Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò hoạt tính sinh học một số dẫn xuất của axit ursolic tách chiết từ cây sơn trà poilan (eriobotrya poilanei)

1 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C ĐÀ N NG Cơng trình đư c hoàn thành t i Đ I H C ĐÀ N NG PHAN VĂN HÀ Ngư i hư ng d n khoa h c: TS NGUY N THANH TÂM NGHIÊN C U T NG H P VÀ THĂM DÒ HO T TÍNH SINH H C M T S D N XU T C A AXIT URSOLIC TÁCH CHI T T CÂY SƠN TRÀ POILAN (ERIOBOTRYA POILANEI) Ph n bi n 1: GS.TS.NGND ĐÀO HÙNG CƯ NG Ph n bi n 2: GS.TSKH NGUY N BIN Chuyên ngành: Hóa H u Mã s : 60.44.27 Lu n văn ñư c b o v trư c H i ñ ng ch m Lu n văn t t nghi p th c sĩ khoa h c h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 26 tháng năm 2011 TÓM T T LU N VĂN TH C SĨ KHOA H C * Có th tìm hi u lu n văn t i: - Trung tâm Thông tin- H c li u, Đ i h c Đà N ng Đà N ng - Năm 2011 - Thư vi n trư ng Đ i h c Sư ph m, Đ i h c Đà N ng M Đ i tư ng ph m vi nghiên c u Đ U * Đ i tư ng nghiên c u Lý ch n ñ tài Ngày nay, v i s phát tri n m nh m c a xã h i loài ngư i, b nh nguy hi m ung thư, viêm gan B gia tăng m t cách ñáng báo ñ ng Vi c tìm ki m h p ch t có ho t tính cao, phương pháp ch a b nh m i ngày tr nên c n -M u Sơn Trà Poilan -Các d n xu t amin, amit * Ph m vi nghiên c u thi t Nhi u h p ch t t nhiên có ho t tính ñã ñư c ng d ng vào -Thu hái m u th c v t Chi t tách, tinh ch axit ursolic th c t ñ s n xu t thu c phòng ch a b nh Đi u ch d n xu t -T ng h p d n xu t m i t axit ursolic tách đư c t ch t có ho t tính phân l p t ngu n th c v t v i hàm lư ng l n m t ñư ng hi u qu đ tìm ki m ch t có ho t -Th ho t tính sinh h c c a ch t t ng h p ñư c Phương pháp nghiên c u tính sinh h c cao lý thú Axit ursolic m t tritecpen t n t i ph bi n nhi u loài th c v t khác Axit ursolic d n xu t có tác d ng h Ý nghĩa khoa h c th c ti n c a đ tài Trong khn kh đ tài này, chúng tơi s d ng axit ursolic tr ch a b nh ung thư, kháng viêm, kháng khu n, kháng HIV tách ñư c t Sơn Trà Poilan ñ ti n hành nghiên c u t ng h p thành ph n m ph m đ phịng ng a ch ng l i b nh m t s d n xu t m i nh m tìm ki m ch t có ho t tính lý thú, t ung thư da t i Nh t B n có th tìm thu c phòng ch a b nh m i ñ nâng cao s c Khi nghiên c u thành ph n hóa h c Sơn Trà Poilan c a kh e, cu c s ng c a ngư i Vì v y, k t qu c a đ tài s có ý Vi t Nam, chúng tơi phân l p đư c axit ursolic v i hàm lư ng nghĩa khoa h c th c ti n cao (0.32% so v i m u khơ) Vì v y, đ t n d ng ngu n nguyên li u C u trúc c a lu n văn góp ph n tìm ki m nh ng d n xu t có ho t tính lý thú c a axit ursolic, đ tài ñ nh hư ng t ng h p m t s d n xu t amin, amit vào nhóm th hydroxy v trí C-3 carboxyl C-28 Ph n m ñ u g m 03 trang, k t lu n g m 01 trang tài li u tham kh o 09 trang N i dung c a lu n văn chia làm chương: Chương 1: T ng quan- 35 trang M c đích c a ñ tài -Nghiên c u t ng h p d n xu t amin, amit -Nghiên c u ho t tính sinh h c c a ch t t ng h p ñư c Chương 2: Th c nghi m- 09 trang Chương 3: K t qu nghiên c u th o lu n- 27 trang CHƯƠNG ph m, th o dư c loài th c v t khác táo, húng qu , b c hà, T NG QUAN o i hương, m n [43], [68] 1.1 CÁC H P CH T TRITECPEN 1.1.1 Khái ni m chung 1.1.2 M t s khung tritecpen 1.1.2.1 Tritecpen m ch th ng 1.1.2.2 Tritecpen khung dammaran 1.1.2.3 Tritecpen khung hopan 1.1.2.4 Tritecpen khung lupan 1.1.2.5 Tritecpen khung oleanan Axit Ursolic 74 1.1.2.6 Tritecpen khung friedelan 1.1.2.7 Tritecpen khung taraxeran (friedooleanan) 1.1.3 Sinh t ng h p tritecpen 1.1.4 Ho t tính sinh h c 1.1.4.1 Ho t tính ch ng ung thư kh i u 1.1.4.2 Ho t tính ch ng vi rút kháng khu n Các nghiên c u dư c lý ñã ch r ng axit ursolic th hi n ph ho t tính đa d ng như: kháng khu n, kháng n m, ch ng viêm nhi m, b o v gan, ch ng l i t bào ung thư kh i u Axit ursolic có kh ngăn ch n c ch s t o u ung thư ño n khác c a nhi u lo i ung thư vú, gan, ru t Do t n t i nhi u t nhiên t nhi u ngu n khác 1.1.4.3 Ho t tính ch ng viêm 1.1.5 M t s nghiên c u v t ng h p d n xu t c a có nhi u ho t tính lý thú nên axit ursolic ñư c s d ng làm nguyên li u ñ u ñ t ng h p nhi u d n xu t có ho t tính m i m nh tritecpen 1.2 T NG QUAN V giai AXIT URSOLIC VÀ CÁC D N XU T C A NÓ 1.2.2 M t s nghiên c u v t ng h p d n xu t c a axit ursolic 1.2.1 Axit ursolic T n t i r ng rãi t nhiên v i hàm lư ng cao, có Axit ursolic ( axit 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic, AU) (74) nhi u ho t tính thú v , nhi u d n xu t m i c a axit ursolic có ho t cịn đư c g i urson, prunol, micro-merol , m t tritecpen khơng tính lý thú đư c t ng h p S chuy n hóa nhóm ch c ñ c, ch t r n d ng b t, màu tr ng, có cơng th c phân t C30H48O3 hydroxyl có th k t tinh c n t đ i Nó t n t i nhi u th c dãy d n xu t m i có ho t tính sinh h c lý thú C-3 nhóm cacboxyl C-17 c a axit ursolic t o thành Các s n ph m t ph n ng axetyl hóa c a nhóm hydroxyl amit hóa nhóm cacboxylic c a axit ursolic đ u có ho t tính sinh h c cao so v i axit ursolic Hai h p ch t este hóa v i nhóm isopropyl C17-COOH nhóm succinyl C3-OH c a axit ursolic th hi n ho t tính đ c t bào m nh đ i v i dịng t bào ung thư n ti n li t NTUB1 ngư i v i giá tr IC50 7.97 µM 8.65 µM [62] Nh ng bi n ñ i hóa h c ngh Vi t Nam xác ñ nh tên khoa h c *Chi t m u th c v t phân l p axit ursolic M u (1800g) đư c s y khơ, nghi n nh ngâm chi t l n h n h p metanol:nư c (85:15) nhi t ñ phịng Sau c t lo i dung mơi dư i áp su t gi m, d ch nư c cịn l i đư c chi t l n lư t v i dung môi n-hexan, etyl axetat, n-butanol C t lo i dung vòng A c a axit ursolic t o h liên h p 1-en-2-cyano-3-one hay 1-en-2-trifluoro-3-one d n xu t ñ u cho th y kh c ch m nh s sinh trư ng c a dòng t bào ung thư: KU7, 253JB-V (ung thư bàng quang) Panc-1 Panc-28 (ung thư n t y) [18] Hay d n xu t m i 5β-(1-methyl2-ethyl)-10α-(3-aminopropy-l)des-A-urs-12-en-28-oic acid th hi n ho t tính đ c t bào đ i v i dòng t bào ung thư n ti n li t NRP.152 v i n ng ñ – Vi n Sinh thái Tài nguyên Sinh v t – Vi n Khoa h c Công môi dư i áp su t gi m thu ñư c c n d ch chi t tương ng v i kh i lư ng 12, 110 130g 50 g d ch chi t EtOAc ñư c ñưa lên c t silicagel, gi i h p b ng h n h p n-hexan: EtOAc v i t l EtOAc tăng t 50 đ n 100%, sau b ng h n h p EtOAc:MeOH v i t l MeOH tăng t ñ n 50% thu ñư c 20 phân ño n c ch IC50=3.3µM [22] S bi n đ i hóa Các phân đo n 1- 10 xu t hi n k t t a b t màu tr ng, chúng h c k t h p c vòng A vòng C c a axit ursolic t o h p ch t tơi l c hút, l y ph n ch t r n r a nhi u l n v i n-hexan, thu bis-enone có kh c ch s hình thành nitric oxit (NO) v i n ng ñư c 11,7g b t, ký hi u EPE1, cho m t v t b n m ng phân đ tích, m t h n h p ch a ch t ph c ch tương ng IC50=5.1 µM [55] CHƯƠNG H-NMR Vì v y đ tăng kh phân tách c a h n h p chúng tơi ti n hành ph n ng axetyl hóa EPE1 Tinh ch s n ph m axetyl hóa b ng TH C NGHI M 2.1 CHI T TÁCH AXIT URSOLIC c t silicagel v i h dung mơi n-hexan: EtOAc = 92:8 thu đư c hai ch t axit 3β-axetyl ursolic axit 3β-axetyl pomolic Th y phân s n ph m axit 3β-axetyl ursolic v i NaOH 4N thu ñ * M u th c v t ursolic (hàm lư ng 0.32% so v i m u khơ) (Hình 2.1) M u Sơn Trà Poilan t i r ng qu c gia Bì Dúp, Núi Bà thu c t nh Lâm Đ ng vào tháng năm 2009 TS Đ Ti n Hi p c 5,8 g axit 2.2 T NG H P CÁC D N XU T Lá E poilanei (1,8 kg) V TRÍ C3-OH C A AXIT URSOLIC Phơi khô, nghi n nh Ngâm chi t MeOH : H2O (85:15) to phịng C t quay chân khơng, lo i metanol D ch H2O Thêm 250ml H2O Chi t phân l p l n lư t v i n-hexan, EtOAc n-butanol D ch EtOAc D ch n-hexan D ch BuOH D ch H2O l i C t lo i dung môi C n EtOAc (50g) SKC silicagel n-Hexan: EtOAc,lư ng EtOAc 50-100% EtOAc:MeOH, lư ng MeOH - 50% thu ñư c 20 phân ño n(PD EPE1- EPE20) Phân ño n 1-10 Phân ño n 11 Phân ño n 20 L c, hút ch t r n Th c hi n ph n ng acetyl hóa h n h p ch t r n thu ñư c Th y phân axit 3β-acetyl ursolic Axit ursolic 5.8 g (0.32% so v i m u khơ) Hình 2.1: Sơ đ chi t, tách axit ursolic t Sơn Trà Poilan Hình 2.2: Sơ đ t ng h p d n xu t 89, 90 nhóm C3-OH c a axit ursolic 2.2.1 T ng h p ch t axit 3-oxo-urs-12-en-28-oic 87 100 mg CrO3 ( mmol ) hòa 10 ml H2SO4 30% ñư c nh d n vào h n h p 46 mg axit ursolic ( 0,1 mmol) hòa tan 10 ml axeton H n h p ph n ng ñư c khu y nhi t đ phịng gi 10 áp su t gi m t i khơ thu đư c c n r n màu tr ng, c n C t lo i dung môi h u dư i áp su t gi m r i chi t b ng EtOAc h u (50 ml), pha h u r a l n v i nư c c t (20 ml + 20 ml) r i c t ñư c làm s ch b ng c t silicagel h dung môi n-hexan: EtOAc= 4:1 lo i dư i áp su t gi m thu ñư c ch t r n, ñem tách c t silicagel thu ñư c 27 mg s n ph m 89 Hi u su t: 83 % v i h dung môi n-hexan: EtOAc= 7:1 thu ñư c 30 mg ch t 87 Hi u su t: 65 % H-NMR (CDCl3): δ 0.80 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.3 Hz, CH3), 0.94 (3H, J=6.3 Hz, CH3), 1.02 (3H, s, CH3), 1.07 (3H, s, H-NMR (CDCl3): δ 0.83 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.5 CH3), 1.12 (3H, s, CH3), 2.18 (3H, s, -COCH3), 2.19 (1H, d, J=11.5 Hz, CH3) 0.96 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 1.03 (3H, s, CH3), 1.06 (3H, Hz, H-18), 2.30 (1H, m, H-2a), 2.93 (1H, m, H-2b), 5.25 (1H, m, H- s, CH3), 1.09 (3H, s, CH3), 2.19 (1H, d, J=11.5 Hz, H-18), 2.36 (1H, 12) m, H-2a), 2.51 (1H, m, H-2b), 5.25 (1H, m, H-12) 2.2.4 T ng h p ch t axit 3-hydrazono-urs-12-en-28-oic 90 2.2.2 T ng h p ch t axit 3-hydroxyimino-urs-12-en-28-oic 88 H n h p c a 46 mg (0,1 mmol) ch t oxo 87 ml 30 mg oxo 87 (0,066 mmol) 0.1 ml hydrazin hòa 10 ml EtOH, h n h p ph n ng khu y nhi t ñ 600C gi D ch NH2OH.HCl 40% nư c đư c hịa tan vào ml pyridine/methanol ñư c ñ ngu i xu ng nhi t đ phịng, sau c t lo i dung mơi 60 C Sau c t lo i dung môi h u hydrazin dư i áp su t gi m, c n l i ñư c chi t ba l n b ng dư i áp su t gi m, c n l i ñư c chi t ba l n b ng EtOAc, d ch chi t EtOAc, d ch chi t ñư c g p l i r i r a v i nư c, làm khan b ng ñư c g p l i r i r a v i nư c, làm khan b ng Na2SO4, l c d ch chi t C t Na2SO4, l c d ch chi t C t lo i dung môi, c n ñư c tinh ch c t lo i dung mơi, đem tách c n thu đư c c t silicagel CH2Cl2: MeOH= silicagel h dung môi nhexan: EtOAc= 3: thu ñư c 20 mg ch t 89 98: thu ñư c 34 mg oxim 88 Hi u su t: 73 % Hi u su t: 65% v i t l 1/1 ñư c ñun gi H-NMR (CDCl3): δ 0.82 (3H, s, CH3), 0.88 (3H, d, J=7.0 Hz, H-NMR (CDCl3): δ 0.83 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.0 1 CH3), 0.96 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 1.02 (3H, s, CH3), 1.06 (3H, s, CH3), Hz, CH3), 0.93 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3), 0.98 (3H, s, CH3), 1.02 (3H, 1.07 (3H, s, CH3), 1.15 (3H, s, CH3), 2.22 (1H, d, J=11.5 Hz, H-18), s, CH3), 1.08 (3H, s, CH3), 1.14 (3H, s, CH3), 2.10 (1H, m, H-2a), 2.26 (1H, m, H-2a), 3.04 (1H, m, H-2b), 5.26 (1H, t-like, H-12) 2.20 (1H, d, J=9.2 Hz, H-18), 2.48 (1H, m, H-2b), 5.26 (1H, t-like, 2.2.3 T ng h p axit 3-acetocyimino-urs-12-en-28-oic 89 0,1 ml anhidrit axetic ñư c nh vào dung d ch c a 30 mg oxim 88 (0,064 mmol) ml pyridine h p ph n ng ñư c khu y H-12); C-NMR (CDCl3): δC 182.6 (-COOH), 161.25 (C=N-NH2), 13 138.1 (C-13), 125.64 (C-12) nhi t đ phịng H n nhi t ñ gi r i c t lo i dung môi 10 11 2.3.T NG H P CÁC D N XU T 12 V TRÍ C17-COOH C A AXIT URSOLIC d n vào h n n p này, ph n ng khu y 12 gi nhi t ñ phòng Sau ph n ng k t thúc 30 ml CH2Cl2 ñư c thêm vào, pha h u ñư c r a v i nư c (20 ml), làm khan b ng Na2SO4, c t lo i dung môi, c n 2.3.1 T ng h p ch t axit 3β-acetyl ursolic 91 thu ñư c ñem tách c t silicagel, h dung mơi n-hexan:EtOAc = Hịa tan 46mg (0,1 mmol) axit ursolic 74 h n h p ml pyridin ml anhidrit axetic H n h p ñư c khu y 6:1 thu ñư c 53 mg ch t 92 Hi u su t: 76% nhi t đ phịng 14 gi Sau ñó c t lo i pyridin anhidrit axetic dư dư i áp su t gi m t i thu ñư c c n r n màu tr ng, c n đư c hịa tan 50 ml EtOAc, r a d ch chi t h u b ng 10 ml dung d ch HCl 5%, sau ñó pha h u r a l n v i nư c Làm khan b ng Na2SO4, c t lo i dung mơi c n đư c làm s ch b ng c t silicagel v i h dung mơi n-hexan: EtOAc = 10:1 thu đu c 46 mg s n ph m 91 Hi u su t: 92% H-NMR (CDCl3): δ 0.77 (3H, s, CH3), 0.85 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 0.86 (3H, s, CH3), 0.95 (3H, s, CH3), 0.96 (3H, s, CH3), 1.07 (3H, s, CH3), 1.25 (3H, s, CH3), 2.04 (3H, s, H3CCOO), 2.18 (1H, d, J=3.5 Hz, H-18), 4.50 (1H, m, H-3), 5.23 (1H, t, J=3.5 Hz, H12) 2.3.2 T ng h p Methyl N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl]-11β amino undecanoate 92 Hòa tan 49 mg axit 3β-acetyl ursolic 91 (0,1mmol) ml CH2Cl2, oxalyl clorua (0.1) ml ñư c thêm vào H n h p đư c khu y nhi t đ phịng 48 gi Sau c t lo i CH2Cl2 oxalyl clorua dư dư i áp su t gi m t i thu ñư c c n r n khơ, c n hịa tan ml CH2Cl2 50 µl triethylamin Dung d ch c a 22 Hình 2.3: Sơ đ t ng h p d n xu t amid 93, 94 mg NH2(CH2)10COOCH3 (0,1 mmol) ml CH2Cl2 ñư c nh COOH c a axit ursolic 11 12 nhóm C17- 13 14 2.3.3 T ng h p d n xu t amit axit 93 h u cơ, làm khan b ng Na2SO4, c t lo i dung mơi, tách c t Hịa tan 35 mg ch t 92 (0,05 mmol) vào h n h p ml THF/MeOH (1:1) r i dung d ch NaOH 4N (0,5 ml) ñư c nh vào nhi t ñ phòng, ph n ng khu y ti p nhi t ñ 15 gi C t lo i silicagel, h dung mơi n-hexan:EtOAc = 3:1 thu đư c 27 mg ch t 94 Hi u su t: 45% H-NMR (CDCl3): δ 0.76 (3H, s, CH3), 0.85 (3H, d, J=6.0 dung môi h u dư i áp su t gi m, c n cịn l i đư c hòa tan Hz, CH3), 0.86 (3H, d, J= 6.8 Hz, CH3), 0.89 (3H, s, CH3), 0.93 (6H, nư c c t trung hòa b ng HCl 2N ñ n pH=7, chi t b ng CH2Cl2 (50 s, CH3), 1.07 (3H, s, CH3), 2.03 (3H, s, -OCOCH3), 2.58 (4H, br s, ml), d ch chi t ñư c r a v i nư c, làm khan b ng Na2SO4, l c d ch NH2 -CH2NH2), 2.95 (1H, m), 3.26 (1H, m) c a nhóm - chi t, c t lo i dung môi, tinh ch s n ph m b ng c t silicagel, h CONHCH2), 4.46 (1H, dd, J=5.5, 10 Hz, H-3), 5.28 (1H, br s, H-12), dung mơi n-hexan: EtOAc = 2:1 thu đư c 30 mg ch t 93 Hi u su t: 5.86 (1H, br.s, -CONH) 95% CHƯƠNG H-NMR (CDCl3): δ 0.78 (s, 3H, CH3), 0.87 (3H, d, J=6.5 K T QU VÀ TH O LU N Hz, CH3), 0.93 (3H, d, J=7.0 Hz, CH3), 0.99 (3H, s, CH3), 1.07 (3H, s, CH3), 1.26 (3H, s, CH3), 2.32 (2H, t, J= 7.5 Hz, -CH2-COOH), 3.02 (1H, br s), 3.22 (m, 1H) c a -CONH-CH2, 3.28 (m, 1H, H-3), 5.31 3.1 CHI T TÁCH AXIT URSOLIC T d ch chi t t ng v i h n h p dung môi MeOH : H2O (85 : (1H, br s, H-12), 5.93 (1H, br s, -CONH-) 15) c a Sơn Trà Poilan sau c t lo i dung môi dư i áp su t 2.3.4 T ng h p N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl)-1,7-diaminohep- gi m ñư c phân b l n lư t dung môi n-hexan, EtOAc -tane 94 chi t EtOAc b ng s c ký c t silicagel, k t tinh v i h dung Hòa tan 49 mg axit 3β-acetyl ursolic 91 (0,1mmol) ml CH2Cl2, oxalyl clorua 0,1 ml ñư c thêm vào H n h p ñư c khu y BuOH C t lo i dung mơi thu đư c c n chi t tương ng T c n nhi t đ phịng 48 gi Sau c t lo i CH2Cl2 oxalyl clorua dư dư i áp su t gi m t i thu ñư c c n r n khơ, c n hịa tan ml CH2Cl2 Dung d ch ñư c nh vào h n h p dung d ch c a 65 mg NH2(CH2 )7NH2 triethylamin ml CH2Cl2, khu y ti p (0,5 mmol) 15 mg nhi t đ phịng Sau đư c nhi t đ 12 gi , ph n ng k t thúc 30 ml CH2Cl2 ñư c thêm vào, pha h u ñư c r a v i nư c (20 ml), tách l y pha 13 mơi thích h p ph n ng axetyl hóa, ph n ng xà phịng hóa phân l p đư c 5,8 g axit ursolic (hàm lư ng 0,32% so v i m u khơ) (Hình 2.1) Các s li u ph H-NMR 13 C-NMR c a axit ursolic tách ñư c phù h p v i tài li u cơng b 3.2 NGHIÊN C U T NG H P CÁC D N XU T C A AXIT URSOLIC 3.2.1 Ph n ng nhóm C3-OH c a axit ursolic 3.2.1.1 T ng h p axit 3-acetocyimino-urs-12-en-28-oic 89 14 15 16 Ph n ng ñư c th c hi n theo sơ đ ( hình 2.2) • Ph Ch t 87, 88 H 13C-NMR cho th y phân t ch t 87 có ch a m t nhóm ketone (δC = 217.7), m t nhóm axit (δC = 184.1), m t n i đơi d ng >C=CH- [δH = 5.25 (1H, t, J = 3.5), δC = 138.0 s; 125.6 d) Trên ph H 13C-NMR cho th y phân t ch t 88 có m t nhóm axit (δC = 182.8), m t n i đơi d ng >C=CH- [δH = 5.25 (1H, t, J = 3.5), δC = 138.1 s; 125.6 d], ngồi tín hi u c a nhóm ketone khơng cịn mà xu t hi n tín hi u c a nhóm >C=N δC =167.6 S li u ph c ng hư ng t h t nhân 1H 13C-NMR c a hai ch t 87, 88 phù h p v i tài li u cơng b [7], [53] • Ch t 89 Khi so sánh s li u ph H-NMR c a ch t 89 v i ch t 88 h dung môi CDCl3, chúng tơi nh n th y tín hi u c a pic khơng có s thay đ i nhi u, s xu t hi n thêm pic c a nhóm -COCH3 ph Ph δH 2.18 H-NMR c a 89 IR cho th y ñ nh h p th 1765 cm-1 (axit carbonyl), 1692 cm-1 (>C=N) (hình 3.7) Ph kh i ESI-MS cho pic ion phân t t i m/z = 512 [M + H]+ K t h p d li u ph h ng ngo i, ph kh i ESI-MS ph H, 13C-NMR, k t lu n c u trúc c a d n xu t thu đư c cơng th c 89 Hình 3.7: Ph IR c a ch t 89 15 16 17 18 3.2.1.2 T ng h p axit 3-hydrazono-urs-12-en-28-oic 90 Khi cho oxo 87 tác d ng v i hydrazin EtOH nhi t ñ 60 C 3h thu ñư c ch t hydrazono 90 v i hi u su t 65% • Ch t 90 Ph IR c a cho ñ nh h p th ñ c trưng c a nhóm NH2 t i 3458 cm-1 nhóm carboxyl t i 1689 cm-1 Ph kh i va ch m electron ESI-MS cho pic ion phân t t i m/z = 469 [M + H]+ Trên ph 13 C-NMR c a ch t 90, xu t hi n thêm pic 161.25 ppm c a nhóm C=N-NH2 So sánh ph δ H-NMR c a ch t 90 v i oxo 87, chúng tơi nh n th y tín hi u c a H-2a H-2b c a 90 d ch chuy n v phía trư ng cao kho ng 0.1 0.5 ppm nh hư ng c a nhóm C=O 87 đư c thay th b i nhóm C=N-NH2 90 K t h p ph IR, ph kh i ph H 13C-NMR cho th y ch t thu ñư c phù h p v i c u trúc c a ch t 90 (hình 3.12) 3.2.2 Ph n ng nhóm C17-COOH c a axit ursolic 3.2.2.1 T ng h p axit N-(3β -Hydroxy-urs-12-en-28-oy)]-11-amino undecanoic 93 Ph n ng ñư c th c hi n theo sơ đ (hình 2.3) • Ch t 91 Ch t 91 cho pic ion phân t kh i ESI-MS Ph m/z = 497 [M - H]- ph H 13C-NMR cho th y 91 s n ph m 17 Hình 3.12: Ph H-NMR c a ch t 90 18 19 20 axetyl hóa c a axit ursolic, đư c th hi n qua tín hi u c a m t nhóm axit (δC = 183.97), m t nhóm metyl có g n v i oxy (δH = 4.50 m, δC = 80.97 d), m t n i đơi d ng >C=CH- [δH = 5.23 (1H, t, J = 3.5), δC = 137.99 s; 125.75 d], m t nhóm axetyl [δH = 2.04 (3H, s), δC = 171.02, 21.18] b y nhóm metyl • Ch t 93 Ph IR cho th y ñ nh h p th 3434 cm-1 (OH), 1710 cm-1 (carbonyl acid), 1630 cm-1 (amid carbonyl) Ph ESI-MS cho pic ion phân t t i m/z = 663 [M + Na]+ Trên ph H-NMR c a 93, xu t hi n tín hi u nhóm -NH amit, tín hi u c a nhóm H-3 triplet c a -CH2- g n nhóm axit singulet δ 5.93 c a δ 3.28 pic d ng 2.32 ppm, khơng th y tín hi u δ ≈ ppm c a nhóm methyl ester nhóm acetyl δ≈2 ppm Ph 13 C-NMR cho th y khơng có tín hi u c a nhóm axetyl nhóm metyleste K t h p ph h ng ngo i, ph kh i ph c ng hư ng t h t nhân H 13 C-NMR nh n th y nhóm axetyl nhóm metyl este ñ u b th y phân ñ t o thành ch t 93 (hình 3.16) 3.2.2.2 T ng h p d n xu t N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl)1,7-diaminoheptane 94 Hình 3.16: Ph IR c a ch t 93 Tương t 92, ch t 94 ñư c t ng h p b ng ph n ng c a axit 3-axetyl ursolic 91 sau đư c ho t hóa nhóm cacboxyl nh oxalyl clorua v i 1,7-diaminoheptane CH2Cl2 nhi t đ phịng • Ch t 94 Trên ph H-NMR c a ch t 94, xu t hi n nh ng pic c a nhóm -NH amit, δ 2.95 3.26 c a proton Ha, Hb c nh nhóm (hình 2.3) 19 δ 5.86 20 21 amit 22 v trí C-28, 4.26 ppm c a H-3 pic d ng br s c a NH2 2.58 ppm So sánh ph δ H-NMR c a 94 v i H-NMR c a axit 3β- 3.3 NGHIÊN C U HO T TÍNH GÂY Đ C T D N XU T T NG H P ĐƯ C axetyl ursolic[3] N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl)-1,9-diaminnon-ane [53], k t lu n c u trúc ñ ngh phù h p v i 94 BÀO CÁC K t qu nghiên c u ho t tính gây ñ c t bào c a d n xu t t ng h p đư c dịng ung thư ngư i ñư c nêu b ng dư i đây: KB : ung thư bi u mơ Hep-G2 : ung thư gan Lu : ung thư ph i MCF7 : ung thư vú Như b ng 3.2 ta th y, ch t t ng h p ñư c 89, 90, 93 ñ u có ho t tính đ i v i c dịng t bào KB, Hep-G2, Lu MCF7 Trong đó, d n xu t 89 có kh c ch m nh nhi u so v i axit ursolic c dòng t bào v i giá tr IC50 tương ng 4.32, 4.31, 5.44 3.43 µg/ml B ng 3.2: K t qu th ho t tính gây ñ c t bào c a ursolic acid d n xu t t ng h p ñư c STT Tên m u K t qu : Giá tr IC50 (µg/ml) c a m u µ th dịng t bào KB Hình 3.20: Ph 1H-NMR c a ch t 94 21 B1-ch t 89 B2-ch t 90 HepG2 Lu MCF7 4,32 4,31 5,44 3,43 23,23 46,05 123,07 55,36 22 23 Ch t tham kh o A5-ch t 93 Axit Ursolic Ellipticin 24 11,60 17,90 17,56 14,44 10,23 11,75 12,23 8,0 0,621,25 0,621,25 0,621,25 0,621,25 K T LU N Đã nghiên c u qui trình chi t tách hi u qu axít ursolic t Sơn Trà thu hái t i r ng qu c gia Bì Dúp, Núi Bà thu c t nh Lâm Đ ng v i hàm lư ng tương ñ i cao (0,32% so v i tr ng lư ng khơ) T axit ursolic tách đư c, ñã t ng h p ñư c d n xu t c a ch t 89, 90, 93 94, ch t 89, 90, 93 h p ch t m i, đ n chưa có tài li u cơng b C u trúc hóa h c ch t s ch: axit ursolic ch t t ng h p ñư c ñư c xác ñ nh b ng phương pháp ph hi n ñ i ph h ng ngo i, ph kh i, ph c ng hư ng t h t nhân K t qu th ho t tính gây đ c t bào c a ch t 89, 90 93 dòng t bào ung thư Lu, KB, Hep-G2 MCF7 cho th y c d n xu t đ u có ho t tính dịng t bào đem th , ch t 89 th hi n ho t tính cao nh t cao nhi u so v i axit ursolic 23 24 ... phân axit 3β-acetyl ursolic Axit ursolic 5.8 g (0.32% so v i m u khơ) Hình 2.1: Sơ đ chi t, tách axit ursolic t Sơn Trà Poilan Hình 2.2: Sơ đ t ng h p d n xu t 89, 90 nhóm C3-OH c a axit ursolic. .. giai AXIT URSOLIC VÀ CÁC D N XU T C A NÓ 1.2.2 M t s nghiên c u v t ng h p d n xu t c a axit ursolic 1.2.1 Axit ursolic T n t i r ng rãi t nhiên v i hàm lư ng cao, có Axit ursolic ( axit 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic,... 2.1 CHI T TÁCH AXIT URSOLIC c t silicagel v i h dung mơi n-hexan: EtOAc = 92:8 thu đư c hai ch t axit 3β-axetyl ursolic axit 3β-axetyl pomolic Th y phân s n ph m axit 3β-axetyl ursolic v i NaOH