại mồi tạo 14 loại kiểu gen Kết đa dạng di truyền kiểm chứng kỹ thuật giải trình tự đa gen chủng CP 1604 SP 1901 với phân tách rõ ràng phân loại Từ dịch ni cấy chủng CP 1604, chất có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum kháng khuẩn Xanthomonas oryzae tách chiết phương pháp hấp phụ hạt amberliteXAD7, chiết ethanol từ dịch đông khô, tủa pH thấp chiết dung môi hữu - butanol - pentanol Kết tinh HPLC cho thấy chất kháng nấm thời gian 5,328 phút chất kháng khuẩn thời gian 15,313 phút Bằng phương pháp phân tích khối phổ, chất kháng nấm xác định iturin A có trọng lượng phân tử 1042 Da chất kháng khuẩn macrolactin A có trọng lượng phân tử 402 Da Chất kháng nấm bền nhiệt chất kháng khuẩn bị giảm hoạt tính rõ rệt bị xử lý 100 oC thời gian Cả hai chất giảm hoạt tính pH axít trì hoạt tính pH bazơ Hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn không thay đổi xử lý với enzyme thủy phân trypsin, α-chymotrypsin, amylase, lipase proteinase K Với khả sinh loại enzyme thủy phân sinh chất có lợi cho trồng, chủng CP 1604 có tiềm ứng dụng để tạo chế phẩm làm phân bón hữu sinh học 20 Tiếng Anh: Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum is a species belonging to the bacterial group of B subtilis Due to various beneficial traits to plants, the bacterium has been received considerable attention for application in disease control and crop productivity In this study, 15 B amyloliquefaciens subsp plantarum strains isolated from various regions of Hoang Lien, Cuc Phuong, Bach Ma, Chu Yang Sin and Con Dao were demonstrated antagonistic activity against phythopathogenic fungi of Fusarium oxysporum, Sclerotium hydrophilum, Rhizoctonia solani and Phytophthora capsici and rice blight bacterium Xanthomonas oryzae Those strains were capable of solubilizing Ca3(PO4)2 and producing plant growth hormone of IAA Moreover, those strains produced a series of hydrolytic enzymes such as lipase, protease, amylase, CMCase, xylanase and chitinase Analysis of genetic diversity based on rep - PCR fingerprinting technique showed that primer ERIC had greater discrimination than primer GTG5 Number of DNA banding patterns generated by primer ERIC and GTG5 were and 13, respectively Combination of DNA banding patterns of both primers showed 14 different genotypes in 15 B velezensis strains Using multilocus sequencing technique, genetic diversity was confirmed by a clear discrimination of strain CP 1604 and SP 1901 in two different clusters on phylogenetic tree From liquid culture of CP 1604, substances with activity against Fusarium oxysporum and Xanthomonas oryzae were extracted by means of adsorption with amberlite-XAD7, extraction from lyophilized powder using ethanol, precipitation at low pH and extraction with organic solvents of - butanol and - pentanol The substances were subsequently purified by HPLC Antifungal substance was eluted at 5.328 while antibacterial substance was observed at 15.313 Mass spectrometry analysis showed that antifungal substance was iturin A with molecular weight of 1042 Da and antibacterial substance was macrolactin A with molecular weight of 402 Da The antifungal substance was stable at high temperature but antibacterial activity was significantly reduced when treated at 100° C for hours Both substances reduced activity at low pH but the activities maintained at high pH The activities against fungal and bacterium were not affected when treated with hydrolytic enzymes such as trypsin, α-chymotrypsin, amylase, lipase and proteinase K Due to the possession of many beneficial traits to plants and production of hydrolytic enzymes, the CP 1604 strains in this study have potential application on preparation of bio-fertilizer PHẦN III SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI 3.1 Kết nghiên cứu TT Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu kinh tế - kỹ thuật Tên sản phẩm Đăng ký Đạt Chủng B amyloliquefaciens sinh chất kháng nấm hại 01 chủng 15 chủng Chế phẩm diệt nấm hại trồng lít, MIC = 500 Đạt 3.2 Hình thức, cấp độ cơng bố kết Ghi địa cảm ơn tài trợ Sản phẩm TT ĐHQGHN quy định Cơng trình cơng bớ tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI/Scopus Tình trạng (Đã in/ chấp nhận in/ nộp đơn/ chấp nhận đơn hợp lệ/ cấp giấy xác nhận SHTT/ xác nhận sử dụng sản phẩm) Đánh giá chung (Đạt, không đạt) 21 1.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.1 4.1 4.2 Sách chuyên khảo xuất ký hợp đồng xuất Đăng ký sở hữu trí tuệ Bài báo quốc tế khơng thuộc hệ thống ISI/Scopus Bài báo tạp chí khoa học ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia báo cáo khoa học đăng kỷ yếu hội nghị quốc tế Đạt 5.1 5.2 Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn sách theo đặt hàng đơn vị sử dụng 6.1 6.2 Kết dự kiến ứng dụng quan hoạch định sách sở ứng dụng KH&CN 7.1 7.2 Ghi chú: - Cột sản phẩm khoa học công nghệ: Liệt kê thông tin sản phẩm KHCN theo thứ tự - Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chấp nhận có ghi nhận địa cảm ơn tài trợ ĐHQGHN theo quy định - Bản phơ tơ tồn văn ấn phẩm phải đưa vào phụ lục minh chứng báo cáo Riêng sách chuyên khảo cần có phơ tơ bìa, trang đầu trang cuối có ghi thông tin mã số xuất 3.3 Kết đào tạo TT Họ tên Thời gian kinh phí Cơng trình cơng bố liên quan (Sản phẩm KHCN, luận án, luận Đã bảo vệ tham gia đề tài (số tháng/số tiền) văn) Nghiên cứu sinh Học viên cao học Nguyễn Phương Liên Luận án thạc sỹ Đã bảo vệ Ghi chú: - Gửi kèm photo trang bìa luận án/ luận văn/ khóa luận giấy chứng nhận nghiên cứu sinh/thạc sỹ học viên bảo vệ thành công luận án/ luận văn; - Cột cơng trình cơng bố ghi mục III.1 22 PHẦN IV TỔNG HỢP KẾT QUẢ CÁC SẢN PHẨM KH&CN VÀ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI TT Sản phẩm Số lượng Số lượng đăng ký hoàn thành Bài báo cơng bớ tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI/Scopus Sách chuyên khảo xuất ký hợp đồng xuất Đăng ký sở hữu trí tuệ Bài báo quốc tế khơng thuộc hệ thống ISI/Scopus Số lượng báo tạp chí khoa học ĐHQGHN, 02 02 tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia báo cáo khoa học đăng kỷ yếu hội nghị quốc tế Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn sách theo đặt hàng đơn vị sử dụng Kết dự kiến ứng dụng quan hoạch định sách sở ứng dụng KH&CN Đào tạo/hỗ trợ đào tạo NCS Đào tạo thạc sĩ 01 01 23 PHẦN V TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ TT A B Nội dung chi Chi phí trực tiếp Th khốn chun mơn Ngun, nhiên vật liệu, Thiết bị, dụng cụ Công tác phí Dịch vụ th ngồi Hội nghị, Hội thảo, kiểm tra tiến độ, nghiệm thu In ấn, Văn phòng phẩm Chi phí khác Chi phí gián tiếp Quản lý phí Chi phí điện, nước Tổng số Kinh phí duyệt (triệu đồng) Kinh phí thực hiện (triệu đồng) 75 58 75 58 12 12 4,6 4,6 2,4 2,4 160 160 Ghi PHẦN V KIẾN NGHỊ (về phát triển kết nghiên cứu đề tài; quản lý, tổ chức thực cấp) - Cần nghiên cứu triển khai ứng dụng chủng B amyloliquefaciens subsp plantarum sản xuất loại phân bón hữu sinh học có khả phịng chống bệnh - Cần đánh giá hiệu tiêu diệt bệnh chất kháng nấm chất kháng khuẩn nhiễm bệnh PHẦN VI PHỤ LỤC (minh chứng sản phẩm nêu Phần III) Hà Nội, ngày 06 tháng 10 năm 2016 Đơn vị chủ trì đề tài (Thủ trưởng đơn vị ký tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (Họ tên, chữ ký) 24 ... THÔNG TIN CHUNG 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu điề u kiêṇ lên men và phương pháp tách chiế t chấ t kháng sinh diêṭ nấ m gây bênh ̣ thực vâ ̣t từ vi khuẩ n Bacillus amyloliquefaciens 1.2... nghệ Sinh học Vi? ??n Vi sinh vật KS Hà Thị Hằng Thành vi? ?n Công nghệ Sinh học Vi? ??n Vi sinh vật CN Nguyễn Thị Anh Đào Thành vi? ?n Công nghệ Sinh học Vi? ??n Vi sinh vật KS Nguyễn Mạnh Hùng Thành vi? ?n... kiện lên men thu chất kháng khuẩn kháng nấm, nhiệt độ 30ºC lựa chọn nghiên cứu Trong lên men, tốc độ khuấy có ảnh hưởng định đến sinh trưởng hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật Trong nghiên cứu