Bài giảng sinh học phân tử

bài giảng sinh học phân tử gổm 6 chương: chương 1: các đại phân tử sinh học; chương 2: hệ gene, đặc điểm cấu trúc của hệ gene, chương 3: điều hòa biểu hiện gen, chương 4 Một số enzyme và vector tạo dòng trong sinh học phân tử; Chương 5: Phương pháp tách chiết ADN tổng số và phản ứng PCR; Chương 6: Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử, thành tựu và triển vọng

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG - LÂM BẮC GIANG HOÀ NG THI ̣ THAO - THÂN THỊ HOA BÀI GIẢNG SINH HỌC PHÂN TỬ (Lưu hành nội bộ) I HOÀ NG THI ̣ THAO - THÂN THỊ HOA BÀI GIẢNG SINH HỌC PHÂN TỬ (Tài liệu dùng cho hệ đại học) BẮC GIANG, NĂM 2017 II MỤC LỤC MỤC LỤC I DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IV LỜI NÓI ĐẦU BÀI MỞ ĐẦU Khái quát chung về sinh ho ̣c phân tử 2 Lịch sử nghiên cứu sinh học phân tử Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử 4 Mối liên quan sinh học phân tử với khoa học khác 5 Các thuật ngữ thường dùng sinh học phân tử Chương CÁC ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC VÀ LIÊN KẾT HOÁ HỌC 1.1.Các đại phân tử sinh học 1.1.1 Nucleic acid acid 1.1.2.Protein 13 1.1.3 Lipit 16 1.1.4 Polysaccharide 18 1.2 Liên kết hoá học hệ thống sinh học 18 1.2.1 Khái niệm đặc điểm chung 18 1.2.2 Một số loại liên kết hoá học yếu 19 1.2.3.Vai trò liên kết hóa học yếu 21 Chương HỆ GEN - ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA GEN 25 2.1 Hệ gen (genome) 25 2.1.1 Khái niệm hệ gen 25 2.1.2 Hệ gen prokaryote 25 2.1.2 Hệ gen eukaryote 27 2.1.3 Tính phức tạp hệ gen 28 2.2 Đặc điểm cấu trúc gen Error! Bookmark not defined 2.2.1 Khái niệm gen Error! Bookmark not defined 2.2.2 Đặc điểm cấu trúc gen prokaryote eukaryote 30 2.2.3 Phương pháp phát đoạn intron exon 32 2.3 Hoạt động gen 32 2.3.1 Cơ chế tái sửa chữa DNA 33 2.3.2 Quá trình phiên mã 41 2.3.3 Dịch mã kiểm sốt q trình dịch mã 44 Câu hỏi ôn tập 49 Chương ĐIỀU HÒA BIỂU HIỆN GEN 51 3.1 Các tượng điều hòa 51 3.1.1 Điều hòa thích nghi 51 3.1.2 Hoạt động nối tiếp gen 52 3.1.3 Biệt hóa tế bào 52 I 3.1.4 Khái quát điều hòa prokaryote eukaryote 52 3.2 Các mức độ điều hòa 53 3.3 Điều hòa biểu gen prokaryote 53 3.3.1 Cấu trúc operon 53 3.3.2 Điều hòa thối dưỡng: kiểm sốt âm, cảm ứng (negarive,inducible control) 54 3.3.3 Điều hoà biên dưỡng: âm, ức chế (negative, repressivecontrol) 55 3.4 Điều hoà biểu gen eukaryote 56 3.4.1 Mức độ chất nhiễm sắc 56 3.4.2 Mức độ phiên mã 56 3.4.3 Mức độ hậu phiên mã 57 3.4.4 Mức độ dịch mã 57 3.4.5 Mức độ hậu dịch mã 58 Chương 4: MỘT SỐ ENZYME VÀ VECTOR TẠO DÒNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ 59 4.1 Enzyme sinh học phân tử 59 4.1.1.Enzyme giới hạn(RE - restriction endonuclease) 59 4.1.2 Chức số loại enzym khác 62 4.2 Vector sinh học phân tử 64 4.2.1 Khái niệm vector 64 4.2.2 Các đặc tính yêu cầu cần thiết vector Error! Bookmark not defined Hình 4.4 Vector sinh học phân tử 65 4.2.3 Một số loại vector dùng chuyển nạp gen 65 4.2.4 Ứng dụng vector sinh học phân tử 71 Chương PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID VÀ PHẢN ỨNG PCR 73 5.1 Các phương pháp tách chiết nucleic acid acid 73 5.1.1 Phương pháp tách chiết DNA 73 5.1.2 Phương pháp tách chiết RNA toàn phần mRNA 75 5.2 Các phương pháp phân tích định tính định lương thơ nucleic acid 79 5.2.1 Định lượng DNA RNA quang phổ kế 79 5.2.2 Phương pháp điện di 80 5.3.1 Cơ sở nguyên tắc PCR 91 5.3.2.Mồi PCR, điều kiện thành phần phản ứng PCR 92 5.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR 94 5.3.4 Các phiên PCR ứng dụng thực tiễn 95 Câu hỏi ôn tập 98 Chương MỘT SỐ KỸ THUẬT TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ, THÀNH TỰU VÀ TRIỂN VỌNG 99 6.1 Phân lập gen, tách dòng phân tử biểu gen 99 6.1.1 Phân lập gen 99 6.1.2.Tách dòng phân tử 99 6.1.3 Thư viện hệ gen thư viện cDNA 100 II 6.1.4 Biểu gen 102 6.2 Những thành tựu triển vọng sinh học phân tử 104 6.2.1 Sinh học phân tử nghiên cứu 104 6.2.2 Sinh học phân tử tin sinh học (khoa học máy tính) 104 6.2.3 Sinh học phân tử y học 104 6.2.4 Sinh học phân tử nông lâm ngư nghiệp 105 6.2.5: Sinh học phân tử đời sống xã hội 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 III DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt ĐH Nghĩa tiếng Việt Đại học NST Nhiễm sắc thể PCR Nghĩa tiếng Anh Polymerase chain Rection Phản ứng nhân DNA phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Restriction Fragment tính đa hình chiều dài Length Polymorphisms phân đoạn cắt giới hạn SHPT RFLP IV LỜI NÓI ĐẦU Bài giảng sinh học phân tử viết làm tài liệu học tập cho sinh viên hệ đại học ngành: công nghệ sinh học, khoa học trồng, chăn nuôi, thú y ngành có liên quan tới sinh học Sinh học phân tử môn khoa học nghiên cứu cấu trúc chức đại phân tử sinh học, chủ yếu protein nucleic acid, trình liên quan đến protein nucleic acid tế bào sống, số kỹ thuật nghiên cứu trình tế bào ứng dụng sinh học phân tử thực tiễn Ngày nay, sinh học phân tử xem tảng quan trọng công nghệ sinh học,là môn sở bắt buộc ngành công nghệ sinh học Sinh học phân tử ngày đạt nhiều thành tựu lĩnh vực như: Nông nghiệp, thủy sản, chăn nuôi, thú y, xử lý môi trường đặc biệt y học Bài giảng “Sinh học phân tử" cung cấp kiến thức cho sinh viên với nội dung sau: - Giới thiệu sinh học phân tử, đối tượng, nhiệm vụ, số thuật ngữ thường dùng sinh học phân tử (bài mở đầu) - Giới thiệu cấu trúc, chức đại phân tử sinh học chủ yếu nucleic acid, protein, số liên kết hóa học yếu tế bào (Chương 1) - Cấu trúc gen genome tế bào prokaryote eukaryote, số trình quan trọng xảy tế bào như: Tái bản, mã giải mã (Chương 2) - Các q trình điều hòa biểu gen sinh vật prokaryote eukaryote (Chương 3) - Một số enzyme vector sử dụng sinh học phân tử (Chương 4) - Một số kỹ thuật sử dụng để nghiên cứu trình diễn tế bào (Chương 5) - Một số kỹ thuật sử dụng sinh học phân tử, thành tựu triển vọng sinh học phân tử (Chương 6) Bài giảng cập nhật kiến thức thành tựu sinh học phân tử lĩnh vực Để hồn thành giảng với kiến thức chuyên sâu lĩnh vực sinh học phân tử, chúng tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô Trung tâm công nghệ sinh học, các thầ y cô khoa Nông ho ̣c, Trường Đại học Nông Lâm Bắc Giang Lần đầu xuất bản, chắn giảng có thiếu sót, chúng tơi mong nhận phê bình, góp ý bạn đọc đồng nghiệp BÀI MỞ ĐẦU Khái quát chung về sinh ho ̣c phân tử Sự sống: tồn protein, mà khuôn đúc sống phân tử DNA (Deoxynucleic acid) gen Ở thể sống, hai tượng di truyền biến dị mặt mâu thuẫn thống sống, nhờ tiến hố thực Bản chất tượng khoa học chứng minh có liên quan chặt chẽ với hình thành, tồn thay đổi đại phân tử có thể sống DNA Vì vậy, DNA gọi phân tử sống, sợi sống, chuỗi xoắn kép sống Cơ chế tổng hợp DNA, vai trò khn mẫu DNA tổng hợp protein (enzyme) thông qua phân tử ribonucleic acid (RNA) khám phá để lý giải tượng di truyền biến dị Cơ chế tổng hợp DNA theo khuôn mẫu đảm bảo tính bảo thủ tượng di truyền qua hệ Những thay đổi dù nhỏ đoạn DNA tương ứng với gen, nhiều làm thay đổi tính trạng, sở tượng biến dị Di truyền biến dị nằm thể gen trình phát triển sinh vật Ban đầu gen giả thuyết trừu tượng ngày đo đạc xác mức phân tử, hay nhiều đoạn DNA tương ứng với tính trạng (trội lặn) sinh vật, tính trạng đơn gen đa gen Vậy sinh học phân tử môn học nghiên cứu cấu trúc, hình thành (tái bản), đặc tính DNA, tiềm tự sửa sai để bảo tồn tính nguyên vẹn nó, thay đổi DNA mối liên hệ với môi trường sống q trình tiến hố Đồng thời nghiên cứu sản phẩm sản phẩm trung gian gen, tìm quy luật vận động chúng để cải tạo khai thác chúng phục vụ lợi ích người Hay nói cách khác sinh học phân tử nghiên cứu đại phân tử sinh học chủ yếu protein nucleic acid chế phân tử liên quan đến hai đại phân tử tế bào sống, đồng thời nghiên cứu kỹ thuật phân tử ứng dụng thực tiễn *Nhiệm vụ: - Nghiên cứu DNA, gen hệ gen, sản phẩm phiên mã, hệ phiên mã, protein hệ protein - Công nghệ hố sinh học phân tử làm tảng cho cơng nghệ sinh học nói chung cơng nghệ gen, cơng nghệ enzyme, cơng nghệ protein nói riêng Lịch sử nghiên cứu sinh học phân tử Bắt đầu từ nguồn gốc loài Chalrles Darwin bước ngoặt nghiên cứu sinh học đặt sở cho nghiên cứu sinh học phân tử Từ quan sát cấu tạo địa lý hoá thạch dạng sinh vật sống khác trái đất Darwin nhận thấy: Có số hoá thạch giống với sinh vật tồn địa điểm Từ Darwin cho có mối liên hệ loài khác nhau, tất sinh vật có liên quan xuất phát từ tổ tiên chung Năm 1865 coi kỷ nguyên di truyền học, mở đầu nghiên cứu Gregor Mendel nghiên cứu di truyền đậu Hà Lan, trình bày bài: Các thí nghiệm lai thực vật Mendel đưa quy luật di truyền mà đến quy luật với tất sinh vật Thomas Morgan (1910) đề xuất học thuyết di truyền nhiễm sắc thể Morgan cho gen xếp dọc theo chiều dài nhiễm sắc thể tạo thành nhóm liên kết gen George Beadle Eward Tatum (1941) đưa giả thuyết gen, enzyme.Giả thuyết cho gen sinh enzyme protein Năm 1952 hai nhà sinh học người Mỹ Alfred Hershey Martha Chase trực tiếp chứng minh DNA vật chất truyền thơng tin di truyền thí nghiệm xâm virus Bacteriophager T2 vào vi khuẩn E Coli Năm 1953, James Watson Francis Crik khám phá chuỗi xoắn kép phân tử DNA coi phát minh lớn kỷ 20, tạo bước ngoặt quan trọng sinh học phân tử di truyền học đại Hai nhà bác học đưa suy luận cấu trúc gửi tới tạp chí Nature với lời mở đầu: “Chúng tơi xin đưa mơ hình cấu trúc deoxyribose nucleic acid (DNA) ”và kết thúc báo viết “ chúng tơi khơng nhầm cặp đơi đặc biệt cho thấy chế nhân vật chất di truyền” Dịch mã để chuyển thông tin di truyền từ DNA tổng hợp nên protein.Năm 1967 Stanley Cohen xác định gen kháng kháng sinh có tế bào vi khuẩn nằm plasmid - loại DNA dạng vòng nằm ngồi nhiễm sắc thể Cohen nghiên cứu phương pháp tinh plasmid chuyển vào tế bào vi khuẩn khác nhau, từ chủng vi khuẩn biểu tính kháng kháng sinh Herb (1970) phát số vi khuẩn có khả sử dụng enzyme để cắt DNA thực khuẩn thể xâm nhiễm vào thành đoạn nhỏ Sau enzyme gọi enzyme giới hạn enzyme cắt hạn chế Boyer phân lập enzyme giới hạn EcoR1 từ E coli Những năm nhà khoa học phát nhiều enzyme giới hạn cắt DNA vị trí đặc hiệu khác nối đầu dính enzym DNA ligase Các nhà khoa học đưa ý tưởng việc chèn đoạn DNA mong muốn vào plasmid vi khuẩn để sau sản xuất lượng lớn protein đặc biệt- chất công nghiệp công nghệ sinh học Năm 1972 công nghệ DNA tái tổ hợp đời, phân tử DNA tái tổ hợp Paul Berg tổng hợp phòng thí nghiệm cách cắt nối đoạn DNA có nguồn gốc từ virus SV40 vi khuẩn E coli Walter Giberg Alan Maxam (ĐH Harvard), Fred Stanger (ĐH Cambridge) (1975) đồng thời đưa kỹ thuật xác định xác trình tự phân tử DNA Các kỹ thuật cho phép xác định thành phần trình tự nucleotit có gen Tiếp đó, sản xuất kháng thể dơn dòng Năm 1982 insulin người humulin sản xuất theo công nghệ DNA tái tổ hợp - hormone sinh trưởng dành cho trẻ em quan quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA - Food and Drug Administration) cấp phép Kary Mullis (1985) đề xuất phương pháp nhân dòng gen điều kiện phòng thí nghiệm phản ứng PCR Phản ứng PCR sử dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để khuyếch đại đoạn DNA lên hàng tỷ vài Phương pháp PCR mở đường cho nghiên cứu ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp Năm 1990, lần liệu pháp gen sử dụng để chữa bệnh cho người Ashanti Disilva, bé gái tuổi mắc bệnh suy giảm chức enzyme adenosine deaminase (ADA), gen nằm NST 20 kiểm soát, bệnh nhân chữa liệu pháp gen William French DNAerson cộng chèn gen ADA bình thường vào tế bào T bệnh nhân chuyển lại vào hệ tuần hoàn Tiêm tế bào T bình thường vào hệ tuần hoàn tháng lần giúp phục hồi 25% chức hệ miễn dịch, giúp cho bệnh nhân có sống bình thường Ngày 18/05/1994, cà chua FlavrSavr chuyển gen giới đưa thị trường Năm 1996, trường Đại Học Stanford Affymetrix giới thiệu công nghệ - chip DNA kĩ thuật biểu gen giải trình tự DNA Cũng năm 1996, cừu Dolly- động vật có vú nhân từ tế bào biệt hoá Cừu Dolly đời chứng minh tính tồn di truyền tế bào soma động vật bậc cao, mở kỉ nguyên việc ứng dụng công nghệ tế bào phục vụ đời sống người Jame Thompson(Đại học Madison) John Gearhart (John Hopkins) (1998) hai nhóm nghiên cứu thành cơng nuôi cấy tế bào gốc người.Năm 1999 phát tế bào gốc soma (somatic stem cell), tế bào giữ ngun tính chất tế bào phơi có khả phát triển thành nhiều loại tế bào chuyên biệt quan thể Năm 2003, hai nhóm nghiên cứu: nhóm “Celera Genomic”(tư nhân) nhóm “ Human Genome Project” nghiên cứu giải trình tự gen người Bộ gen người gồm khoảng 35.000 gen thay 100.000 gen dự đốn gen người gồm 3,5 tỷ cặp base Việc hoàn thành đồ cấu trúc gen người đóng góp quan trong y học Năm 2007, nhà khoa học Nhật Bản Mỹ đồng thời công bố thành công việc biến đổi tế bào da người thành tế bào gốc, không cần đến việc sử dụng phôi thai – loại tế bào có khả biệt hố thành quan phục vụ y học Với phương pháp đại này, y học đạt nhiều thành tựu lớn tương lai Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử * Cách tiếp cận: - Nghiên cứu loại tế bào sống - Tiếp cận cấu trúc - hệ thống - Các phận tế bào - Nghiên cứu nucleic acid - Nghiên cứu cấu trúc đại phân tử protein - Quá trình liên quan đến protein nucleic acid - Chức đại phân tử - Mối liên quan đại phân tử đặc tính hay tính trạng (Chỉ thị phân tử) - Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để thao tác DNA, RNA protein theo mục tiêu nghiên cứu - Ứng dụng y học (phát sớm, ngăn ngừa, điều trị), chọn giống, công nghệ môi trường * Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử: - Phân tích DNA Tách chiết DNA tổng số Phương pháp sử dụng RE Nhân đoạn DNA PCR - Số chu kì thường 30 đến 40, số phân tử DNA nhân lên sau A chu kì N = 2(A-2) Kĩ thuật PCR phương pháp hoàn toàn việc nghiên cứu phân tích hệ gen Sử dụng kĩ thuật PCR tạo số lượng lớn đoạn DNA cần tổng hợp mà khơng phải tách nhân dòng Thực chất PCR phương pháp invitro cho phép nhân nhanh đoạn DNA mà cần khối lượng mẫu ban đầu hạn chế Các thành phần phản ứng PCR gồm: DNA khuôn, hai đoạn mồi để xác định điểm bắt đầu tổng hợp DNA, Taq polymerase, hỗn hợp bốn tiền chất deoxynucleotide, dung dịch đệm chứa số 2+ cation hoá trị 1, ion Mg dung môi (nước khử ion khử trùng) 5.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR Enzyme Taq polymeraselà enzyme chịu nhiệt, tách từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus Enzyme Taq có trọng lượng phân tử 94 kDa khơng hoạt tính nhiệt độ cao giai đoạn gây biến tính DNA Hoạt tính enzyme Taq giảm 50% sau 150 phút nhiệt 92,50C; sau 40 phút nhiệt độ 950C sau 5-6 phút nhiệt độ 970C Nếu nhiệt độ tăng lên tới 950C 20 giây để biến tính DNA kép thành sợi đơn hoạt tính enzyme Taq lại 65% sau 50 chu kì phản ứng Nồng độ enzyme Taq tối ưu cho phản ứng PCR 0,5-2,5 đơn vị, nồng độ enzyme cao làm giảm hiệu suất xúc tác phản ứng Ngoài ra, nồng 2+ độ Mg dNTP ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Hiện nay, có nhiều loại polymerase chịu nhiệt khác có chức riêng biệt hoàn thiện Tth polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả hoạt động 2+ enzyme phiên mã ngược có mặt RNA khuôn ion Mg DNA khuôn (template): DNA khuôn vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi có độ tinh cao DNA khn sợi đơn sợi đôi chuỗi DNA biết trước trình tự hai đầu để thiết kế mồi Thông thường, nồng độ DNA khuôn đưa vào phản ứng PCR khoảng 10-100ng/25ml dung dịch phản ứng Đoạn mồi (primer): nồng độ thích hợp 0,1-0,5µM, nồng độ mồi thấp mồi hết trước chu kì phản ứng, nồng độ mồi cao làm tăng sản phẩm không đặc hiệu Khi thiết kế mồi cần ý số điểm sau: - Chọn trình tự mồi có khoảng 50% G-C - Tránh G C đầu 3’của mồi nhiều làm tăng hội tạo tượng primer-dimers (2 mồi bắt cặp với nhau) - Tránh chọn vùng có trình tự tương đồng để hạn chế mồi tự gắn với Các nucleotide (dNTPs): dNTPs hỗn hợp bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, nhà khoa học sử dụng số nucleotit thay đổi gắn thêm biotin digoxygenin Nồng độ phản ứng dNTP thường dùng cho phản ứng PCR vào khoảng 20-200mM loại dNTP sử dụng cần có nồng độ tương đương để giảm thiểu tối đa tượng sai biệt kết hợp sai(misincorporatin) mã di truyền Dung dịch đệm: ảnh hưởng đến chất lượng hiệu phản ứng 94 Thành phần dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzyme polymerase sử 2+ dụng Trong dung dịch đệm quan trọng ion Mg làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) DNA mạch đôi, tạo phức chất tan với dNTPs để hình thành chất mà enzyme polymerase nhận ra, điều cần thiết cho trình liên kết 2+ dNTP Nồng độ Mg hỗn hợp phản ứng cuối biến đổi từ 0,5-2,5mM (nồng 2+ độ thay đổi cần thiết) Nồng độ lớn Mg thấp làm giảm khả tổng hợp enzyme polymerase, nồng độ cao tạo phân đoạn khơng đặc hiệu cản trở q trình tách mạch kép DNA gây lên bắt cặp khơng xác (mồi-DNA) Nhìn chung, nồng độ MgCl2 có ảnh hưởng nhiều tới hiệu tính đặc thù phản ứng Ngồi Mg2+ số chất khác dung dịch đệm AMSO, DMSO, formamide thêm vào chất phụ gia nhằm tạo sản phẩm PCR có kích thước lớn Số lượng chu kì phản ứng: Khơng vượt q 30-35 chu kỳ Vì tăng không tạo sản phẩm (cạn kiệt thành phần phản ứng, xuất sản phẩm ức chế, bắt cặp với ) 5.3.4 Các phiên PCR ứng dụng thực tiễn 5.3.4.1 Các phiên PCR * PCR lồng (Nested-PCR): Sản phẩm DNA phản ứng PCR thứ sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR thứ hai với khoảng cách (tính bp) hai mồi lần sau ngắn lần trước Cách tiến hành nhằm làm tăng tính đặc hiệu, xác cho sản phẩm cần nhân Các đoạn DNA khơng đặc hiệu tạo lần PCR thứ khó trở thành khn lần PCR thứ hai sản phẩm đặc hiệu chiếm ưu tuyệt đối * PCR phức (Multiplex PCR): Phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi phản ứng PCR để thu lúc băng đặc hiệu cho cặp Nhờ giảm thời gian thí nghiệm hạn chế việc nhiễm mẫu thao tác Ví dụ, bệnh teo Duchenne (DMD) gây thiếu hụt đoạn DNA gen tương ứng Gen dài khoảng 2000 kb gồm 70 exon (kích thước trung bình intron khoảng 35 kb) Sự đoạn chủ yếu xảy hai vị trí gen (các vị trí nhạy cảm đột biến) Sử dụng cặp mồi đặc hiệu exon phản ứng PCR phức, phát 80-90% bệnh nhân teo đoạn * PCR đảo (Inverse-PCR): Dùng phương pháp để phân lập phần nằm trước sau đoạn DNA biết Từ phân tích chuỗi nucleotide nằm trước sau gen Đầu tiên DNA genome cắt enzym giới hạn tạo đoạn DNA khác Sau đó, đoạn DNA nối lại thành dạng vòng sử dụng DNA khn cho phản ứng PCR với hai oligo xuất phát từ phần DNA biết Phương pháp tương tự phương pháp nhiễm sắc thể Nó ứng dụng để xác định promoter đoạn nucleotide làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động gen * PCR ngược (Reversed-PCR): Phản ứng nhằm nghiên cứu số lượng RNAm, làm giàu RNAm tế bào Đầu tiên RNA tổng số RNAm dùng làm khuôn để tổng hợp DNAc nhờ enzym reverse transcriptase Sau sợi đơn DNAc tổng hợp thành sợi kép nhờ Taq polymerase DNAc dạng sợi kép sử dụng làm khuôn phân đoạn DNA chứa intron tạo nhiễm DNA 95 genome với đoạn nhân lên từ RNAm (DNAc) Chỉ cần μg RNA tổng số (~106 tế bào) đủ để nhân phân tử RNAm (1-10 copies/tế bào) * PCR tái tổ hợp: áp dụng để xây dựng phân tử DNA tái tổ hợp, đưa vào bỏ thay nucleotide đoạn DNA * Nhân ngẫu nhiên đoạn DNA PCR (RAPD-PCR)(Random Amplified Polymorphic DNA-PCR): Dựa vào minisatellite microsatellite (VNTRs) biết để tìm đoạn nucleotide nằm trước sau VNTR Chúng dùng làm mồi phản ứng PCR Sản phẩm thu băng DNA có kích thước khác Phản ứng dùng mồi riêng biệt Phương pháp hay sử dụng để xây dựng phân loài 5.3.4.2 Ứng dụng PCR thực tiễn PCR có ứng dụng sau: * Dùng để nghiên cứu q trình tiến hố lồi sinh vật nhân đoạn DNA (đoạn gen) đặc trưng cho lồi sinh vật Trong q trình tiến hố trải qua bao niên đại tạo vơ vàn lồi sinh vật giới đa dạng phong phú Vậy chất trình tiến hố đứng góc độ phân tử gì? Hiện vấn đề sáng tỏ, có nghĩa lồi, chi gần mặt tiến hố có nhiều đoạn DNA giống nhau, nhiều đoạn DNA tìm thấy nhiều lồi Tuy lồi có số đoạn DNA đặc thù riêng mà loài khác khơng có, điều phân tách lồi với nhau, cơng nghệ DNA phân tử phục vụ đắc lực cho mục đích * Dùng để phát kiểu đột biến, để phát kiểu đột biến người ta điện di sản phẩm DNA nhân từ phương pháp PCR gel, đột biến hay tăng đoạn lớn, phải xác định trình tự xếp base kết luận thuộc vào kiểu đột biến đảo đoạn hay đột biến điểm * Chẩn đoán bệnh ung thu bệnh di truyền Hiện nguời ta dự đoán khoảng 1/3 số bệnh nguời nhiều có liên quan đến gen, nhiều gen đuợc định vị nhiễm sắc thể, thí dụ bệnh mù màu bệnh chảy máu không đông nằm nhiễm sắc thể giới tính X Có khoảng 600 số 3500 bệnh di truyền nằm nhiễm sắc thể thường nghiên cứu sáng tỏ chế hoá sinh bệnh lý Bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm gen lặn đột biến ảnh hưởng sai hình tới cấu trúc chuỗi -globin hemoglobin Trong bệnh giảm trí nhớ (phenylketonuria) người đột biến lặn đồng hợp tử khả tổng hợp enzym phenylalanine hydroxylase Đối với bệnh di truyền đột biến lặn có kiểu mang kiểu bị bệnh, mang bệnh có nghĩa locus có số alen bị đột biến lặn Nếu cấu trúc phân tử đoạn gen qui định tính trạng bị bệnh khơng bị bệnh, đoạn DNA có liên kết xác định dễ dàng dùng kỹ nghệ DNA để chẩn đoán sớm chữa bệnh, khuyên răn người mang gen bị bệnh không nên lấy để tránh hậu có 1/4 số đứa họ bị bệnh di truyền * Phát bệnh chăn nuôi trồng trọt Áp dụng kỹ thuật PCR sản xuất KIT chuẩn đoán bệnh đốm trắng tôm, bệnh vàng gân xanh Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học- Đại học Cần Thơ * Dùng để phát xâm nhiễm, tiềm ẩn vi khuẩn, nấm virut thể kí chủ Như biết có nhiều tác nhân gây bệnh xâm nhập vào thể ký chủ cha biểu triệu chứng ngay, thường có thời gian tiềm dục dài ngắn 96 khác nhau, chí có số kí sinh bệnh khơng biểu triệu chứng điển hình tùy đối tượng ký chủ Việc phát sớm nhiễm bệnh có ý nghĩa to lớn Bác sĩ Lê Nhật Minh, Phan Lê Thanh Hương Lê Thị Kim Tuyến sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định số vi khuẩn nguyên gây viêm màng não trẻ em Kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi chung cho phép nhân lên đoạn DNA có kích thước 996bp gen mã hóa cho yếu tố 16S ribosom 11 lồi vi khuẩn, sau sản phẩm PCR cắt enzim Hae III kết phân biệt 11 loài vi khuẩn chuẩn khác xác định xác lồi vi khuẩn nguyên gây viêm màng não trẻ em (Trích Hội nghị Khoa học – 2006 – Viện Pasteur TP.HCM) Hiện nhiều kí sinh bệnh nghiên cứu mức DNA phân tử dễ dàng dùng kĩ nghệ DNA để chẩn đoán sớm bệnh trường hợp mà phương pháp thơng thường khó chẩn đốn Trên sở biết thơng tin phân tử kí sinh chọn đoạn đặc hiệu đó, thiết kế đoạn mồi nghiên cứu, so sánh đối chiếu triệu chứng bệnh, đặc tính gây nhiễm cho giống, sai khác cấu trúc phân tử kí sinh từ nguồn khác tìm chủng virut nòi sinh lý gây bệnh Tang ctv (2000) dùng kỹ thuật PCR competitive để định lượng WSSV (White Spot Syndrome Virus) nhiễm Penaeus monodon Fabricius để phân loại giai đoạn nhiễm WSSV thành mức độ nhẹ, trung bình nặng, từ có cách xử lý thích hợp làm giảm thiệt hại nghề nuôi tôm (Tang, K F J., Lightner D V.,2000 Quantification of white spot syndrome virus DNA throught a competitive polymerase chain reaction Aquaculture, 189:11-21) * Dùng để xác định giới tính đực từ giai đoạn phát triển sớm hợp tử Bằng cách chọn đoạn DNA đặc thù biết trước nhiễm sắc thể giới tính tiến hành thiết kế đoạn mồi, lấy mẫu DNA từ hợp tử nhân PCR Nguyễn Thị Thu Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc 2003 Xác định giới tính heo kỹ thuật PCR * Dùng PCR để xác định mối liên kết tính trạng nơng sinh học phục vụ cho công tác chọn tạo giống * Dùng cảnh sát để phát tội phạm Thí dụ thủ phạm bị tình nghi giết người, trường để lại vết máu chả biết phân tích DNA hai người vết máu chứng kết luận xác thủ phạm * Dùng để nghiên cứu đa hình DNA kiểu gen khác nhau, sử dụng làm đánh dấu phân tử chọn giống Trần Thanh Mến sử dụng kỹ thụât PCR-RFLP để nghiên cứu đa dạng sinh học giống bưởi (Citrus maxima (Burm.) Merr.) Việt Nam Thực phản ứng PCR với cặp mồi ITS ITS 2; ITS ITS Các sản phẩm PCR cặp mồi cắt enzim giới hạn SmaI, EcoRI, HindIII, PstI, BamHI, KpnI Dựa vào kết thu ta xác định mối tương quan di truyền giống * Xác định tái tổ hợp chuyển nạp gen, lai xa, lai F1, kiểu gen tự bất hợp, nghiên cứu dẫy alen, kiểu bất dục đực tế bào chất, bất dục nhân * Việc kết hợp phương pháp RFLP PCR có ứng dụng rộng rãi chọn giống nhiều tính trạng nơng sinh học quan trọng Tóm tắt phương pháp sau: Từ đồ liên kết gen qui định tính trạng nơng sinh học (ví dụ chống mẫm cảm bệnh) liên kết chặt với RFLP chẳng hạn, khoảng 97 cách liên kết phải chặt từ 0,1 - 0,5 cM) Đầu tiên người ta xác định trình tự xếp nucleotide RFLP probe đó, sau chọn đoạn DNA đặc hiệu chuỗi DNA RFLP đó, tiến hành thiết kế đoạn mồi, nhân PCR tạo sản phẩm DNA điện di, thấy có sai khác kiểu gen tương ứng dừng đây, khơng lấy DNA sản phẩm PCR xử lí vài enzyme cắt hạn chế thích hợp, sau chạy điện di tìm sai khác hai kiểu gen Câu hỏi ôn tập Câu 1: Trình bày phương pháp tách chiết DNA tổng số Câu 2: Trình bày phương pháp tách chiết RNA tổng số Câu 3: Trình bày phương pháp tách chiết mRNA Câu 4: Trình bày mục đích, sở khoa học ưu, nhược điểm phương pháp định lượng DNA, RNA quang phổ kế Câu 5: Điện di gì? Trình bày nguyên lý phương pháp điện di Câu 6: Trình bày phương pháp điện di gel agrose Câu 7: Trình bày phương pháp điện di gel polyacrylamid Câu 8: PCR gì? Trình bày sở khoa học PCR Câu 9: Trình bày nguyên lý phương pháp PCR Câu 10: Phân tích ứng dụng PCR đời sống? 98 Chương MỘT SỐ KỸ THUẬT TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ, THÀNH TỰU VÀ TRIỂN VỌNG 6.1 Phân lập gen, tách dòng phân tử biểu gen 6.1.1 Phân lập gen Phân lập gen hay phân lập đoạn DNA tách gen hay đoạn phân tử DNA cần thiết từ hệ gen Có thể tiến hành theo phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế phản ứng chuỗi PCR Phân lập gen mang ý nghĩa kĩ thuật giải trình tự DNA hay tạo dòng DNA tái tổ hợp kĩ thuật chuyển gen 6.1.1.1 Phân lập gen kĩ thuật cắt hạn chế Enzyme giới hạn (restrition enzyme) có khả cắt DNA điểm đặc hiệu Với đặc tính người ta vận dụng để xác định đoạn DNA mã hoá cho tính trạng sinh vật phân lập đoạn DNA Kĩ thuật phân lập gen nhờ enzyme giới hạn gồm bước sau: (1) Tách chiết tinh DNA (2) Cắt DNA enzyme giới hạn (3) Điện di gel agarose (4) Dựa vào DNA marker xác định đoạn DNA cần phân lập (5) Biến tính DNA thành mạch đơn gel, chuyển lên màng lai phân tử Vị trí đoạn DNA giữ nguyên (6) DNA cố định màng lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ rửa để loại bỏ mẫu dò khơng bắt cặp (7) Dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị phân tử lai DNA- mẫu dò 6.1.1.2 Phân lập gen kĩ thuật PCR Phản ứng chuỗi polymerase tiến hành với primers có trình tự biết trước Cặp primer gồm primer xuôi (sens primer) ngược (antisens primer) thiết kế theo trình tự gen từ ngân hàng gen Cặp mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA Sử dụng cặp mồi chuyên biệt với DNA ++ mẫu, enzyme, dNTP, Mg , buffer thiết bị nhân DNA (máy PCR) đoạn gen từ phân tử DNA mẫu khuếch đại Phân lập gen PCR tiến hành theo bước sau: (1) Tách chiết tinh DNA (2) Thiết kế primers (3) Chọn điều kiện phản ứng PCR (4) Nhân đoạn DNA máy PCR để phân lập đoạn gen theo mục đích 6.1.2.Tách dòng phân tử 6.1.2.1 Mục đích - Tạo lượng lớn trình tự DNA xác định - Chọn lọc thư viện gen 99 6.1.2.2 Các bước kĩ thuật tách dòng Hình 6.1 Các bước tách dòng - Chọn xử lí vector - Xử lí DNA cần tạo dòng - Tạo vector tái tổ hợp - Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ - Phát dòng cần tìm thư viện gen 6.1.3 Thư viện hệ gen thư viện cDNA 6.1.3.1.Thư viện hệ gen Thư viện gen tập hợp tất trình tự DNA cấu thành gen gắn vào vector Về nguyên tắc, thư viện gen thiết lập từ tế bào sinh vật nghiên cứu Các bước thiết lập thư viện gen: (1) Tách chiết DNA (2) Cắt DNA thành đoạn có kích thước xác định RF (3) Gắn đoạn DNA vào vector để tạo vector tái tổ hợp (4) Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ (5) Tế bào chủ nuôi cấy mơi trường đặc hình thành nên dòng Ứng dụng: 100 - Giải mã thơng tin di truyền chứa gen, đặc biệt cấu trúc itron, exon gen xác định - Tạo dòng trình tự khơng mã hố nằm cạnh gen đóng vai trò định điều hồ biểu gen 6.1.3.2 Thư viện cDNA  Khái niệm: Thư viện DNA tập hợp cDNA từ tất mRNA tế bào Khác với thư viện gen, thư viện cDNA thiết lập từ tế bào xác định gen nghiên cứu biểu thành mRNA Mục đích thư viện cDNA nghiên cứu biểu gen xác định với vấn đề liên quan biểu gen, mối tương tác gen trình sống  Các bước thiết lập thư viện cDNA: (1) Chọn vector (2) Tách chiết mRNA (3) Tổng hợp cDNA nhờ enzyme mã ngược (4) Tạo vector tái tổ hợp gồm plasmid cDNA (5) Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn (6) Nuôi cấy vi khuẩn môi trường lỏng, sau chuyển sang đặc Các dòng vi khuẩn hình thành khuẩn lạc (7) Phát dòng cần tìm  Ứng dụng thư viện cDNA - Nghiên cứu q trình hoạt hố gen thời kì sinh trưởng phát triển loại mô, tốc độ hoạt động nó, sở biết vai trò tác động yếu tố môi trường, để tác động biện pháp kỹ thuật thích hợp nhằm tạo điều kiện cho gen biểu khả tối đa - Nghiên cứu cấu trúc số lượng intron exon gen lai DNA với RNA gen - Dùng vector cDNA tái tổ hợp để tổng hợp lên protein nhân tạo ống nghiệm, sản xuất enzyme dược liệu công nghiệp - Dùng cDNA gắn vào T-DNA plasmid chuyển nạp gen thông qua Agrobacterium  Thành tựu nghiên cứu thư viện cDNA - Các nhà khoa học thuộc CIAT, Colombia Nhật Bản hoàn thành việc xây dựng thư viện cDNA có chiều dài phân tử đầy đủ, điều kiện bình thường, nóng, khơ hạn, độ độc nhôm, điều kiện sau thu hoạch làm tổn hại đến sinh lý trồng - Bản chất di truyền genome khoai mì phức tạp với chu kỳ sinh trưởng dài, việc cải tiến giống khoai mì thành cơng - Áp dụng cơng nghệ sinh học để cải tiến giống khoai mì chiến lược động Kiến thức gen điều khiển chống chịu stress vô cần thiết tiếp cận với công nghệ sinh học, thí dụ chọn giống nhờ thị phân tử (MAS) chuyển nạp gen 101 - Thư viện cDNA khoai mì tiềm phục vụ cho nhà khoa học cải tiến giống khoai mì suất điều kiện canh tác bị stress phi sinh học; cung cấp chuỗi trình tự đầy đủ gen mục tiêu phát triển catalog gen genome khoai mì - Viện di truyền nơng nghiệp Việt Nam: + Cho tới năm 2007 viện thiết lập 14 thư viện cDNA tổng, thư viện chứa khoảng 30-40 nghìn clone; thu 12 thư viện cDNA chọn lọc cho tính trạng kháng đạo ôn, rầy nâu, hạn, mặn, thư viện chứa khoảng 800-1.000 clone + Tách dòng tổng cộng 184 dòng gen hoạt động mạnh điều kiện cực đoan; giải mã trình tự DNA xác định trình tự amino acid 41 dòng gen hoạt động mạnh Ngồi kết đối chiếu với Ngân hàng gen cho thấy tất 41 dòng gen có vị trí xác định clone genomic, BAC PAC, có nhiều dòng gen có độ đồng cao (trên 90%) với clone cDNA Ngân hàng Gen biết rõ chức + Đã xác định dòng gen “kháng đạo ơn”, dòng gen “kháng rầy nâu”, dòng gen “chịu hạn”, dòng gen “chịu mặn” thiết kế thành thị phân tử tiềm phục vụ công tác tạo giống lúa 6.1.4 Biểu gen 6.1.4.1 Các hệ biểu gen Trong tế bào sống, biểu gen hiểu trình sinh tổng hợp protein mối liên hệ: DNA → RNA → Protein protein sản phẩm biểu gen Trong kĩ thuật di truyền, biểu gen tượng protein gen ngoại lai tổng hợp tế bào chủ Hiện có hệ sau hay sử dụng biểu gen Escherichia coli, Bacillus subtilis, nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) tế bào động vật Tuy nhiên E coli nấm men hai hệ biểu hiện sử dụng rộng rãi nghiên cứu ứng dụng Cho đến nói vấn đề biểu gen ngoại lai mang tính thực nghiệm gen, chưa có mơ hình chung cho phép biểu tối ưu loại protein khác biểu Vì vậy, để đạt mức độ biểu cao gen ngoại lai nhiều trường hợp phải nghiên cứu thăm dò với yếu tố khác để tìm điều kiện tối ưu Các protein biểu tế bào khác nguồn gốc chia thành nhóm chính: - Nhóm thứ bao gồm peptit nhỏ có độ dài 80 amino acid Đây đoạn peptit biểu dễ dàng dạng protein dung hợp (fusion protein) thường biểu tế bào E coli - Nhóm thứ hai chuỗi polipeptit thường tiết ngồi tế bào (như enzyme, cytokin, hormon ) có kích thước khoảng 80-500 amino acid Các protein thuộc nhóm biểu hệ biểu - Nhóm thứ ba gồm protein tiết protein đóng vai trò thụ thể bề mặt tế bào có kích thước 500 amino acid - Nhómthứ tư bao gồm tất protein khơng tiết có kích thước lớn 80 amino acid 102 Hầu hết protein biểu tế bào E coli protein khơng q nhỏ lớn, kị nước, chứa nhiều gốc cystein Các protein nhỏ polipeptit thường không bền vững tế bào chủ nên muốn biểu tốt E coli cần gắn với đoàn protein khác Đoạn protein giúp cho đoàn peptit dược bền vững tế bào E coli sau tổng hợp có dùng dấu nhận biết tinh chế protein lai Sở dĩ protein có chứa nhiều gốc cystein cầu disulfit không biểu tốt E coli môi trường bên tế bào E coli có tính khử cao B subtilis nấm men hệ sử dụng rộng rãi nghiên cứu để biểu gen ngoại lai E coli hệ biểu có nhiều ưu điểm đáng ý Điển hình B subtilis có khả biểu tiết tốt protein có nguồn gốc từ Prokaryote ngồi mơi trường ni cấy nấm men lại có ưu điểm quan trọng Eukaryote Prokaryote Nấm men sinh trưởng nhanh có khả chế biến protein sau dịch mã tốt để trở thành dạng protein hoạt động mà hệ biểu gen vi khuẩn khơng có Hơn nấm men có mức độ an toàn sinh học cao, sử dụng nhiều cơng nghiệp dược liệu thực phẩm Vì vậy, nấm men ưa chuộng để biểu gen Eukaryote gen mã hoá cho protein sử dụng thực phẩm chữa bệnh Hệ biểu tế bào động vật có khả biểu tất protein nhóm tốn thời gian q trình chọn lọc, nhân dòng ni cấy dòng tế bào phức tạp nên hệ biểu thường không sử dụng rộng rãi Những đặc tính sinh học phân tử để điều chỉnh biểu gen thể (1) Đặc điểm tự nhiên trình tự promotor terminator liên quan đến dịch mã; (2) Độ mạnh yếu vị trí bám ribosome; (3) Số phiên gen tách dòng; (4) Vị trí tổng hợp protein tế bào, (5) Hiệu suất trình giải mã tế bào chủ; (6) Sự bền vững phân tử protein mã hố gen tách dòng tế bào chủ Mức độ biểu gen ngoại lai (foreign gen) phụ thuộc vào nhận biết thể vật chủ Hiện có phổ rộng thể biểu gen ngoại lai (cả Prokaryote Eukaryote) đa số sản phẩm sản xuất công nghệ DNA tái tổ hợp tổng hợp E coli 6.1.4.2 Kĩ thuật biểu gen Gen biểu gen phân lập biết trình tự Các gen phân lập phương pháp khác Sau có đoạn gen mong muốn chúng biểu hệ thích hợp theo bước xác định Bước 1: Lựa chọn hệ thích hợp để biểu gen Bước 2: Dựa vào trình tự gen, thiết kế đoạn mồi để nhân gen Tổng hợp mồi Bước 3: Chuẩn bị DNA không để nhân gen Bước 4: Nhân gen PCR từ DNA hệ gen vi khuẩn từ ngân hàng cDNA tốt nhân gen trực tiếp từ plasmid mang gen dùng để đọc trình tự gen Bước 5: Đưa gen vào vector tách dòng biến nạp vào tế bào E coli để khuếch đại dòng gen 103 Bước 6: Tách plasmid từ thể biến nạp E coli Kiểm tra gen vector tách dòng enzym hạn chế Kiểm tra gen đặc biệt chiều gen vector biểu Gen cần biểu phải nằm chiều prromotor Bước 7: Đưa gen vào vector biểu biến nạp vào tế bào E coli Bước 9: Biến nạp vector biểu có mang gen vào tế bào chủ (E coli nấm men) Bắt đầu từ bước này, thao tác để biểu gen chủng khác khác Bước 10: Kiểm tra biểu gen 6.2 Những thành tựu triển vọng sinh học phân tử 6.2.1 Sinh học phân tử nghiên cứu - Nguồn gốc sống: rRNA - Cơ chế bệnh ung thư: virus gây nên, tác động tác nhân lí hố rRNA → giải thích thuyết nội sinh rRNA → vi khuẩn cổ, vi khuẩn thất, sinh vật nhân chuẩn rRNA → RNA: Khuôn, chức enzyme, tham gia dịch mã 6.2.2 Sinh học phân tử tin sinh học (khoa học máy tính) - Sử dụng cơng nghệ thơng tin phân tích di truyền số lượng; sử dụng phần mềm Excel phân tích di truyền số lượng phân lập gen, giải trình tự gen dùng phần mềm tin sinh học để xử lý số liệu phương tiện máy tính - Truy cập, tìm kiếm liệu liên quan đến sinh học, công nghệ sinh học đề qua địa tìm kiếm mạng internet 6.2.3 Sinh học phân tử y học - Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đốn bất thường phơi thai, bệnh di truyền, bệnh ung thư Các bất thường gene gây bệnh nguy hiểm lúc mang thai Bệnh di truyền bệnh ung thư chẩn đốn xác nhờ kỹ thuật sinh học phân tử Một số kỹ thuật gồm khuếch đại gene, giải trình tự gene, phân tích đa hình, phân tích nhiễm sắc thể, Các bệnh thường gặp gồm: bệnh Thalassemia, hội chứng Down, bệnh Hemophilia, đột biến gene AZF gây muộn nam khả sản sinh tinh trùng, đột biến gene egfr kras dẫn đến kháng thuốc bệnh nhân ung thư dày – tá tràng Việc chẩn đoán giúp hạn chế trẻ sơ sinh bất thường, sàng lọc bệnh nhân ung thư kháng thuốc, tư vấn sinh hôn nhân, dự báo trước khả bị bệnh trẻ em gia đình người khơng may mang đột biến gene - Kỹ thuật sinh học phân tử giám định Pháp y: Các kỹ thuật sinh học phân tử nhà khoa học ứng dụng tốt vào giám định pháp y xâm hại tình dục, dấu vết sinh học, xác định quan hệ huyết thống (bao gồm xác định hài cốt liệt sĩ) - Thụ tinh nhân tạo: Sự muộn nhiều nguyên nhân nam lẫn nữ Nhờ can thiệp công nghệ sinh học sinh sản gồm kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm, vi tiêm tinh trùng vào trứng, nhà khoa học bác sĩ mang lại hạnh phúc cho nhiều gia đình Nhiều đứa trẻ Việt Nam đời nhờ thụ tinh nhân tạo - Sản xuất thuốc đặc trị nhiễm virus: Interferon biết đến nhân tố tự nhiên thể tế bào sản xuất để chống lại virus (ví dụ: virus viêm 104 gan C) Nhờ công nghệ protein tái tổ hợp, Interferon người sản xuất bước ứng dụng người Ngoài ra, số nhân tố kích thích tăng sinh tế bào tiền thân tạo máu (GM-CSF, M-CSF) thử nghiệm sản xuất nhờ công nghệ tái tổ hợp để ứng dụng giúp tăng sinh tế bào bạch cầu hạt sau điều trị ung thư máu - Ứng dụng tế bào gốc: Tế bào gốc tế bào có khả phân chia biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác thể Xét giai đoạn phát triển thể, tế bào gốc gồm tế bào gốc phôi (các tế bào ban đầu phơi thai hình thành) tế bào gốc trưởng thành (các tế bào giai đoạn sau sinh) Các nguồn thu nhận tế bào gốc trưởng thành gồm tủy xương, máu ngoại vi, máu cuống rốn, mỡ Trong đó, mỡ nguồn cho nhiều tế bào gốc nên ý Tế bào gốc ứng dụng để chữa bệnh máu Hàng trăm ca ghép tế bào gốc máu ngoại vị thực nước Bên cạnh đó, tế bào gốc từ mỡ sản phẩm từ tế bào gốc bước ứng dụng lĩnh vực thẫm mỹ chăm sóc sắc đẹp mang lại hiệu điều trị tích cực khách hàng đánh giá cao Mặc dù khoa học giới ứng dụng ạt tế bào gốc vào nhiều lĩnh vực, cần tiếp nhận có chọn lọc để tránh tiêu cực “thần thánh hóa’’ vai trò tế bào gốc nhiều người - Sản xuất dược liệu thực phẩm chức năng: Việt Nam nước giàu tài nguyên dược liệu Nhiều thuốc quý sử dụng chữa bệnh từ lâu đời Nhờ kết hợp với công nghệ sinh học thực vật, di truyền chọn giống, công nghệ cao canh tác, nhiều dược liệu nhân trồng đại trà Rất nhiều loại thực phẩm chức có tính điều trị phòng bệnh đời mang lại hiệu kinh tế cao góp phần chăm sóc sức khỏe người dân Đây lĩnh vực kinh tế lớn xã hội quan tâm phát triển tương lai 6.2.4 Sinh học phân tử nông lâm ngư nghiệp - Nghiên cứu đa hình (xác định quan hệ di truyền bảo tồn nguồn gen) giống vật ni trồng Nghiên cứu tính đa hình gen: PSTF1 gene, myogenin gene heart fatty axit BP gene liên quan đến khả sinh trưởng, biệt hóa mỡ cơ: Phạm Thu Thủy ctv (2003); Nguyễn Văn Anh (2005); Nguyễn Thu Thủy ctv (2005) - Sử du ̣ng DNA marker để phân tích di truyề n chăn nuôi theo nhiều mu ̣c đić h khác nhau: + Dùng dánh giá mức đô ̣ biế n đô ̣ng di truyề n mô ̣t quầ n thể vâ ̣t nuôi + Cho phép đánh giá sự khác biê ̣t di truyền giữa hai cá thể bố me ̣ Sự khác biệt càng lớn thì tibhs di hơ ̣ ̣p tử ở càng cao + Theo dõi hiệu mô ̣t chương triǹ h cho ̣n giống đinh ̣ hướng đố i với mô ̣t alen đă ̣c biê ̣t Ví du ̣: Người ta đã xác đinh ̣ đươ ̣c locus Rπ qui định chấ t lươ ̣ng thịt ở heo nằ m nhiễm sác thể 15, cách marker S0088 18 cM (Milan và cộng sự, 1995) - Tạo sinh vật chuyển gen: + Ta ̣o động vâ ̣t chuyển gen: Động vật chuyể n gen đươ ̣c sử du ̣ng vào nhiều mu ̣c đích khác như: Làm mơ hình thí nghiê ̣m cho viê ̣c nghiên cứu bê ̣nh ở người, sản xuấ t mô ̣t lươ ̣ng lớn protein, ta ̣o chủng ma ̣ng những đặc tin ́ h quí 105 Ví dụ: Vào năm 2002, nhà nghiên cứu Công ty AviGenics Khoa Di truyền trường Ðại học Georgia Athens tìm hệ thống vector ALV có giá trị việc tạo gà chuyển gen để phát triển cách nhận diện hệ sau chuyển gen cách nhanh chóng với phương pháp tốn cơng sức Họ sản xuất đàn gà mang gen chuyển (với hệ thống vetor ALV) hợp nhất, ổn định truyền lại cho hệ sau Gần 5% gà trống sinh từ phôi vi tiêm sử dụng để nhân giống Các gà trống truyền gen lại cho cháu với tần số 1% Harvey cộng (2002) thuộc trường Ðại học Georgia Athens đưa gen mã hoá enzyme beta-lactamase vi khuẩn vào phôi gà Leghorn trắng Khoảng 2% phôi sinh trưởng đến thành thục biểu enzyme beta-lactamase số tế bào Bước tiếp theo, nhà nghiên cứu cho lai gà bình thường với gà trống gà mái biểu beta-lactamase tinh trùng hay trứng chúng Thế hệ sinh mang gen beta-lactamase tất tế bào gà mái hệ đẻ trứng nhỏ có chứa beta-lactamase Các gen chuyển ổn định gà Mỗi gà mái chuyển gen đẻ trứng chứa enzyme tối thiểu 16 tháng gen chuyển hoạt động chức tối thiểu qua hệ gà mái + Tạo thực vật chuyể n gen: chuyể n gen vào thực vâ ̣t là phương pháp đưa gen la ̣ khơng phải là gen có ng̀ n gớ c thực vâ ̣t vào thể nhờ vector chuyể n gen Có hai loa ̣i vector thường hay sử du ̣ng là: virus thực vật và plasmid Ti Các gen chuyển thường liên quan đến các tính tra ̣ng : tin ́ h kháng thuố c diê ̣t cỏ, virus côn trùng; tăng hàm lươ ̣ng và chất lươ ̣ng protein sản phẩm dùng làm thực phẩ m cho người và gia súc; ta ̣o chuyể n gen có khả sản xuất những loa ̣i protein mới; ta ̣o chuyể n gen có những đă ̣c tính chiụ ̣n, chiụ mă ̣n, chiụ phèn 6.2.5: Sinh học phân tử đời sống xã hội Cơng nghệ mang tính cách mạng có tác động lớn xã hội theo nhiều hướng khác hậu kinh tế, xã hội đạo đức Hơn nữa, liên quan đến sống, nên có ảnh hưởng đến nhiều vấn đề nhạy cảm xã hội Ngay dự án gen người, 5% giành cho nghiên cứu hậu kinh tế xã hội mà trọng tâm xoay hai vấn đề đạo lí sinh học an toàn sinh học Năm 1983, UNESCO thành lập ủy ban quốc tế đạo lý sinh học IBC Tổ chức nêu dự án, thu thập ý kiến để đến luật lệ đạo đức sinh học Ủy ban tuyên bố “Bộ gen người tài sản chung loài người” Nó đối tượng cần bảo vệ khơng có quyền sử dụng vào mục đích thương mại để phân biệt người với người đặc tính di truyền Ủy ban kêu gọi quốc gia cần theo dõi nghiên cứu có biện pháp bảo vệ người Bên cạnh đóng góp to lớn cho nhân loại, phát triển di truyền học đồng thời gây khơng điều đáng lo ngại Thậm chí, có nơi giới có nhà khoa học đề nghị trưng cầu dân ý để cấm nghiên cứu di truyền học Đa số cho caams, phải có luật lệ để bảo vệ gen, phù hợp với đạo lý Kĩ thuật di truyền từ lúc đời làm nhiều nhà khoa học lo sợ Trải qua trình phát triển 25 năm, nhiều vấn đền tâm lí – xã hội đặt ra: tâm lí – xã hội thí nghiệm phi đạo lí - Các vấn đề tâm lí – xã hội: biết rõ gen người có nhiề vấn đề nảy sinh (chẩn đốn sớm có ảnh hưởng xã hội biết số người khỏe mạnh có mang gen bệnh Việc biết trước có ảnh hưởng đến tâm lí nhân tương lai người không họ Khi biết trước 106 gen người xã hội đối xử với họ Bảo hiểm nhân thọ sao? Trên thực tế Mĩ xảy tranh cãi vấn đề Ngồi hàng loạt vấn đề khác GMO, - Các vấn đề phi đạo lí: Vấn đề mà lồi người lo sợ số thí nghiệm tạo sản phẩm khơng hồn chỉnh mà xã hội phải chịu hậu vài cá nhân lợi dụng kĩ thuật di truyền tạo dạng sinh vật phi đạo lí Điều cần sớm ngăn chặn Tuy nhiên, nhiều tranh cãi chưa có trí - Liệu pháp gen: : Là đưa hay nhiều gen chức vào tế bào người với mục tiêu điều chỉnh rối loạn khiếm khuyết di truyền - Tạo dòng người: qua thời gian dài, nghiên cứu sinh học sinh sản động vật có vú chuyển gen lồi động vật có vú phát triển, khả tạo dòng người thực xảy vào thời điểm tương lai Nhận thức trở thành thực năm 1997, cừu Dolly đời tiếp sau phát tế bào gốc soma vào năm 1999 Hiện nay, không qúa cường điệu để tin tạo dòng người Vào thời điểm nay, nghiêm cấm luật pháp phải có đủ hiệu lực ngăn chặn việc tạo dòng người Tuy nhiên, câu hỏi việc liệu dòng hóa người có đáng để thực khơng phải hiair đáp * An toàn sinh học: Là bảo vệ người, xã hội môi trường khỏi tác động có hại nguy hiểm sức khỏe người hệ hôm mai sau độc tố hay sản phẩm cơng nghệ gen Nó đòi hỏi phải đánh giá mức độ an toàn tất biện pháp sử dụng tác nhân chẩn đoán trị liệu; dị ghép quan; tác nhân bảo vệ trồng vật nuôi, Câu hỏi ôn tập Câu 1: Phân lập gen gì? Trình bày phương pháp phân lập gen Câu 2: Phương pháp tách dòng dùng để làm gi? Trình bày bước phương pháp tách dòng Câu 3: Ngân hàng hệ gen gì? Trình bày bước thiết lập ứng dụng ngân hàng hệ gen Câu 4: Ngân hàng cDNA gì? Trình bày bước thiết lập ứng dụng ngân hàng cDNA Câu 5: Trình bày đặc điểm trình biểu gen Câu 6: Phân tích thành tựu ứng dụng sinh học phân tử y học Câu 7: Phân tích thành tựu ứng dụng sinh học phân tử nông – lâm – ngư nghiệp Câu 6: Phân tích thành tựu ứng dụng sinh học phân tử đời sống xã hội 107 TÀ I LIỆU THAM KHẢO Hồ Huỳnh Thuỳ Dương 2003.Sinh học phân tử, NXB Giáo dục Võ Thị Thương Lan.2009 Giáo trình Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, NXB Giáo dục Võ Thị Thương Lan.2007 Một số vấn đề sinh học phân tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Chu Hoàng Mậu.2005 Cơ sở phương pháp Sinh học phân tử, NXB Đại học Sư phạm Chu Hồng Mậu.2008 Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, NXB Đại học Thái Nguyên Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi.2001 Sinh học phân tử, NXB Đại học Huế Phạm Hồng Sơn.2009 Giáo trình kỹ thuật sinh học phân tử, NXB đại học Huế Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and Watson JD 2002 Molecular Biology of the Cell 3rd ed Garland Publishing, Inc New York, USA Lewin B 2000 Gene VII Oxford University Press, Oxford, UK 10 Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL and Darnell J 2004 Molecular Cell Biology 5th ed WH Freeman and Company, New York, USA 11 Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M and Loscik R 2004, Molecular Biology of the Gene The Benjamin Cummings/Cold Spring Habor Laboratory Press, San Francisco, CA, USA 12 Weaver RF 2003 Molecular Biology 2nd ed McGraw-Hill Company Inc New York, USA 108 ... quan sinh học phân tử với khoa học khác - Liên quan với chuyên ngành sinh học - Khoa học chọn giống - Y học - Công nghệ mơi trường - Khoa học máy tính mạng internet - Khoa học vật liệu * Sinh học... phân tử * Cách tiếp cận: - Nghiên cứu loại tế bào sống - Tiếp cận cấu trúc - hệ thống - Các phận tế bào - Nghiên cứu nucleic acid - Nghiên cứu cấu trúc đại phân tử protein - Quá trình liên quan... điều hồ - Cap (mũ chụp): nhóm 7-methyl guanine gắn vào base mRNA thông qua liên kết 5 -5 ’ triphosphate - Codon: Bộ ba nucleotide mã hoá cho amino acid hay dấu hiệu bắt đầu chấm dứt dịch mã - Translation