Bài giảng sinh học phân tử

bài giảng sinh học phân tử gổm 6 chương: chương 1: các đại phân tử sinh học; chương 2: hệ gene, đặc điểm cấu trúc của hệ gene, chương 3: điều hòa biểu hiện gen, chương 4 Một số enzyme và vector tạo dòng trong sinh học phân tử; Chương 5: Phương pháp tách chiết ADN tổng số và phản ứng PCR; Chương 6: Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử, thành tựu và triển vọng

I

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG - LÂM BẮC GIANG

BÀI GIẢNG

SINH HỌC PHÂN TỬ

(Lưu hành nội bộ)

I

MU ̣C LỤC

MỤC LỤC I DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT IV

LỜI NÓI ĐẦU 1

BÀI MỞ ĐẦU 2

1 Khái quát chung về sinh ho ̣c phân tử 2

2 Lịch sử nghiên cứu sinh học phân tử 2

3 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử 4

4 Mối liên quan giữa sinh học phân tử với các khoa học khác 5

5 Các thuật ngữ thường dùng trong sinh học phân tử 5

Chương 1 CÁC ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC VÀ LIÊN KẾT HOÁ HỌC 8

1.1.Các đại phân tử sinh học 8

1.1.1 Nucleic acid acid 8

1.1.2.Protein 13

1.1.3 Lipit 16

1.1.4 Polysaccharide 18

1.2 Liên kết hoá học trong hệ thống sinh học 18

1.2.1 Khái niệm và đặc điểm chung 18

1.2.2 Một số loại liên kết hoá học yếu 19

1.2.3.Vai trò của liên kết hóa học yếu cơ bản 21

Chương 2 HỆ GEN - ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA GEN 25

2.1 Hệ gen (genome) 25

2.1.1 Khái niệm hệ gen 25

2.1.2 Hệ gen ở prokaryote 25

2.1.2 Hệ gen ở eukaryote 27

2.1.3 Tính phức tạp của hệ gen 28

2.2 Đặc điểm cấu trúc của gen Error! Bookmark not defined 2.2.1 Khái niệm về gen Error! Bookmark not defined 2.2.2 Đặc điểm cấu trúc của gen ở prokaryote và ở eukaryote 30

2.2.3 Phương pháp phát hiện các đoạn intron và exon 32

2.3 Hoạt động của gen 32

2.3.1 Cơ chế tái bản và sửa chữa DNA 33

2.3.2 Quá trình phiên mã 41

2.3.3 Dịch mã và kiểm soát quá trình dịch mã 44

Câu hỏi ôn tập 49

Chương 3 ĐIỀU HÒA BIỂU HIỆN GEN 51

3.1 Các hiện tượng điều hòa 51

3.1.1 Điều hòa thích nghi 51

3.1.2 Hoạt động nối tiếp của các gen 52

3.1.3 Biệt hóa tế bào 52

II

3.1.4 Khái quát về điều hòa ở prokaryote và eukaryote 52

3.2 Các mức độ điều hòa 53

3.3 Điều hòa biểu hiện gen ở prokaryote 53

3.3.1 Cấu trúc của operon 53

3.3.2 Điều hòa thoái dưỡng: kiểm soát âm, cảm ứng (negarive,inducible control) 54

3.3.3 Điều hoà biên dưỡng: âm, ức chế (negative, repressivecontrol) 55

3.4 Điều hoà biểu hiện gen ở eukaryote 56

3.4.1 Mức độ chất nhiễm sắc 56

3.4.2 Mức độ phiên mã 56

3.4.3 Mức độ hậu phiên mã 57

3.4.4 Mức độ dịch mã 57

3.4.5 Mức độ hậu dịch mã 58

Chương 4: MỘT SỐ ENZYME VÀ VECTOR TẠO DÒNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ 59

4.1 Enzyme trong sinh học phân tử 59

4.1.1.Enzyme giới hạn(RE - restriction endonuclease) 59

4.1.2 Chức năng của một số loại enzym khác 62

4.2 Vector trong sinh học phân tử 64

4.2.1 Khái niệm về vector 64

4.2.2 Các đặc tính và yêu cầu cần thiết của vector Error! Bookmark not defined Hình 4.4 Vector trong sinh học phân tử 65

4.2.3 Một số loại vector dùng trong chuyển nạp gen 65

4.2.4 Ứng dụng của vector trong sinh học phân tử 71

Chương 5 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID VÀ PHẢN ỨNG PCR 73

5.1 Các phương pháp tách chiết nucleic acid acid 73

5.1.1 Phương pháp tách chiết DNA 73

5.1.2 Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA 75

5.2 Các phương pháp phân tích định tính và định lương thô nucleic acid 79

5.2.1 Định lượng DNA và RNA bằng quang phổ kế 79

5.2.2 Phương pháp điện di 80

5.3.1 Cơ sở và nguyên tắc của PCR 91

5.3.2.Mồi của PCR, điều kiện và thành phần phản ứng PCR 92

5.3.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR 94

5.3.4 Các phiên bản của PCR và ứng dụng trong thực tiễn 95

Câu hỏi ôn tập 98

Chương 6 MỘT SỐ KỸ THUẬT TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ, THÀNH TỰU VÀ TRIỂN VỌNG 99

6.1 Phân lập gen, tách dòng phân tử và biểu hiện gen 99

6.1.1 Phân lập gen 99

6.1.2.Tách dòng phân tử 99

6.1.3 Thư viện hệ gen và thư viện cDNA 100

III

6.1.4 Biểu hiện gen 102

6.2 Những thành tựu và triển vọng của sinh học phân tử 104

6.2.1 Sinh học phân tử và nghiên cứu cơ bản 104

6.2.2 Sinh học phân tử và tin sinh học (khoa học máy tính) 104

6.2.3 Sinh học phân tử và y học 104

6.2.4 Sinh học phân tử trong nông lâm ngư nghiệp 105

6.2.5: Sinh học phân tử trong đời sống xã hội 106

TÀI LIỆU THAM KHẢO 108

1

LỜI NÓI ĐẦU

Bài giảng sinh học phân tử được viết làm tài liệu học tập cho sinh viên hệ đại học các ngành: công nghệ sinh học, khoa học cây trồng, chăn nuôi, thú y và các ngành có liên quan tới sinh học Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu về cấu trúc

và chức năng của đại phân tử sinh học, chủ yếu là protein và nucleic acid, các quá trình

cơ bản liên quan đến protein và nucleic acid trong tế bào sống, một số kỹ thuật nghiên cứu những quá trình cơ bản trong tế bào và những ứng dụng của sinh học phân tử trong thực tiễn

Ngày nay, sinh học phân tử được xem là nền tảng quan trọng của công nghệ sinh học,là môn cơ sở bắt buộc của ngành công nghệ sinh học Sinh học phân tử ngày càng đạt nhiều thành tựu trong các lĩnh vực như: Nông nghiệp, thủy sản, chăn nuôi, thú y,

xử lý môi trường và đặc biệt là trong y học

Bài giảng “Sinh học phân tử" cung cấp những kiến thức cơ bản cho sinh viên

với các nội dung chính sau:

- Giới thiệu về sinh học phân tử, đối tượng, nhiệm vụ, một số thuật ngữ thường dùng trong sinh học phân tử (bài mở đầu)

- Giới thiệu cấu trúc, chức năng của các đại phân tử sinh học chủ yếu là nucleic acid, protein, một số liên kết hóa học yếu trong tế bào (Chương 1)

- Cấu trúc của gen và genome trong tế bào prokaryote và eukaryote, một số quá trình quan trọng xảy ra trong tế bào như: Tái bản, sao mã và giải mã (Chương 2)

- Các quá trình điều hòa biểu hiện gen ở sinh vật prokaryote và eukaryote (Chương 3)

- Một số enzyme và vector sử dụng trong sinh học phân tử (Chương 4)

- Một số kỹ thuật cơ bản được sử dụng để nghiên cứu các quá trình diễn ra trong

Lần đầu xuất bản, chắc chắn bài giảng còn có những thiếu sót, chúng tôi rất mong nhận được sự phê bình, góp ý của bạn đọc và đồng nghiệp

2

BÀI MỞ ĐẦU

1 Kha ́ i quát chung về sinh ho ̣c phân tử

Sự sống: là sự tồn tại của protein, mà cái khuôn đúc ra sự sống đó là phân tử DNA (Deoxynucleic acid) hay là các gen trong nó

Ở mọi cơ thể sống, hai hiện tượng di truyền và biến dị là 2 mặt mâu thuẫn nhưng thống nhất của sự sống, nhờ đó sự tiến hoá có thể thực hiện Bản chất của 2 hiện tượng này đã được khoa học chứng minh là có liên quan chặt chẽ với sự hình thành, tồn tại

và thay đổi của một đại phân tử có trong mọi cơ thể sống đó là DNA Vì vậy, DNA được gọi là phân tử của sự sống, sợi chỉ của sự sống, chuỗi xoắn kép của sự sống

Cơ chế tổng hợp DNA, vai trò khuôn mẫu của DNA trong tổng hợp protein (enzyme) thông qua các phân tử ribonucleic acid (RNA) dần dần đã được khám phá để

lý giải hiện tượng di truyền và biến dị

Cơ chế tổng hợp DNA theo khuôn mẫu đảm bảo tính bảo thủ của hiện tượng di truyền qua các thế hệ Những thay đổi dù rất nhỏ trên đoạn DNA tương ứng với một gen, ít nhiều cũng làm thay đổi tính trạng, cơ sở của hiện tượng biến dị

Di truyền và biến dị nằm trong sự thể hiện của gen trong quá trình phát triển của sinh vật Ban đầu gen là một giả thuyết trừu tượng nhưng ngày nay đã được đo đạc chính xác ở mức phân tử, là một hay nhiều đoạn DNA tương ứng với một tính trạng (trội hoặc lặn) của sinh vật, tính trạng có thể đơn gen hoặc đa gen

Vậy sinh học phân tử là môn học nghiên cứu cấu trúc, sự hình thành (tái bản),

đặc tính của DNA, tiềm năng tự sửa sai để bảo toàn tính nguyên vẹn của nó, và cả sự thay đổi của DNA trong mối liên hệ với môi trường sống trong quá trình tiến hoá Đồng thời nghiên cứu những sản phẩm và sản phẩm trung gian của gen, tìm ra quy luật vận động của chúng để cải tạo và khai thác chúng phục vụ lợi ích của con người

Hay nói cách khác sinh học phân tử nghiên cứu các đại phân tử sinh học chủ yếu là

protein và nucleic acid và các cơ chế phân tử liên quan đến hai đại phân tử này trong tế bào sống, đồng thời nghiên cứu các kỹ thuật phân tử ứng dụng trong thực tiễn

2 Lịch sử nghiên cứu sinh học phân tử

Bắt đầu từ nguồn gốc các loài của Chalrles Darwin là bước ngoặt nghiên cứu về sinh học đặt cơ sở cho nghiên cứu sinh học phân tử Từ quan sát về cấu tạo địa lý hoá thạch và dạng sinh vật sống khác nhau trên trái đất Darwin nhận thấy: Có một số hoá thạch rất giống với những sinh vật đang còn tồn tại trên cùng địa điểm Từ đó Darwin cho rằng có một mối liên hệ nào đó giữa các loài khác nhau, tất cả các sinh vật có liên quan đều xuất phát từ một tổ tiên chung

Năm 1865 được coi là kỷ nguyên của di truyền học, mở đầu là nghiên cứu của

Gregor Mendel nghiên cứu di truyền của đậu Hà Lan, được trình bày trong bài: Các thí

nghiệm lai ở thực vật Mendel đã đưa ra quy luật cơ bản về di truyền mà đến nay các

quy luật đó vẫn đúng với tất cả các sinh vật

3

Thomas Morgan (1910) đề xuất học thuyết di truyền nhiễm sắc thể Morgan cho rằng các gen được sắp xếp dọc theo chiều dài nhiễm sắc thể tạo thành các nhóm liên kết gen

George Beadle và Eward Tatum (1941) đưa ra giả thuyết một gen, một enzyme.Giả thuyết cho rằng một gen sẽ sinh ra một enzyme hoặc một protein

Năm 1952 hai nhà sinh học người Mỹ Alfred Hershey và Martha Chase đã trực tiếp chứng minh được DNA là vật chất truyền thông tin di truyền bằng thí nghiệm về

sự xâm virus Bacteriophager T2 vào vi khuẩn E Coli

Năm 1953, James Watson và Francis Crik đã khám phá ra chuỗi xoắn kép phân tử DNA được coi là một trong các phát minh lớn nhất của thế kỷ 20, tạo bước ngoặt quan trọng trong sinh học phân tử và di truyền học hiện đại Hai nhà bác học đã đưa ra suy luận về cấu trúc gửi tới tạp chí Nature với lời mở đầu: “Chúng tôi xin đưa ra một mô hình cấu trúc mới của deoxyribose nucleic acid (DNA) ”và kết thúc bài báo viết “ nếu chúng tôi không nhầm thì những cặp đôi đặc biệt này sẽ cho chúng ta thấy cơ chế nhân bản của vật chất di truyền” Dịch mã để chuyển thông tin di truyền từ DNA tổng hợp nên các protein.Năm 1967 Stanley Cohen đã xác định các gen kháng kháng sinh có trong tế bào vi khuẩn nằm ở plasmid - một loại DNA dạng vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể Cohen nghiên cứu phương pháp tinh sạch các plasmid và chuyển vào các tế bào vi khuẩn khác nhau, từ đó các chủng vi khuẩn đều biểu hiện tính kháng kháng sinh

Herb (1970) đã phát hiện một số vi khuẩn có khả năng sử dụng enzyme của mình

để cắt DNA của thực khuẩn thể xâm nhiễm vào chính nó thành các đoạn nhỏ Sau này các enzyme đó được gọi là enzyme giới hạn hoặc enzyme cắt hạn chế Boyer đã phân

lập được enzyme giới hạn EcoR1 từ E coli Những năm tiếp theo các nhà khoa học đã

phát hiện được nhiều enzyme giới hạn cắt DNA ở các vị trí đặc hiệu khác nhau và nối các đầu dính bằng enzym DNA ligase Các nhà khoa học đã đưa ra ý tưởng về việc chèn đoạn DNA mong muốn vào các plasmid của vi khuẩn để sau đó có thể sản xuất ra một lượng lớn protein đặc biệt- chất cơ bản của công nghiệp công nghệ sinh học Năm 1972 công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời, phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được Paul Berg tổng hợp trong phòng thí nghiệm bằng cách cắt và nối 2 đoạn DNA có

nguồn gốc từ virus SV40 và vi khuẩn E coli

Walter Giberg và Alan Maxam (ĐH Harvard), Fred Stanger (ĐH Cambridge) (1975) đồng thời đưa ra 2 kỹ thuật xác định chính xác trình tự phân tử DNA Các kỹ thuật này cho phép xác định được thành phần cũng như trình tự các nucleotit có trong gen Tiếp đó, cũng sản xuất ra kháng thể dơn dòng

Năm 1982 insulin người và humulin được sản xuất theo công nghệ DNA tái tổ hợp đầu tiên - hormone sinh trưởng dành cho trẻ em được cơ quan quản lý Thực phẩm

và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA - Food and Drug Administration) cấp phép Kary Mullis (1985) đề xuất phương pháp nhân dòng gen trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng phản ứng PCR Phản ứng PCR sử dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để khuyếch đại một đoạn DNA bất kỳ lên hàng tỷ bản sao trong vài giờ Phương pháp PCR đã mở đường cho các nghiên cứu và ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp Năm

1990, lần đầu tiên liệu pháp gen được sử dụng để chữa bệnh cho người Ashanti Disilva, bé gái 4 tuổi mắc bệnh suy giảm chức năng enzyme adenosine deaminase (ADA), do gen nằm trên NST 20 kiểm soát, là bệnh nhân đầu tiên được chữa bằng liệu pháp gen William French DNAerson và cộng sự đã chèn gen ADA bình thường vào

tế bào T của bệnh nhân và chuyển lại vào hệ tuần hoàn Tiêm các tế bào T bình thường

4

vào hệ tuần hoàn 2 tháng 1 lần đã giúp phục hồi 25% chức năng của hệ miễn dịch, giúp cho bệnh nhân có được cuộc sống bình thường

Ngày 18/05/1994, cà chua FlavrSavr chuyển gen đầu tiên trên thế giới được đưa

ra trên thị trường Năm 1996, trường Đại Học Stanford và Affymetrix đã giới thiệu công nghệ mới - con chip DNA trong kĩ thuật biểu hiện gen và giải trình tự DNA Cũng trong năm 1996, cừu Dolly- động vật có vú đầu tiên được nhân bản từ tế bào biệt hoá Cừu Dolly ra đời chứng minh tính toàn năng di truyền của tế bào soma ở động vật bậc cao, mở ra kỉ nguyên mới trong việc ứng dụng công nghệ tế bào phục vụ đời sống con người

Jame Thompson(Đại học Madison) và John Gearhart (John Hopkins) (1998) hai nhóm nghiên cứu thành công trong nuôi cấy tế bào gốc ở người.Năm 1999 đã phát hiện về tế bào gốc soma (somatic stem cell), các tế bào giữ nguyên tính chất như tế bào phôi có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào chuyên biệt của các cơ quan trong

cơ thể

Năm 2003, hai nhóm nghiên cứu: nhóm “Celera Genomic”(tư nhân) và nhóm “ Human Genome Project” đã nghiên cứu giải trình tự bộ gen ở người Bộ gen ở người gồm khoảng 35.000 gen thay vì 100.000 gen như dự đoán và bộ gen ở người gồm 3,5

tỷ cặp base Việc hoàn thành bản đồ cấu trúc bộ gen ở người sẽ là một đóng góp quan trong trong y học Năm 2007, các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ cùng đồng thời công

bố thành công trong việc biến đổi tế bào da người thành tế bào gốc, không cần đến việc sử dụng phôi thai – loại tế bào có khả năng biệt hoá thành các cơ quan phục vụ trong y học Với phương pháp hiện đại này, y học có thể đạt được nhiều thành tựu lớn hơn trong tương lai

3 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử

* Cách tiếp cận:

- Nghiên cứu các loại tế bào sống

- Tiếp cận cấu trúc - hệ thống

- Các bộ phận của tế bào

- Nghiên cứu nucleic acid

- Nghiên cứu cấu trúc của các đại phân tử protein

- Quá trình liên quan đến protein và nucleic acid

- Chức năng của các đại phân tử

- Mối liên quan giữa đại phân tử và đặc tính hay tính trạng (Chỉ thị phân tử)

- Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để thao tác trên DNA, RNA và protein theo mục tiêu nghiên cứu

- Ứng dụng trong y học (phát hiện sớm, ngăn ngừa, và điều trị), trong chọn giống, công nghệ môi trường

* Phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử:

5

Điện di DNA

Phân lập gen, Tách dòng phân tử và xác định trình tự DNA

Biểu hiện gen

4 Mối liên quan giữa sinh học phân tử với các khoa học khác

- Liên quan với các chuyên ngành sinh học

- Khoa học chọn giống

- Y học

- Công nghệ môi trường

- Khoa học máy tính và mạng internet

- Khoa học vật liệu

* Sinh học phân tử với các chuyên ngành sinh học

- Tế bào học

- Sinh lý học: Cơ sở SHPT của các đặc tính chống chịu, các quá trình sinh lý khác

- Hoá sinh: Gen mã hoá các enzyme của chuỗi phản ứng hoá sinh

- Di truyền học: Cơ sở phân tử của các hiên tượng, quá trình, quy luật di truyền

- Phân loại học phân tử

5 Các thuật ngữ thường dùng trong sinh học phân tử

- Bắt cặp bổ sung: Sự kết hợp giữa 2 mạch đơn DNA có trình tự bổ sung tạo

thành một mạch kép

- Transformation (biến nạp): Sự thu nhận những đặc điểm di truyền mới ở vi

khuẩn nhờ việc chuyển vào vi khuẩn các phân tử DNA

- Denaturation (biến tính): DNA và RNA chuyển từ dạng mạch kép sang mạch

đơn Tác nhân có thể là nhiệt hoặc hoá chất Đối với protein thì sự biến tính là chuyển

từ cấu hình hoạt động sang dạng bất hoạt

- Bp (base pair - cặp base): Là liên kết A-T hoặc G-C trên một phân tử DNA

mạch kép, là đơn vị đo chiều dài của phân tử DNA

- Indution (cảm ứng): Liên quan đến khả năng tổng hợp một số enzyme ở vi

khuẩn chỉ khi có mặt cơ chất của enzyme này trong môi trường Trong quá trình điều hoà biểu hiện gen thì cảm ứng có nghĩa là khơi mào quá trình phiên mã do tương tác giữa một chất cảm ứng (inducer) với protein điều hoà

6

- Cap (mũ chụp): nhóm 7-methyl guanine gắn vào base đầu tiên của mọi mRNA

thông qua một liên kết 5’-5’ triphosphate

- Codon: Bộ ba nucleotide mã hoá cho một amino acid hay một dấu hiệu bắt đầu

hoặc chấm dứt dịch mã

- Translation (dịch mã): Sự tổng hợp protein từ khuôn mRNA

- DNApolymerase: enzyme tổng hợp nên mạch DNA mới từ một mạch khuôn ,

có thể tham gia vào quá trình sao chép hay sửa sai

- DNase: Enzyme phân huỷ liên kết của phân tử DNA

- Enhancer: Một trình tự CIS, có khả năng đẩy mạnh việc sử dụng một số

promoter ở eukaryote, có thể hoạt động theo cả hai hướng ở bất kì vị trí nào so với Promote

- Restriction enzyme - RE (enzyme hạn chế): enzyme nhận biết một trình tự

nucleotide ngắn, chuyên biệt và cắt mạch kép DNA

- Exon: một phần của một gen gián đoạn (chỉ có ở sinh vật eukaryote), có mặt

trong phân tử RNA trưởng thành

- Exonnuclease: enzyme cắt rời từng nucleotide một từ đầu cuối của một mạch

polynucleotide chúng có thể đặc hiệu cho đầu 5’ hay 3’ của phân tử DNA hoặc RNA

- Splipcing (ghép nối): Quá trình loại bỏ các intron và nối các exon ở RNA trong

quá trình trưởng thành sau phiên mã

- Histon: Các protein kiềm liên kết chặt chẽ với DNA tạo thành các nucleoxom,

cấu trúc được bảo tồn trong quá trình tiến hoá ở eukaryote

- Renaturation (hồi tính): Sự tái bắt cặp của 2 mạch đơn DNA bổ sung cho một

phân tử DNA mạch kép

- Intron: là một đoạn DNA được phiên mã nhưng bị loại bỏ trong quá trình

trưởng thành của RNA, không có mặt ở phân tử RNA trưởng thành

- IS (insertion sequence - trình tự chèn): Trình tự gắn xen kẽ có kích thước nhỏ ở

vi khuẩn, tương đương với transposon, chỉ mang gen cần gắn xen cho chính nó

- Hairpin (kẹp tóc): Một vùng xoắn kẹp được hình thành từ sự bắt cặp bổ sung

giữa 2 trình tự bổ sung nằm kề nhau trên một phân tử DNA hay RNA

- Ligase enzyme nối liền 2 phân tử nucleic acid trong một quá trình tiêu hao

năng lượng Ví dụ DNA ligase nối liền 2 phân tử DNA thông qua một liên kết phosphodiester

- Gentic code (mã di truyền): Sự tương ứng giữa các bộ ba nucleotit trên DNA

(hay RNA) và các amino acid trên mạch polypeptit

- Primer (mồi): Một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với một mạch khuôn DNA

và có mang một đầu 3’OH tự do, giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới

- Monomer: Phân tử đơn vị nhỏ có thể liên kết với các đơn vị phân tử giống nó

để hình thành những phân tử lớn hơn (polymer)

- Chromosome (nhiễm sắc thể): Đơn vị của một bộ gen, chứa nhiều gen Mỗi

nhiễm sắc thể là một phân tử DNA mạch kép dài liên kết với các protein histon, chỉ được nhìn thấy rõ vào giai đoạn phân chia của tế bào

7

- Operator: Một đoạn DNA ngắn trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn, nơi gắn các

protein điều hoà có chức năng kiểm soát sự phiên mã của các gen lân cận

- Operon: Một đơn vị biểu hiện và điều hoà gen ở vi khuẩn bao gồm các gen cấu

trúc nằm cạnh nhau và các nhân tố điều hoà, các gen cấu trúc này cùng chịu tác động điều hoà như nhau

- Phage: Viết tắt của bacterio phage (thực khuẩn thể) là các vi rút xâm nhiễm vi

khuẩn

- Transcription (Phiên mã): sự tổng hợp RNA từ khuôn DNA

- Rever transcription (phiên mã ngược): sự tổng hợp DNA từ mạch khuôn RNA

nhờ enzyme phiên mã ngược

- Plasmide: Một DNA dạng vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể và có khả năng tự sao

- Purine: một trong hai nhóm hợp chất dạng vòng (có 2 vòng) được tìm thấy ở

nucleic acid (gồm Adenine và Guanine)

- Pyrimidine: một trong hai nhóm hợp chất dạng vòng(có 1 vòng)được tìm thấy

ở nucleic acid (gồm Cytosine, Thyrnine và Uracine)

- RNApolymerase: enzyme tổng hợp RNA từ khuôn DNA

- RNase (Ribonucleazse): enzyme phân giải RNA

- Replicon: đơn vị sao chép của bộ gen có chứa một điểm khởi đầu sao chép

- Thuỷ giải: phản ứng trong đó một liên kết cộng hoá trị bị phá vàkhi có sự kết

hợp một phân tử nước

- Tm (melting temperature - nhiệt độ nóng chảy): là nhiệt độ ở đó có một nửa số

phân tử của trình tự DNA bị biến tính

- Transposon: một trình tự DNA có khả năng tự gắn xen vào một vị trí mới trên

bộ gen

- Crossing over (trao đổi chéo): sự trao đổi vật chất giữa các nhiễm sắc thể xảy

ra trong quá trình phân bào giảm nhiễm là tác nhân của sự tái tổ hợp di truyền

- Maturation ( trưởng thành): quá trình trong đó các RNA vừa được phiên mã

chịu một số biến đổi hoá học để trở thành RNA hoạt động sẵn sàng làm khuôn cho việc tổng hợp protein

8

Chương 1 CÁC ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC VÀ LIÊN KẾT HOÁ HỌC

Để có thể hiểu được các hiện tượng, các quy luật của sự sống và để áp dụng được các kiến thức của sinh học phân tử vào các ngành CNSH, trước hết cần tìm hiểu về cấu trúc, chức năng của các đại phân tử sinh học, về mối tương quan giữa chúng trong hoạt động sống ở tất cả các cấp độ tổ chức: từ phân tử, tế bào đến cơ thể và quần thể DNA

và protein là những đại phân tử sinh học quan trọng bậc nhất đối với cơ thể sống DNA

là vật chất mang thông tin di truyền và thông qua protein quyết định toàn bộ đặc tính cấu trúc và chức năng của cơ thể sống

1.1.Các đại phân tử sinh học

1.1.1 Nucleic acid acid

Nucleic acid, vật chất mang thông tin di truyền của các hê ̣ thống sống, là mô ̣t polymer hình thành từ các monomer là nucleotide

Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhó m phosphate, đường pentose (đường 5 carbon) và mô ̣t base nitơ Các base nitơ thuộc hai nhóm: các purine gồm adenine (A)

và guanine (G), các pyrimidine gồm thymine (T), cytosine (C) và uracil (U) Các nucleotide được nối với nhau bằng liên kết phosphodiester ta ̣o thành chuỗi dài

Hình 1.1 Cấu trúc các loại base nitơ

Hình 1.2 Cấu tạo của đường ribose và deoxyribose

* Cấu trúc bậc 1 của DNA (chuỗi polynucleotide)

Cấu trúc bậc 1 của DNA là một chuỗi polynucleotide được tạo thành do các nucleotide liên kết với nhau

Mỗi nucleotide được cấu tạo từ ba thành

phần: Một gốc phosphate(PO 4-3), một phân tử

đường 5 cacbon deoxyribose, một trong bốn

loại base nitơ A, T, G, C Đường deoxyribose

là loại đường pentose chứa 5 nguyên tử các

bon được đánh số từ C1’ đến C5’ Trong phân

tử DNA bị mất một nguyên tử oxy ở cacbon số

2 nên gọi là deoxyribose Base nitơ là dẫn xuất

của purine (base to có 2 vòng thơm) gồm 2

dạng đồng phân là Adenine (A) và Guanine

(G), dẫn xuất của pyrimidin (base nhỏ có 1

vòng thơm) là Thymine (T) và Cytosine (C)

hoặc Uracine (U) trong RNA Tính chất của

một nucleotide do tính chất hoá học của base

nitơ quy định nên tên gọi của các nuclotit

thường được đặt tên theo tên gọi của base nitơ

Nhóm phosphate có thể gồm 1, 2, 3 gốc

phosphate gắn vào vị trí cacbon số 5 của

đường, theo thứ tự lần lượt là α, β và γ

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc bậc 1 của DNA

Các nucleotide liên kết với nhau bằng liên kết photphodieste, giữa nhóm OH ở cacbon thứ 3 của base nitơ trước với gốc phosphate ở vị trí cacbon số 5 của nucleotide

kế tiếp Như vậy chính các nhóm OH ở C’ 3 và C5’ của các pentose tham gia vào liên kết phosphodieste Hai đầu của chuỗi polynucleotide có cấu tạo xác định đầu 5’ chứa một hoặc 3 gốc phosphate không hoạt động, còn đầu kia 3’ (cácbon số 3) chứa nhóm

OH Điều này chứng tỏ DNA có hướng hoá học 5’ → 3’ hoặc 3’ → 5’ nhưng hướng tổng hợp của tất cả các polymerase đều theo chiều 5’ →3' Chuỗi polynucleotide thể hiện số lượng, thành phần và trình tự sắp xếp của các nucleotide, là cách thức để mã hoá thông tin di truyền của cơ thể sinh vật

* Cấu trúc bậc 2:

10

Sợi xoắn kép DNA được xem là cấu trúc bậc 2 của DNA Watsơn và Crick đã

phát minh ra cấu trúc của DNA là một đại phân tử gồm 2 chuỗi polynucleotide đơn xoắn vào nhau (dsDNA) theo hướng ngược chiều nhau, theo chiều từ trái sang phải (xoắn phải- dạng B), mỗi vòng xoắn gồm 10 cặp base, chiều cao vòng xoắn là 34A0, vậy chiều cao của một nucleotide là 3,4 A0, đường kính của vòng xoắn là 20A0

Hình 1.5: Sơ đồ cấu trúc bậc 2 của DNA theo Watsơn và Crick

Các base của hai mạch nằm quay vào trong và liên kết với nhau bằng liên kết hydro theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với T bằng 2 liên kết hyđro, G liên kết với C bằng 3 liên kết hyđro Nhóm phosphate và gốc đường trong mỗi mạch xoay ra ngoài đảm bảo tính ổn định cho phân tử Sợi có đầu 3’-OH đối xứng với đầu 5’-P của sợi còn lại Mỗi mạch đơn (ssDNA) mang trình tự các base khác nhau cho nên mỗi mạch mang thông tin di truyền khác so với mạch kia

Hai mạch của sợi xoắn kép DNA có hai chiều ngược nhau: Một sợi có chiều 5’, một sợi có chiều ngược lại là 5’-3’

3’-* Cấu trúc bậc 3: Sợi DNA kết hợp với histon tạo nên cấu trúc sợi solanoid, cấu

trúc sợi lại được gấp cuộn phức tạp ở dạng siêu xoắn nhiều cấp, sợi nucleosom là cấu trúc bậc 3 của DNA

* Cấu trúc bậc 4: Dạng nhiễm sắc thể là cấu trúc bậc 4 của DNA

DNA là vật chất di truyền ở cấp độ phân tử DNA có chức năng lưu trữ, bảo quản

và truyền đạt thông tin di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác

Các DNA ở eukaryote có đă ̣c điểm khác với DNA prokaryote Toàn bô ̣ phân tử DNA prokaryote đều mang thông tin mã hóa cho các protein trong khi đó DNA của eukaryote bao gồ m những trình tự mã hóa (các exon) xen kẽ với những trình tự không

mã hóa (intron) Các trình tự mã hóa ở eukaryote nằm trong một khối lớn DNA mà cho đến nay vẫn chưa rõ tác du ̣ng được gọi là “DNA rác” (junk DNA) Tùy theo mức đô ̣ hiện diê ̣n của chúng trong nhân, các trình tự DNA được chia làm ba loa ̣i:

- Các trình tự lă ̣p la ̣i nhiều lần: Là những trình tự DNA ngắn (10-200 kb), không

mã hóa, thường tâ ̣p trung ở những vùng chuyên biê ̣t trên nhiễm sắc thể như ở vùng tâm

đô ̣ng (trình tự CEN - Centrmere) hay ở đầu các nhiễm sắc thể (trình tự TEL- Telomere) Chứ c năng của các trình tự này chưa rõ, có thể chúng tham gia vào quá

11

trình di chuyển DNA trên thoi vô sắc (trình tự CEN) hoă ̣c vào quá trình sao chép toàn

bộ phần DNA nằm ở đầu mút nhiễm sắc thể (trình tự TEL) Ví du ̣: ở đô ̣ng vâ ̣t có vú

các trình tự này chiếm 10-15% genome (hệ gen)

- Các trình tự có số lần lă ̣p la ̣i trung bình: Đa da ̣ng hơn và có kích thước lớn hơn

(100 - 1.000 kb) các trình tự lă ̣p la ̣i nhiều lần Các trình tự này phân bố trên toàn bô ̣ genome Chú ng có thể là những trình tự không mã hóa mà cũng có thể là những trình

tự mã hóa cho rRNA, tRNA và 5S RNA Ví dụ: ở genome người các trình tự này chiếm 25 - 40 %

- Các trình tự duy nhất: Là các gen mã hóa cho các protein, có trình tự đă ̣c trưng cho từ ng gen

Đặc tính của DNA: DNA có nhiều đặc tính liên quan đến các hoạt động sống của

tế bào trong đó 2 tính chất quan trọng liên quan đến công nghệ DNA tái tổ hợp (lai DNA và PCR) là sự biến tính và hồi tính

+ Sự biến tính: Là khả năng sợi kép DNA trong điều kiện nhiệt độ cao gần điểm

sôi hoặc PH < 3 và pH > 10 có thể tách rời thành 2 sợi đơn

+ Sự hồi tính: Khi điều kiện môi trường quay trở lại trạng thái ban đầu từ từ thì 2 sợi đơn DNA lại có thể ghép bổ sung thành sợi kép ban đầu

Sự tồn tại của dạng DNA mạch kép hay mạch đơn được xác định bằng mật độ quang học: OD (Opitical density) Phương pháp này dựa vào nguyên tắc các base purin

và pirimidin của DNA hấp thụ tia cực tím tối đa ở bước sóng ở 260nm Giá trị mật độ quang giảm đi khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, do các base nitơ nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song nên che lấp lẫn nhau, khiến chúng hấp thụ ánh sáng ít hơn so với DNA mạch đơn Ví dụ: OD260 = 50μg/ml dung dịch DNA sợi đôi khi OD260 giảm xuống 40μg/ml dung dịch DNA sợi đơn

c Các dạng cấu trúc của DNA:

DNA cấu trúc dạng B xoắn phải, mỗi vòng xoắn có 10 cặp base nitơ, đường kính vòng xoắn là 2,0nm

Cấu trúc phân tử DNA dạng A xoắn phải, mỗi vòng xoắn có 11 cặp base nitơ, đường kính vòng xoắn 2,6nm

Phân tử DNA dạng Z xoắn trái, gọi là dạng zigzag, mỗi vòng xoắn có 12 cặp base nitơ, đường kính vòng xoắn là 1,8nm Một số loại virus có DNA mạch đơn

Hình 1.6 Các dạng cấu trúc của DNA

1.1.1.2 Ribonucleic acid (RNA):

Phân tử RNA có cấu tạo tương tự DNA ngoại trừ ba điểm khác biê ̣t sau:

- Phân tử RNA là chuỗi đơn

- Đường pentose củ a phân tử RNA là ribose thay vì deoxyribose

- Thymine (T), một trong bốn loại base hình thành nên phân tử DNA, được thay thế bằng uracil (U) trong phân tử RNA

Cấu trúc và chức năng củ a RNA có sự biến đổi rõ rê ̣t Về cơ bản RNA chỉ là chất mang thông tin di truyền ở virus, sau đó người ta chứng minh rằng nó không những đóng vai trò cơ bản ở viê ̣c chuyển thông tin di truyền mà còn có vai trò cấu trúc khi ta ̣o nên phứ c hê ̣ RNA-protein

Theo một lý thuyết tiến hóa mà đa ̣i diê ̣n là Eigen, RNA là chất mang thông tin di truyền, thành viên trung gian củ a sự biểu hiê ̣n gen, thành phần cấu ta ̣o và là chất xúc tác Trong tế bào có ba loại RNA chính, có các chức năng khác nhau:

Ca ́ c RNA thông tin (mRNA): mRNA là bản sao của những trình tự nhất đi ̣nh

trên phân tử DNA, có vai trò trung tâm là chuyển thông tin mã hóa trên phân tử DNA đến bô ̣ máy giải mã thành phân tử protein tương ứng Các mRNA có cấu trúc đa da ̣ng,

kích thước nhỏ hơn so với DNA vì chỉ chứa thông tin mã hóa cho mô ̣t hoă ̣c vài protein

và chỉ chiếm khoảng 2-5% tổng số RNA trong tế bào

Quá trình chuyển thông tin được thể hiê ̣n như sau:

Ở E coli, kích thước trung bình của một phân tử mRNA khoảng 1,2 kb

RNA vâ ̣n chuyển (tRNA): tRNA làm nhiệm vu ̣ vâ ̣n chuyển các amino acid hoa ̣t

hóa đến ribosome để tổng hợp protein từ các mRNA tương ứng Mỗi một amino acid

có ít nhất một loại tRNA tương ứng Các tRNA có cấu trúc da ̣ng cỏ ba lá Cấu trúc này được ổn định nhờ các liên kết bổ sung có mặt trong phân tử tRNA Hai vị trí không

có liên kết bổ sung đóng vai trò đă ̣c biê ̣t quan tro ̣ng đối với chức năng của tRNA:Trình

tự anti codon gồm ba nucleotide; Trình tự CCA, có khả năng liên kết cô ̣ng hóa tri ̣ với

một amino acid đă ̣c trưng.RNA ribosome (rRNA): rRNA là thành phần cơ bản của

ribosome, đóng vai trò xúc tác trong tổng hợp protein

Tùy theo hệ số lắng rRNA được chia thành nhiều loa ̣i: ở eukaryote có 28S; 18S; 5,8S và 5S rRNA; còn các rRNA ở E coli có ba loa ̣i: 23S, 16S và 5S

rRNA chiếm nhiều nhất trong ba loa ̣i RNA (80% tổng số RNA tế bào), tiếp đến

là tRNA khoảng 16% và mRNA chỉ khoảng 2%

Ngoài ra, tế bào sinh vâ ̣t eukaryote còn chứa những phân tử RNA kích thước nhỏ của nhân (small nuclear, snRNA) chiếm khoảng <1% tham gia vào ghép nối các exon

13

Ribosome của prokaryote

Tế bào được nghiên cứu về ribosome nhiều nhất là E coli Ribosome (70S) của

E coli gồm hai tiểu đơn vị: tiểu đơn vị nhỏ (30S) và tiểu đơn vị lớn (50S) Căn cứ vào

hệ số lắng, người ta phân biệt ba loại rRNA: 23S rRNA, 16S rRNA và 5S rRNA

- Tiểu đơn vị 30S chứa: 1 phân tử 16S rRNA (có 1540 rNu) và 21 ribosomal protein khác nhau

- Tiểu đơn vị 50S chứa: 1 phân tử 5S rRNA (có 120 rNu), 1 phân tử 23S rRNA (có 2900 nu) và 34 ribosomal protein

Hai tiểu đơn vị nhỏ và lớn khi kết hợp với nhau sẽ tạo ra một rãnh ở chỗ tiếp giáp của chúng để cho mRNA đi qua

Ribosome của eukaryote

Ribosome của eukaryote (80S) lớn hơn ribosome của prokaryote cũng bao gồm hai tiểu đơn vị: tiểu đơn vị nhỏ (40S) và tiểu đơn vị lớn (60S)

- Tiểu đơn vị 40S chứa: 1 phân tử 18S rRNA (có 1900 rNu) và 33 ribosomal protein

- Tiểu đơn vị 60S chứa: 3 phân tử rRNA (5S; 5,8S và 28S) và 49 ribosomal protein

Tóm lại, tất cả RNA trong tế bào đều được tổng hợp nhờ enzyme RNA polymerase Enzyme này đòi hỏi những thành phần sau đây:

- Một khuôn mẫu, thườ ng là DNA sợi đôi

- Tiền chất hoa ̣t hóa: Bốn loại ribonucleoside triphosphate: ATP, GTP, UTP và CTP

Sinh tổng hợp RNA giống DNA ở mô ̣t số điểm, thứ nhất hướng tổng hợp là 5’ đến 3’, thứ hai là cơ chế kéo dài giống nhau: nhóm 3’-OH ở đầu cuối của chuỗi tổng hợp là vi ̣ trí gắn kết của nucleoside triphosphate tiếp theo Thứ ba, sự tổng hợp xảy ra

do thủy phân pyrophosphate

Tuy nhiên, khác với DNA là RNA không đòi hỏi mồi (primer) Ngoài ra, RNA polymerase không có hoa ̣t tính nuclease để sửa chữa khi các nucleotide bị gắn nhầm

Cả ba loa ̣i RNA trong tế bào được tổng hợp trong E coli nhờ một loa ̣i RNA

polymerase Ở động vâ ̣t có vú, các RNA khác nhau được tổng hợp bằng các loa ̣i RNA polymerase khác nhau

1.1.2.2 Cấu trúc

- Cấu trúc bậc 1- Chuỗi polypeptid: là trình tự sắp xếp của các amino acid (aa)

trong chuỗi polypeptid Amino acid là đơn vị cơ sở cấu thành protein Tất cả 20 amino

Có 4 nhóm aminoacid Đặc tính của các nhóm này khác nhau bởi gốc R của chúng, điều này không những có ý nghĩa đối với tính chất hoá học mà cả cấu trúc của protein

- Nhóm protein kiềm: Là những protein chủ yếu hình thành từ những amino acid

có tính kiềm

- Nhóm protein acid: Là những protein chứa nhiều amino acid có tính acid, trong phần gốc có một gốc carboxyl

- Nhóm protein kỵ nước : Khi chiều dài gốc R tăng lên sẽ hình thành các đặc tính

kỵ nước.Có các amino acid trong phần gốc có một gốc amin và một gốc carboxyl

- Nhóm protein trung tính phân cực: Có nhánh bên thường mang gốc OH Khi mới được tổng hợp protein có cấu trúc bậc 1

- Cấu trúc bậc 2: Là sự uốn các phần của từng chuỗi thành cấu trúc đều đặn trong

không gian theo kiểu dạng xoắn α hay phiến gấp nếp β Ngoài liên kết peptid, dạng xoắn α hoặc gấp khúc β còn có liên kết hydro giữa các aa nằm gần nhau Là dạng trung gian chuyển tiếp để phân tử protein hình thành nên cấu trúc bậc ba phức tạp hơn

- Cấu trúc bậc 3:

Chuỗi polypeptit ở dạng xoắn hoặc gấp khúc có thể cuộn lại theo nhiều cách tạo

nên hình thù không gian được gọi là cấu trúc bậc 3 của protein (cấu trúc 3D) Cấu trúc

bậc 3 được tạo nên bởi các liên kết yếu như liên kết ion, liên kết kỵ nước, liên kết disunphit (giữa 2amino acid có chứa sunfua) Khi có tác động của hoá chất độc hoặc

pH làm thay đổi hình thù 3D (gọi là sự biến tính của protein) làm huỷ hoại chức năng của protein từ đó dẫn tới trạng thái sinh lý bệnh Ví dụ như bệnh bò điên, do protein bị biến đổi từ 3 chuỗi α, 2 chuỗi β thành 2 chuỗi α và 4 chuỗi β nên chúng bị biến đổi cấu hình là nguyên nhân gây nên bệnh bò điên xốp não Phân tử protêin bị biến đổi là do

sự đột biến trong gen mã hoá cho prion gây ra

- Cấu trúc bậc 4: Được hình thành do 2 hoặc nhiều chuỗi polypeptid thành

phần tương tác với nhau tạo nên

Tuỳ theo cấu trúc bậc 3 và bậc 4 mà người ta phân biệt 2 loại : Protein cầu (thực hiện nhiều chức năng sinh lý quan trọng như anbumin, enzyme, histon…) và protein sợi (thường tạo nên các mô nâng đỡ như collagen, keratin…)

Các protein khi kết hợp với các phân tử hữu cơ khác sẽ tạo nên các phân tử phức tạp hơn như: nucleoprotein, glycoprotein, lypoprotein, chromoprotein…

15

Trong tế bào protein luôn được tổng hợp, phân giải và thay thế Nhiều dạng protein có cấu trúc bậc 1 tương tự nhau nhưng có hình thù khác nhau, cùng thực hiện một chức năng sinh lý được gọi là các protein đồng dạng (izoenzym) Các protein đồng

dạng thường được tập hợp lại thành từng họ protein Tập hợp tất cả protein trong cơ thể gọi là hệ protein Mỗi protein có thể là một hoặc nhiều chuỗi polypeptid Mỗi

chuỗi polypeptid thường được mã hoá bởi 1 gen (chính xác hơn là 1 mRNA) Các họ protein được mã hoá bởi 1 họ gen Cũng vì sự tương đồng và đa hình về protein qua các quá trình tiến hoá mà các nhà phân loại học phân tử có thể sử dụng phương pháp

so sánh tính đa hình của protein để xác lập cây phát sinh chủng loại của các loài

Trên cơ sở hiểu biết cấu trúc bậc 1 và cấu trúc không gian của protein trong tế bào cùng cơ chế hoạt động của protein mà có thể thiết kế protein (bằng công nghệ tin sinh học) và chế xuất các sản phẩm protein khác nhau để sử dụng trong nhiều ngành: công nghệ thực phẩm, công nghệ dược phẩm, công nghệ tẩy giặt …

Hình 1.7 Các mức độ tổ chức của phân tử Protein

1.1.2.3 Một số chức năng quan trọng của protein

Protein là vật liệu xây dựng nên tế bào và mô Protein là cơ sở phân tử cho tất cả các hoạt động sống trong cơ thể, protein có chức năng đa dạng trong cơ thể sống (Bảng1.1)

Cấu trúc bậc 3

Cấu trúc bậc 4

Cấu trúc bậc 2 Cấu trúc bậc 1

Cấu trúc bậc 3

Cấu trúc bậc 4

16

Bảng 1.1 Chức năng của protein trong cơ thể

1 Protein enzyme

Xúc tác sinh học làm tăng nhanh và chọn lọc các phản ứng sinh hoá

Các enzyme thuỷ phân trong dạ dày phân giải thức ăn, các enzyme trong phôi hạt phân giải nội nhũ

điều khiển biểu hiện gen: Như đình chỉ sự phiên mã

Insulin điều khiển nồng độ đường glucoza trong máu

Repressor đình chỉ sự phiên mã mRNA

3 Protein vận

chuyển

Vận chuyển các chất sinh học từ vị trí này sang vị trí khác

- Hemoglobin chứa trong hồng cầu động vật có xương sống có vai trò vận chuyển oxy từ phổi qua dòng máu đến các tế bào

- Các protein đặc hiệu vận chuyển glucose, amino acid qua màng tế bào

4 Protein dự trữ Dự trữ nguồn amino

acido acid

- Ovalbumin lòng trắng trứng là nguồn cung cấp axitamin cho phôi phát triển

- Trong hạt của cây có chứa nguồn protein dự trữ cần thiết cho hạt nảy mầm

5 Protein vận

động và co rút

Làm cho tế bào có khả năng vận động, phân chia và co cơ

Actin, miozin có vai trò vận động cơ Tubulin có vai trò vận động lông roi, là thành phần cơ bản của thoi vô sắc

6 Protein cấu trúc Tạo độ chắc và bảo vệ

tế bào và mô

Keratin là protein không tan cấu tạo nên tóc, sừng và móng; Keratin là thành phần

cơ bản của kén tằm Collagen là protein hình sợi có trong xương Một số protein cấu tạo nên màng sinh học

7 Protein bảo vệ

Bảo vệ cơ thể, chống bệnh tật, tạo phản ứng miễn dịch

Phytochelain giải độc do kim loại nặng Interferon chống virut, kháng thể chống

vi sinh vật gây bệnh Thrombin làm đông máu…

8 Protein ngoại

lai

Glue protein là loại protein có ở họ keo cho phép nó gắn chặt lên bề mặt (Ngọc trai)

1.1.3 Lipit

Mặc dù không mang hoạt tính sinh học cao như protein nhưng lipid cũng đóng một vai trò đặc biệt trong hệ thống sống Chúng là nhân tố chính tạo nên các màng sinh học mà nếu thiếu thì mọi hoạt động của protein sẽ không thể phối hợp nhịp nhàng

17

Đơn vị cấu trúc của lipid là các acid béo Mỗi acid béo được cấu tạo từ một mạch carbohydrate (gồm các nguyên tử C và H) gắn với một nhóm carboxyl có tính acid Các acid béo khác nhau bởi độ dài của chúng, bởi số lượng và vị trí các liên kết đôi Các acid béo không có liên kết đôi được gọi là các acid béo bão hòa, các acid béo không bão hòa có ít nhất một liên kết đôi

Hình 1.8 Sơ đồ biểu diễn của kháng thể và kháng nguyên

Các lipid màng được hình thành từ một chuỗi dài acid béo nối với những nhóm

có đặc tính ưa nước cao và được gọi là những phân tử lưỡng cực vì một đầu tương tác với nước, còn đầu kia thì kỵ nước

Hình 1.9 Sơ đồ biểu diễn một đoạn cắt của màng sinh học

Nguồn dự trữ tinh bột ở các tế bào động vật là glycogen, trong khi đó ở thực vật

là tinh bột Một polymer khác của glucose là cellulose thì tạo nên thành tế bào thực vật

và là hợp chất hữu cơ hiện diện nhiều nhất trong sinh quyển

Chúng ta vừa điểm qua riêng rẽ từng thành phần cấu tạo tế bào chính Trong thực

tế, hoạt động của chúng phối hợp mật thiết với nhau Các nucleic acid trong tế bào thường kết hợp chặt chẽ với các protein tạo thành nucleoprotein DNA của tế bào eukaryote thì được bọc bởi những protein đặc hiệu là các histone Màng tế bào cũng không phải chỉ có phospholipid, chính các protein gắn trong màng đã tạo ra những đặc trưng riêng của màng sinh học Một điểm cần lưu ý là nếu như cấu trúc và các tính chất hóa lý của nucleic acid, lipid và polysaccharide tương đối đồng nhất thì các protein lại hết sức đa dạng cả về cấu trúc và chức năng Một phân tử protein thường bao gồm nhiều vùng mang những đặc tính khác nhau: vùng ưa nước hay kỵ nước, vùng gắn một đường, vùng có hoạt tính xúc tác, vùng liên kết với nucleic acid hay với một protein khác Từ mỗi chức năng của tế bào,từ sự hình thành vật chất mang thông tin di truyền, truyền đạt thông tin di truyền, sự chuyển hóa năng lượng, sự liên lạc giữa các tế bào đều có sự tham gia của các protein Điều kỳ diệu của sự sống là toàn bộ các hoạt động vô cùng đa dạng ấy được thực hiện bởi một phân tử duy nhất

1.2 Liên kết hoá học trong hệ thống sinh học

1.2.1 Khái niệm và đặc điểm chung

Liên kết hoá học là lực hút giữa hai nguyên tử lại với nhau Tổ hợp giữa nguyên

tử có kích thước xác định sẽ hình thành lên một phân tử Các nguyên tử trong một phân tử liên lạc được với nhau là do lực liên kết cộng hoá trị quyết định Lực liên kết

là năng lượng cần thiết để phá vỡ nó

Có 2 loại liên kết là liên kết cộng hóa trị (có lực liên kết mạnh) và liên kết hóa học yếu (có lực liên kết yếu) Liên kết giữa các đơn vị thành phần của một phân tử chủ yếu là do liên kết cộng hóa trị, còn liên kết hóa học yếu lại đóng vai trò quan trọng trong việc tạo lên các cấu trúc với những phân tử khác, tạo thành một thể thống nhất

hài hòa, có trật tự nhất định

* Xếp loại các liên kết hoá học: Dựa trên 3 đặc trưng chính sau đây:

- Lực liên kết mạnh hay yếu, ví dụ nếu là liên kết cộng hóa trị thì có lực liên kết mạnh, bền vững và khó phá vỡ

- Liên kết yếu, dễ bị phá vỡ, tồn tại thời gian ngắn Chỉ khi kết thành khối nhóm mới có thể tồn tại được lâu dài

19

- Năng lượng dùng để phá vỡ hoặc hình thành một liên kết cộng hoá trị cần phải lớn, ví dụ muốn phá vỡ liên kết C-C thường cần 58,6 Kcal/mol, trường hợp muốn phávỡ liên kết C - C trong phân tử ethane thì phải cần tới 83 Kcal/mol Trong khi đó phá vỡ liên kết yếu chỉ cần từ 1 - 5 Kcal/mol, ở nhiệt độ sinh lý 37oC của người cũng có thể phá vỡ được nhiều liên kết hóa học yếu

Số lượng liên kết: Trong liên kết cộng hóa trị, số lượng liên kết hóa học tối đa của một nguyên tử có thể tham gia được gọi là hóa trị, thí dụ oxy hóa trị 2, trong khi đó liên kết hóa học yếu có số liên kết ngoài tùy thuộc vào số lượng nguyên tử ra còn phụ thuộc vào mức độ tiếp xúc với nhau về không gian ví dụ như liên kết Vander waals

Góc liên kết: Góc liên kết cộng hóa trị thường có góc cố định, còn liên kết yếu, thì góc liên kết thường hay thay đổi

1.2.2 Một số loại liên kết hoá học yếu

1.2.2.1 Liên kết hydro

- Là tương tác giữa một nguyên tử mang điện tích âm (gọi là nguyên tử nhận A) với một nguyên tử hydro nằm trong một nối cộng hóa trị với nguyên tử khác (gọi là nguyên tử cho D)

Ví dụ N trong liên kết N-H và O trong liên kết O-H là những nguyên tử cho chính:

D – H+ ↔ D-H…A

- Liên kết cộng hóa trị giữa D và H phải là liên kết phân cực và đám mây điện tử của A phải mang những điện tử không liên kết và có khả năng thu lực điện tích δ+ của

H

- Năng lượng để phá vỡ liên kết này là khoảng 5Kcal/mol

- Các nguyên tử H, nguyên tử cho D và nhận A đều xếp thành một đường thẳng

- Trong hệ thống sống có 4 loại liên kết H là:

+ Giữa O với H của 2 nhóm peptide

+ Giữa O với H của 2 nhóm hydroxyl

+ Giữa O với H của gốc Carboxyl và OH của tyrosine

+ Giữa O với H của nhóm Carboxyl mang điện tích với amin

Nhờ liên kết hydro mà các phân tử mang chúng dễ hoà tan được ở trong nước

do liên kết hydro giữa chúng với phân tử nước

- Phân tử nước chiếm chủ yếu của vật chất sống luôn hình thành một mạng lưới

tứ diện đều đặn dù ở trạng thái rắn hay lỏng (Hình 1.7)

Hình 1.10: Mạng lưới tạo ra từ các phân tử nước

1.2.2.3 Liên kết Vander Waals

Là tương tác không đặc hiệu xuất hiện giữa 2 nguyên tử khi chúng tiến đến gần nhau Tương tác này không do phân phối lệch của các điện tử giữa 2 phân tử mà do biến động thoáng qua của các đám mây điện tử gây ra sự phân cực nhất thời trên phân

tử

- Liên kết Vander Waals không phụ thuộc vào tính phân cực của phân tử mà phụ thuộc vào khoảng cách giữa chúng

- Lực liên kết được tạo thành là nhờ kết quả của các lực hút và đẩy giữa các phân

tử, nó cân bằng ở khoảng cách nhất định tùy loại nguyên tử, khoảng cách này gọi là bán kính Vander Waals

- Đây là lực liên kết yếu nhất, với giá trị chỉ bằng khoảng 1 Kcal/mol (Hình 1.8)

Hình 1.11 Liên kết Vander Waals hình thành phụ thuộc vào khoảng cách

- Liên kết này muốn có ý nghĩa thì cần phải tồn tại với số lượng lớn để tạo được diện tích bề mặt tiếp xúc giữa 2 phân tử phải lớn cực đại

Hình 1.12 Mô hình tương tác liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể

- Lực thúc đẩy liên kết giữa các phân tử hay giữa các vùng không phân cực của một phân tử thay vì với các phân tử nước được gọi là liên kết kị nước

- Đây là một lực nhằm loại trừ các phân tử hoặc các nhóm phân tử không phân cực ra khỏi mạng nước

- Liên kết kỵ nước đóng vai trò quan trọng trong việc làm ổn định các protein và phức hợp của nó với các phân tử khác Cũng như việc phân bố các protein trong các màng sinh học

1.2.3.Vai trò của liên kết hóa học yếu cơ bản

Liên kết hóa học yếu đóng vai trò rất quan trong và thể hiện rất đa dạng trong cơ thể sống, đó là sự tương tác giữa enzyme với cơ chất, nhờ liên kết này đã hình thành lên cấu hình không gian của các đại phân tử có tác dụng điều hòa các hoạt động sống

1.2.3.1 Trong tương tác enzyme - cơ chất

Khi xúc tác, các enzyme gắn một cách chọn lọc và tạo ái lực đặc biệt với cơ chất Năng lượng liên kết của tương tác này thường từ 5-10 Kcal/mol Là liên kết hóa học yếu nên được hình thành và bị phá rất nhanh dưới tác động của nhiệt Điều này giải thích tại sao enzyme có khả năng hoạt động với vận tốc đôi khi đạt đến 106 lần trong 1 giây Nếu lực liên kết này lớn thì không thể có tốc độ cao đến như vậy, tuy nhiên tốc độ này còn phụ thuộc vào từng loại enzyme và cơ chất

1.2.3.2 Trong cấu hình không gian của các phân tử

Cấu hình của các đại phân tử được hình thành đều nhờ liên kết hóa học yếu chứ không phải liên kết cộng hóa trị

- Liên kết kị nước làm ổn định phân tử protein nhưng quyết định tạo ra cấu hình đặc trưng lại là do các liên kết hydro Vì liên kết hydro đòi hỏi một khoảng cách xác định và sự sắp xếp có định hướng các nguyên tử cho và nhận trong không gian Khi các nguyên tử này nằm trên khung mạch thẳng polypeptide đã tạo lên cấu trúc bậc 2 đều đặn, chuỗi xoắn α hay dạng nếp mỏng β Các cấu trúc đối xứng đều đặn như vậy

* Chuỗi xoắn kép DNA là một cấu trúc rất ổn định do: Nếu 2 mạch đơn tách nhau, các base nitơ kị nước phải tiếp xúc với nước sẽ bất lợi và không ổn định

1.2.3.3 Các liên kết yếu đảm bảo mối liên lạc giữa Protein và DNA

Các protein histon đóng vai trò tạo ra cấu trúc nén chặt DNA trong nhân nhờ các liên kết ion Liên kết ion này được hình thành giữa các nhánh bên mang điện tích dương của histone với các nhóm photphas mang điện tích âm của DNA DNA được quấn quanh lõi những protein histone Các protein histon đóng vai trò tạo ra cấu trúc nén chặt DNA trong nhân nhờ các liên kết ion Nhiễm sắc thể lớn nhất của người được phát hiện chứa một phân tử DNA khổng lồ dài tới 85.000μm hoặc 8,5.108 Acron Vậy làm thế nào để sợi DNA của nó nằm gọn vào một nhiễm sắc thể ở trung kỳ chỉ có đường kính 0,5μm và dài 10μm Muốn vậy sợi DNA phải co xoắn lại 104 lần Như vậy phải có quá trình co xoắn xảy ra, vấn đề đặt ra là thành phần nào của nhiễm sắc thể có liên quan đến quá trình co xoắn này và liệu các phân tử DNA của từng nhiễm sắc thể khi co xoắn trong từng nhiễm sắc thể xảy ra có theo cách khác nhau hay theo chung một cách? Trong genome có nhiều mức độ co xoắn khác nhau hay không Rõ ràng là ở

cả phân bào nguyên nhiễm và giảm nhiễm thì nhiễm sắc thể đều co xoắn mạnh hơn ở gian kỳ (interphase)

Khi quan sát nhiễm sắc thể phân lập bằng kính hiển vi điện tử thấy nó bao gồm một chuỗi các hạt hình cầu, hình ellipse có đường kính 1100 và cao 600 (hình1.10)

Hình 1.13 Ảnh kính hiển vi điện tử nhiễm sắc thể co xoắn

tạo cấu trúc nucleosome tế bào chuột

Khi nghiên cứu dùng enzyme phân rã DNA trong nhiễm sắc thể thì thu được các đoạn DNA dài khoảng 146 cặp nucleotide luôn được bảo vệ

Trong một thí nghiệm khác khi dùng enzyme (nuclease) phân rã từng phần nhiễm sắc thể người ta đã thu được 1 bộ những đoạn DNA có kích thước tách biệt nhau, điều này chứng tỏ nhiễm sắc thể có cấu trúc lặp lại, đồng thời cũng chứng tỏ các chuỗi hạt trên chính là một dạng tổ chức cho phép phân tử DNA cư trú để tránh bị phân giải Các hạt (bead) này được gọi là các nucleosome Nối giữa các hạt là một đoạn DNA, thường

có chiều dài khoảng từ 8 - 114 cặp base, tuỳ loài sinh vật và tuỳ loại tế bào được gọi là đoạn DNA linker

* Mỗi hạt chứa 146 cặp nucleotide quay xung quanh 1 + 3/4 vòng của 8 histon (gồm 2 phân tử của 4 histon) mỗi thứ là H2a, H2B, H3 và H4

23

- Một tiểu cấu tử nhiễm sắc thể hoàn chỉnh (complete chromatin subunit) gồm một hạt, 1 DNA linker và thường có thêm trung bình 1 phân tử protein H1), kết hợp với những protein nhiễm sắc thể không thuộc vào gia đình histon

- Nucleosome còn chứa (phân tử H1) có vai trò cuộn xoắn hạt nucleosome để hình thành nên sợi Chromatin (kích thước 300Ao (hình 1.14)

Hình 1 14 Cấu trúc chromatin

Hình1.15 Sản phẩm điện di của nhiễm sắc thể

Hiện nay người ta đã phát hiện được cấu trúc nucleosome ở những vùng hoạt động của nhiễm sắc thể, nhìn chung khác so với những vùng không hoạt động Nhưng chi tiết của mối quan hệ này cần phải được làm sáng tỏ Dù quấn quanh lõi histon nhưng sợi DNA bên ngoài bề mặt vẫn tiếp xúc với protein khác, đó là các enzyme tham gia vào quá trình sao chép như DNA polymerase, quá trình phiên mã như RNA polymerase hay các protein điều hòa hoạt động các gen Các protein này nhận biết một trình tự xác định trên sợi DNA rồi gắn vào đó ở vị trí có các nhóm basebase đặc trưng nhờ liên kết ion Cơ chế nhận biết này chủ yếu là do kết quả của sự bổ sung hình dạng giữa protein và DNA Do năng lượng liên kết yếu giữa các đại phân tử không đủ lớn để tạo ra mạng lưới cứng nhắc bên trong tế bào nên tế bào sống thường không bao giờ đặc lại được Cũng chính nhờ lực liên kết yếu đó nên hiện tượng khuếch tán trong tế bào thường tăng mạnh, tất nhiên còn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của tế bào Nhờ khuếch tán mạnh mà các phân tử khác nhau có cơ hội tiếp xúc được với nhau tạo để thực hiện nhiều phản ứng sinh học thiết yếu cho sự sống

Tóm lại nhờ có một số lớn các liên kết yếu đã giúp các phân tử trong tế bào vừa liên lạc được với nhau vừa có tính linh động, mềm dẻo đây là đặc trưng cơ bản của sự sống Việc hình thành lên cấu trúc sinh học phụ thuộc không những vào bản thân phân tử mà

24

còn phụ thuộc vào các phân tử khác trong môi trường xung quanh Cấu trúc khác nhau sẽ dẫn đến chức năng khác nhau

Câu hỏi ôn tập

Câu 1: DNA là gì? Trình bày cấu trúc bậc 1 của DNA

Câu 2: Trình bày cấu trúc của DNA theo Watsơn và Crick

Câu 3: Trình bày đặc điểm và các dạng cấu trúc cảu DNA? DNA có chức năng gì?

Câu 4: Trình bày cấu trúc và chức năng của các loại RNA

Câu 5: So sánh cấu trúc và chức năng của DNA và RNA?

Câu 6: Trình bày cấu trúc 4 bậc của protein Protein thực hiện chức năng ở cấu trúc bậc mấy?

Câu 7: Trình bày cấu trúc và chức năng của lipit trong co thể

Câu 8: Trình bày đặc điểm các liên kết hóa yếu

Câu 9: Phân tích vai trò của liên kết hóa học yếu trong tế bào

Câu 10: Phân biệt DNA, RNA và protein

25

Chương 2

HỆ GEN - ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA GEN

2.1 Hệ gen (genome)

2.1.1 Khái niệm hệ gen

Quá trình sinh trưởng và phát triển của sinh vật trải qua rất nhiều giai đoạn và tất

cả quá trình đó đều phụ thuộc vào sự điều khiển của các gen Cấu trúc, chức năng của

tế bào được quyết định trực tiếp bởi protein, đó là sản phẩm cuối cùng của sự biểu hiện gen Quá trình thể hiện hoạt động của gen qua protein, bị ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố ngoại cảnh như ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, sự cộng sinh và sự tương tác của các gen trong hệ gen của tế bào Như vậy, giữa các thành phần của hệ gen trong tế bào sống có sự tương tác với nhau và có mối quan hệ với các yếu tố của môi trường Trong

tế bào, bên cạnh genome trong nhân, hệ thống di truyền còn phân bố trong lục lạp, ti thể và plasmid (vi khuẩn) Các cơ quan tử này cùng tham gia vào quá trình sinh tổng hợp protein của tế bào.Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của các cơ thể sống, tế bào còn là đơn vị của sự di truyền

Hệ gen là toàn bộ các gen trong tế bào của cơ thể sinh vật, hệ gen chứa toàn bộ thông tin di truyền đặc trưng cho từng loài, cho từng cá thể trong loài

Ở sinh vật Prokaryote hệ gen gồm toàn bộ các gen trong tế bào; còn ở Eukaryote

hệ gen gồm toàn bộ các gen trong tế bào đơn bội (n)

Tế bào đơn bội có một hệ gen, các sinh vật hoặc tế bào lưỡng bội có hai hệ gen, sinh vật đa bội có nhiều hệ gen Hệ gen của sinh vật Eukaryote bao gồm hệ gen nhân (genome nhân), hệ gen ti thể (genome ti thể), hệ gen lục lạp (genome lục lạp – không

có ở động vật) Hệ gen ở Prokaryote chỉ có một thành phần gồm các đoạn DNA không giống nhau; còn hệ gen ở Eukaryote có ba thành phần DNA không giống nhau: Các đoạn DNA lặp lại nhiều (chiếm khoảng 25%), các đoạn DNA lặp lại ít (30%) và các đoạn DNA không lặp lại (45%)

2.1.2 Hệ gen ở prokaryote

Genome prokaryote có kích thước nhỏ hơn rất nhiều so với genome eukaryote Bên cạnh nhiễm sắc thể chứa phần lớn thông tin di truyền, tế bào prokaryote còn có nhiều loại plasmid Trước đây, plasmid được xem là những phân tử DNA dạng vòng chứa các gen không quan trọng Ví dụ, plasmid thường mang gen liên quan đến tính chống chịu kháng sinh Do đó, tế bào vẫn có thể tồn tại ngay khi thiếu vắng các gen này Tuy nhiên, khái niệm plasmid được mở rộng ra khi thực nghiệm tìm thấy một số

tế bào prokaryote có chứa phân tử DNA kích thước nhỏ, ở dạng thẳng và mang các gen tương tự như plasmid dạng vòng Vì vậy, plasmid được hiểu là những đoạn DNA kích thước nhỏ mang một số gen không quyết định sự sống còn của tế bào Hơn nữa, một loại plasmid đôi khi được tìm thấy trong các loại tế bào prokaryote khác nhau Mặt khác, plasmid có khả năng biến nạp từ loại tế bào prokaryote này sang loại khác

Vì vậy, mặc dù có chứa gen nhưng plasmid dường như không được xem là một phần của genome

Hầu hết genome prokaryote nhỏ hơn 5 Mb (5.000.000 nucleotide) và thường

được phân bố trên một nhiễm sắc thể dạng vòng Một số tế bào prokaryote có genome

là phân tử DNA dạng thẳng Đặc biệt, một số genome prokaryote là phân tử RNA hoặc kết hợp cả hai loại DNA và RNA

26

Genome prokaryote có thể bao gồm các gen phân bố trên các đoạn thẳng DNA hoặc trên cả hai loại phân tử DNA dạng thẳng và dạng vòng Ví dụ, nhiễm sắc thể

dạng thẳng được phát hiện lần đầu tiên ở Borrelia burgdorferi vào năm 1989 Nhiễm

sắc thể này dài 910 kb gồm 853 gen

Những dẫn liệu thực nghiệm nhận được khi phân tích genome và các plasmid ở

Borreliaburgdorferi đã gây tranh cãi giữa các nhà sinh học khi so sánh genome Borrelia burgdorferi với Treponema pallium Theo phân loại, đây là hai loài vi khuẩn

có quan hệ gần gũi nhau Giống như đa số các tế bào prokaryote khác, genome loài thứ hai là một phân tử DNA dạng vòng có kích thước 1138 kb với 1041 gen Điều thú vị là

không một gen nào ở Treponemapallium tương đồng với các gen phân bố trên plasmid của loài thứ nhất Phải chăng các plasmid vừa được tự nhiên biến nạp vào Borrelia

burgdorferi

Genome prokaryote không đóng gói trong cấu trúc nucleosome (như genome eukaryote) và không được bao bọc bởi màng nhân Nhiễm sắc thể dạng vòng có cấu trúc không gian giống như những cánh của bông hoa, mỗi cánh là một đoạn DNA có

cấu trúc siêu xoắn (supercoil) Các cánh không đều như nhau và được đính vào lõi

protein Genome của prokaryotecó khoảng 40-50 cánh Cấu trúc kiểu bông hoa này

được gọi là nucleoid (Hình 2.1) Cấu trúc nucleoid giúp genome chỉ chiếm một thể tích

rất nhỏ trong tế bào Ngoài ra, cấu trúc không gian này của nhiễm sắc thể được duy trì nhờ các phân tử RNA kích thước nhỏ tương tác với protein Do đó, ngay khi bị đứt gãy, cấu trúc siêu xoắn của nhiễm sắc thể cũng chỉ mở ra một cách cục bộ ở cánh bị tổn thương chứ không xảy ra trên toàn bộ genome Hai enzym DNA gyrase và DNA topoisomerrase giữ vai trò chính cùng phối hợp với phức protein khác làm nhiệm vụ đóng gói DNA vi khuẩn Thực nghiệm đã phát hiện được ít nhất 4 protein tham gia phức này, trong đó protein HU có chức năng tương tự như histone ở tế bào eukaryote Mặc dù có cấu trúc rất khác với histone nhưng HU ở dạng tetramer tạo thành lõi được quấn quanh bởi đoạn DNA khoảng 60 bp Như vậy, protein HU có chức năng tương tự histone trong việc qui định nghiêm ngặt cấu trúc không gian của sợi nhiễm sắc thể Tuy nhiên, chúng ta chưa xác định được các lõi này có phân bố đều đặn hay chỉ tập trung tại "nhị hoa" nucleoid

Hình 2.1.Mô hình cấu trúc nucleoid ở E.coli gồm 40 -50 vòng siêu xoắn kết dính với lõi

protein và sợi RNA

Năm 1995, genome Haemophilus influenzae là genome đầu tiên được xác định

toàn bộ trình tự Đến năm 1998 đã có hơn 18 genome vi khuẩn khác được đọc hoàn

toàn Trong số này, Mycoplasma genitalium có kích thước nhỏ nhất gồm 580.070 bp

và Mycobacterium tuberculosis có kích thước lớn tới 4.411.529 bp

27

Genome ở prokaryote có mật độ phân bố các gen mã hóa cao hơn, số đoạn DNA không chứa mã di truyền ít hơn Nói cách khác, khoảng cách giữa các gen ngắn hơn

Ví dụ, khoảng cách trung bình giữa hai gen ở E.coli là 118 bp Các gen và ORFs

chiếm 87,8%; các gen mã cho RNAs chiếm 0,8%; còn thành phần DNA lặp lại không chứa gen chỉ chiếm có 0,7% Mặt khác hầu hết các gen ở prokaryote đều tồn tại đơn

bản (single-copy gen) và các gen không có intron

- Các loại DNA trong genome:

+ Các trình tự lặp lại nhiều lần: Là những trình tự DNA ngắn (10-200kb), không

mã hóa, tập trung ở những vùng chuyên biệt/NST (tâm động, đầu mút NST), chiếm 10-15% genome

+ Các trình tự lặp lại trung bình: Là những đoạn DNA có kích thước lớn hơn (100-1000kb) Không mã hóa hoặc mã hóa cho rRNA, tRNA, 5S rRNA, chiếm 25-40%,

+ Các trình tự duy nhất: Là các gen mã hóa cho các Protein, có trình tự đặc trưng cho từng gen

Phần lớn các gen phân bố trong thành phần DNA lặp lại duy nhất Các gen chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ so với toàn bộ genome (1-2% genome) Các gen thường phân

bố xa nhau và trong gen chứa nhiều intron

Các gen có nhiều bản sao, ác bản sao của một gen được xếp vào một họ gen Mỗi gen trong họ thường hoạt động ở một thời điểm nhất định trong quá trình phát triển cá thể hay trong mô riêng biệt

Kích thước của genome (ở trạng thái đơn bội - C): đặc trưng cho loài, kích thước của genome không tỷ lệ với mức độ tiến hóa và tính phức tạp của cơ thể

- DNA ty thể của nấm men S cerevisiae dài hơn mtDNA của tế bào động vật

năm lần do sự có mặt của các đoạn intron dài

Các genome ty thể có kích thước tổng số rất khác nhau, các tế bào động vật có kích thước genome nhỏ (khoảng 16,5 kb ở động vật có vú) Có khoảng một vài trăm ty thể trên một tế bào Mỗi ty thể có nhiều bản sao DNA Số lượng của DNA ty thể so với DNA nhân là rất nhỏ (<1%)

Trong nấm men S cerevisiae, genome ty thể có kích thước khá lớn (khoảng 80

kb) và khác nhau tùy thuộc vào từng chủng Có khoảng 22 ty thể trên một tế bào,

- DNA lạp thể dài từ 120-190 kb Các genome của lạp thể đã được phân tích trình

tự cho thấy có khoảng 87-183 gen

Nói chung, các đặc điểm của genome lạp thể tương tự ở ty thể, ngoại trừ lạp thể mang nhiều gen hơn Genome lạp thể mã hóa cho tất cả các loại rRNA và tRNA cần thiết trong tổng hợp protein.Các intron trong lạp thể được chia thành hai nhóm: 1) những intron ở trên các gen tRNA thường (mặc dù không chắc chắn) được định vị trong vòng anti codon, giống như các intron được tìm thấy trong các gen tRNA của

nhân nấm men S cerevisiae; 2) những intron trong các gen mã hóa protein tương tự

với các intron của các gen ty thể

Vai trò của lạp thể là thực hiện quá trình quang hợp Do đó, nhiều gen của nó mã hóa cho các protein của các phức hợp định vị trong các màng thylakoid

2.1.3 Tính phức tạp của hệ gen

Kết quả nghiên cứu động học của các phản ứng lai được tiến hành giữa genomic DNA với cDNA (complementary DNA-DNA bổ sung), giữa DNA với mRNA… cho thấy hầu hết các gen hoạt động đều nằm trong thành phần DNA không lặp lại Như vậy, thành phần này có ý nghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá tính phức tạp của genome Hay nói cách khác, dựa vào thành phần DNA không lặp lại có thể biết được kích thước genome cũng như mức độ tiến hóa của loài Nếu như kích thước genome (ở trạng thái đơn bội) được coi là một thông số động học (ký hiệu C), thì giá trị này đặc trưng cho từng loài và không phải luôn luôn tỷ lệ thuận với tính phức tạp của loài Ngược lại, giá trị C phản ánh các đặc điểm sau:

- Số lượng DNA mã hóa cho các sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống của

cơ thể rất nhỏ so với số lượng DNA có trong genome

- Có sự biến đổi rất lớn của giá trị C giữa một số loài mà tính phức tạp của chúng không khác nhau nhiều

Genome prokaryote được xem là chỉ chứa các đoạn DNA không lặp lại và các gen thường tồn tại bản sao đơn Ngược lại, genome của eukaryote thường chứa các gen

có hai hoặc nhiều bản sao Hơn nữa, trình tự nucleotide của các bản sao này có thể không giống nhau hoàn toàn mặc dù sản phẩm protein mà chúng mã hóa có cùng một chức năng Các bản sao tương đồng của một gen được xếp chung vào một nhóm gọi là

29

một họ gen (gen family) Như vậy, ngoài các gen có một bản sao giống như ở vi khuẩn, genome của eukaryote còn chứa các họ gen Hầu hết các gen mã hóa cho protein đã được phân lập đều nằm trong các họ gen khác nhau Các gen trong một họ thường hoạt động theo thời gian và không gian Điều đó có nghĩa, mỗi thành viên trong họ thường hoạt động ở một thời điểm nhất định trong quá trình hình thành và phát triển cá thể hoặc hoạt động trong các mô chuyên biệt Khi một thành viên trong

họ bị đột biến (bất hoạt) thì thành viên khác có thể hoạt động thay thế

Khái niệm về gen được hình thành khi các nhà di truyền học cổ điển nghiên cứu biểu hiện các tính trạng mới do gây đột biến DNA của genome vi khuẩn hay thực khuẩn thể (bacteriophage) Một gen được xem là một đoạn DNA mà bất cứ đột biến nào xảy ra trên đó đều dẫn đến xuất hiện tính trạng mới Điều này dễ hiểu đối với những genome chỉ chứa các gen có một bản sao (như genome của prokaryote) Tuy nhiên, ở genome của eukaryote, khi có nhiều gen cùng qui định một tính trạng hoặc các gen tương đồng trong một họ có thể hoạt động hỗ trợ thay thế nhau thì đột biến trên một gen không phải lúc nào cũng quan sát được ở mức độ phenotype Mặt khác, các đoạn DNA tương ứng với trình tự mã hóa (coding sequence, exon) cho một protein thường bị ngắt quãng bởi các đoạn DNA không chứa thông tin di truyền (non-coding sequence, intervening sequence, intron) Các intron được phiên mã cùng với các exon sang phân tử RNA gọi là phân tử tiền thân mRNA (pre-mature mRNA hay pre-mRNA) nhưng sau đó chúng bị loại bỏ và các exon được nối lại với nhau tạo thành phân tử mRNA hoàn chỉnh (mature mRNA hay mRNA) được dùng cho quá trình sinh tổng hợp protein Quá trình cắt các intron, nối exon không tuân theo một trật tự bắt buộc mà biến hóa đa dạng tạo ra các phân tử mRNA khác nhau từ một phân tử pre-mRNA Bên cạnh mRNA, các phân tử rRNA và tRNA cũng được hình thành từ các phân tử tiền thân chứa intron Ngoài ra, còn có hiện tượng mã di truyền của gen này nằm xen kẽ với các mã di truyền của gen khác (các gen nằm gối lên nhau-overlapping) hoặc trường hợp dịch chuyển khung đọc ngay trên một đoạn DNA

Chúng ta đã biết đến chức năng của các phân tử RNA trong hoạt động sống của

tế bào Bên cạnh ba loại RNA đã được nghiên cứu khá kỹ (mRNA, rRNA và tRNA), vai trò của một số loại RNA khác mới được phát hiện vào những năm cuối thế kỷ 20 Chúng kiểm soát sự hoạt động của gen (hiện tượng bất hoạt gen-gen silencing), tham gia phản ứng đọc sửa thông tin di truyền trên phân tử mRNA (hiện tượng RNA editing) hay quyết định tính bền vững của mRNA (các ribonuclease)… Thậm chí có những phân tử pre-mRNA được tổng hợp không phải mã hóa cho protein mà với mục đích phân cắt tạo ra những phân tử RNA có kích thước nhỏ hơn tham gia quá trình kiểm soát hoạt động của các gen khác Đột biến ở những đoạn DNA mã hóa cho tất cả các loại RNA này thường gắn liền với việc xuất hiện tính trạng mới Do đó, cần xem xét các đoạn nucleotide đó như các gen mặc dù chúng không mã hóa cho protein Ngày nay, theo quan điểm của sinh học phân tử, một gen được xem là một đoạn DNA mã hóa cho một sản phẩm cần thiết đối với hoạt động sống của tế bào Rõ ràng rằng không phải chỉ có DNA mã hóa cho protein mà cả các DNA mã hóa cho rRNA, tRNA và các loại RNA khác tham gia vào những phương thức kiểm soát hoạt động của genome cũng được xác định là gen

2.2 Đặc điểm cấu trúc của gen

2.2.1 Khái niệm về gen

Vào những năm 1940, Beadle và Tatum đã chứng minh gen kiểm tra các phản ứnghóa sinh và nêu giả thuyết một gen-một enzyme Tuy nhiên, trường hợp hemoglobin là một protein nhưng lại gồm hai chuỗi polypeptide do hai gen xác định,

do đó giả thuyết trên buộc phải điều chỉnh lại là một gen-một polypeptide

Vào những năm 1950, DNA (deoxyribonucleic acid) được chứng minh là vật chất di truyền Mô hình cấu trúc DNAcủa Watson và Crick được đưa ra và lý thuyết trung tâm (central dogma) ra đời Gen được xem là một đoạn DNA trên nhiễm sắc thể

mã hóa cho một polypeptide hay RNA

Cuối những năm 1970, việc phát hiện ra gen gián đoạn ở sinh vật eukaryote cho thấy có những đoạn DNA không mã hóa cho các amino acid trên phân tử protein Vì thế, khái niệm về gen lại được chỉnh lý một lần nữa: Gen là một đoạn DNA đảm bảo cho việc tạo ra một polypeptide, nó bao gồm cả phần phía trước là vùng 5’ không dịch

mã (5’ untranslation) hay còn gọi là vùng ngược hướng (upstream) và phía sau là vùng 3’ không dịch mã (3’ untranslation) hay còn gọi là vùng cùng hướng (downstream) của vùng mã hóa cho protein bao gồm cả những đoạn không mã hóa (intron) xen giữa các đoạn mã hóa (exon)

Từ các khái niệm về gen được hình thành và thay đổi dần để phù hợp với các kết

quả thí nghiệm, sinh học phân tử ngày nay định nghĩa một gen như sau: Gen là một

đoạn DNA cần thiết cho sự tổng hợp một polypeptide có hoạt tính hoặc một phân tử RNA cần thiết cho hoạt động của tế bào Như vậy, một gen không phải chỉ bao gồm

vùng chứa mã di truyền (codon region) mà còn gồm các đoạn DNA (các vùng DNA điều khiển (regulatory elements)) cần thiết cho việc phiên mã

2.2.2 Đặc điểm cấu trúc của gen ở prokaryote và ở eukaryote

Khi nghiên cứu các quy luật di truyền Mendel và học thuyết di truyền nhiễm sắc thể, gen được quan niệm như một điểm trên nhiễm sắc thể, vừa là đơn vị chức năng xác định một tính trạng, vừa là đơn vị đột biến, vừa là đơn vị tái tổ hợp Cùng với sự phát triển của di truyền học, khái niệm về gen được cụ thể hóa thêm, cấu trúc và chức năng của gen được hiểu chi tiết hơn

Một gen thường gồm có hai phần, phần mang mã di truyền được phiên mã sang phân tử mRNA và phần DNA làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động của gen (Hình 2.2)

Cả hai phần đều có cấu trúc cơ bản khá giống nhau ở mọi sinh vật prokaryote và eukaryote Tuy nhiên, gen eukaryote còn có cấu trúc đặc thù liên quan đến các cơ chế kiểm soát khác nhau đối với hoạt động của gen

Cấu trúc một gen điển hình đều có promoter, vị trí để RNA polymerase hoạt động khởi đầu phiên mã Trong một số trường hợp promoter nằm rất xa gen, có thể thấy các enhancer (vùng tăng cường) hoặc silencer (vùng ức chế) có vai trò liên quan đến quá trình phiên mã Độ dài của một gen thay đổi tùy theo số lượng và độ dài của các intron chứa trong nó

Vùng DNA mang mã di truyền sẽ được phiên mã sang phân tử mRNA Quá trình này thực hiện theo chiều 5’3’ trên sợi mRNA Không phải mọi phiên mã di truyền

31

trên phân tử mRNA đều được dịch mã sang phân tử protein Hai đầu 5’ và 3’ của phân

tử mRNA gồm một số nucleotide không được dịch mã mà lại liên quan đến tính bền vững của phân tử mRNA hoặc tham gia kiểm soát quá trình dịch mã Hai đoạn này gọi

là vùng không dịch mã 5’ và 3’ (untranslated region) Vùng không dịch mã 5’ nằm trước điểm khởi đầu dịch mã (3 nucleotide AUG mã hóa cho methionine đầu tiên của chuỗi polypeptide) và vùng không dịch mã 3’ nằm sau điểm kết thúc dịch mã (stop codon có thể là UAA, UGA và UAG) Do tế bào prokaryote không có cấu trúc nhân nên quá trình phiên mã (tổng hợp mRNA) và dịch mã (tổng hợp protein) xảy ra đồng thời Còn phân tử mRNA của eukaryote được phiên mã trong nhân, sau đó phải cắt bỏ intron và gắn các exon lại, chịu biến đổi tại các đầu 5’ và 3’ trước khi vận chuyển ra ngoài tế bào chất để dùng làm khuôn mẫu tổng hợp protein

Hình 2.2 Cấu trúc chung của một gen

Hoạt động của một gen được đánh giá thông qua quá trình phiên mã (tổng hợp mRNA) và quá trình dịch mã (tổng hợp protein) Hoạt động này được kiểm soát rất chặt chẽ bằng các cơ chế khác nhau ở mọi giai đoạn, như bắt đầu và kết thúc phiên mã, quá trình biến đổi mRNA, quyết định tính bền vững và kiểm tra lại thông tin di truyền trên các phân tử này Do cấu trúc sắp xếp các gen prokaryote khác với gen eukaryote nên sự phối hợp giữa các cơ chế điều khiển mang tính chất riêng biệt cho từng loại genome

Các gen của prokaryote thường sắp xếp nằm gần nhau và chịu sự điều khiển chung của một promoter, tức là chúng được phiên mã sang cùng một phân tử mRNA Cấu trúc này được gọi là operon Như vậy, một operon gồm hai hay nhiều gen nằm cạnh nhau trên một nhiễm sắc thể Thông thường, đó là các gen cùng tham gia vào một con đường chuyển hóa, ví dụ như các gen mã hóa cho các enzyme cần thiết cho quá trình chuyển hóa glucose

Do có chung promoter điều khiển cho mọi gen nằm trong một operon cho nên chỉ

có một loại phân tử mRNA được tổng hợp từ một operon (mang thông tin di truyền của tất cả các gen nằm trong đó) Nói cách khác, quá trình phiên mã của các gen trong một operon xảy ra đồng thời và phân tử mRNA đặc trưng cho operon được gọi là mRNA-polycistron

Tuy nhiên, điều cần ghi nhớ là quá trình dịch mã trên các phân tử polycistron xảy ra hoàn toàn độc lập với nhau Mỗi đoạn tương ứng với một gen trên phân tử này đều có vị trí bám của ribosome, có mã bắt đầu và kết thúc tổng hợp chuỗi polypeptide riêng biệt Do đó, tốc độ tổng hợp các protein trên các phân tử mRNA-

mRNA-polycistron hoàn toàn khác nhau

Gen của đa số sinh vật prokaryote gồm nhiều cistron (đa cistron), trình tự promotor, operator Gen cấu trúc của prokaryote có cấu trúc liên tục, bao gồm những đoạn mã hoá

32

axitamin Promotor là trình tự trên phân tử DNA có chức năng khởi động quá trình phiên

mã Operator là trình tự có ái lực với protein ức chế, nếu operator gắn với protein ức chế

sẽ ngăn cản hoạt động của RNA-polymerase và ức chế quá trình phiên mã Mỗi cistron chứa thông tin của một loại chuỗi polipeptit và cũng là nhân tố điều khiển quá trình tổng

hợp chuỗi polipeptit thông qua quá trình phiên mã và dịch mã

Một gen ở Eukaryote có cấu trúc bao gồm đoạn tăng cường (enhancer) đoạn khởi động (promotor), intron và exon xen kẽ nhau, cuối cùng là đoạn kết thúc Các đoạn không mã hoá (Noncoding Sequences) được gọi là intron hay gọi là đoạn xen (Intervening Sequences) (IS) xen vào và làm gián đoạn các đoạn mã hoá (Coding Sequences) được gọi là exon

Những gen có cấu trúc gồm exon và intron xen kẽ nhau được gọi là gen khảm (gen không liên tục ) Hiện nay, chưa rõ chức năng của intron, tuy nhiên có giả thuyết rằng, intron có vai trò như là các khoảng trống xen giữa các exon tạo thuận lợi cho sự tái tổ hợp giữa các exon

Thí nghiệm của Pierre Chambon (Pháp) phát hiện cấu trúc của exon - intron của gen ovalbumine gà Ovalbumine là protein lòng trắng trứng gồm một chuỗi polipeptit

có 386 amino acido acid (tập hợp trong ống dẫn trứng ở thời kì gà mái đẻ trứng) Ngoài việc tách mRNA của ovalbumine, sử dụng enzyme sao mã ngược tạo ra các bản sao của mRNA sợi đơn được gọi là cDNA và tạo thành cDNA sợi kép So sánh DNA

hệ gen nhân với cDNA khi giải trình tự cho phép phát hiện ra intron và exon Kết quả ovalbumine trứng gà phát hiện 7 intron, 8 exon

2.2.3 Phương pháp phát hiện các đoạn intron và exon

a Phương pháp so sánh trình tự gen và trình tự cDNA

Bước1:

1.Tách chiết DNA hệ gen

2 Phân lập gen bằng kĩ thuật PCR hay enzyme cắt hạn chế

3.Tạo dòng DNA tái tổhợp, nhân dòng và tách dòng gen

4 Giải trình tự gen

Bước2:

1.Tách mRNA trong tế bào chất

2 Sử dụng enzyme sao mã ngược tổng hợp cDNA

3 Giải trình tự cDNA

Bước3: So sánh trình tự DNA hệ gen với trình tự cDNA để xác định được các

đoạn intron và exon

b Phương pháp lai phân tử

Phát hiện intron và exon còn được tiến hành theo phương pháp lai phân tử và kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử

1.Tách DNA hệ gen và mRNA tế bào chất

2 Phân lập gen

3 Lai phân tử giữa DNA và mRNA sẽ xác định được intron và exon

2.3 Hoạt động của gen

33

2.3.1 Cơ chế tái bản và sửa chữa DNA

Một trong những đặc tính quan trọng của cơ thể sống là đặc tính tự sinh sản ra những cơ thể mới mang các tính trạng hình thái sinh lý giống bố mẹ Đặc tính đó dựa trên cơ sở sự tái bản (replication) của phân tử DNA, qua đó một phân tử DNA mẹ đã sinh ra 2 phân tử DNA con, giống hệt DNA mẹ và thông qua cơ chế phân bào, 2 phân

tử DNA con được phân ly về 2 tế bào con, do đó mà 2 tế bào con mang đặc tính di truyền như tế bào mẹ

2.3.1.1 Quá trình tái bản

a Các kiểu tái bản DNA

Người ta đưa ra 3 giả thuyết về các kiểu tái bản DNA:

Kiểu bảo toàn: Chuỗi DNA mẹ giữ nguyên, DNA mới được tổng hợp từ nguyên

liệu (chưa có bằng chứng trong tự nhiên)

Kiểu phân tán: DNA ban đầu đứt ra từng đoạn nhỏ, mỗi đoạn nhỏ làm khuôn để

tổng hợp các đoạn nhỏ khác Các đoạn nhỏ nối lại với nhau thành DNA

Kiểu bán bảo toàn:Watson và Crick cho rằng nếu hai sợi DNA tách rời nhau,

mỗi sợi có thể sẽ được sử dụng làm khuôn để tổng hợp một sợi mới vì các base luôn có

xu hướng bắt cặp với nhau theo nguyên tắc: A liên kết với T bằng hai liên kết hidro, G liên kết với C bằng ba liên kết hidro và ngược lại

Những thí nghiệm của Meselson và Stahl (1957) đã chứng minh lý thuyết tái bản

DNA theo kiểu bán bảo toàn (Hình 2.3) Các tác giả trên đã nuôi cấy E coli qua nhiều

thế hệ trong một môi trường chứa 15NH4Cl là nguồn cung cấp nitrogen duy nhất Bằng cách này, DNA được tổng hợp có 15N (15N là một chất phóng xạ nặng hơn chất phóng

xạ thông thường 14N) Ở một thời điểm nhất định (thời điểm 0), các tác giả này đã chuyển nuôi cấy vào một môi trường chứa 14NH4 Cl Tiếp đến, sau từng thời gian đều đặn, họ phân tích DNA chiết xuất từ vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm theo gradient CsCl

Hình 2.3 Thí nghiệm của Meselson và Stahl (1957)

Kết quả thực nghiệm cho thấy:

- Ở thời điểm 0: chỉ có một phân tử tương ứng với DNA nặng 15N

b Thành phần tham gia

- DNA mẹ dùng làm khuôn

- Nguyên liệu: Các nucleotide - Tri - photphas (dATP, dGTP, cDTP và dTTP)

- Các loại protein: Tham gia tái sinh DNA có nhiều loại protein đặc hiệu như protein SSB, protein Dna

- Hệ enzyme tham gia tái bản DNA:

+ Helicase : tháo xoắn DNA

+ DNA – ligase: Nối các đoạn okazaki

+ RNA – polymerase (primase) : Tổng hợp mồi

+ Ba loại enzyme DNA-polymerase ở E.Coli

1 DNA-polymeraseI: giữ vai trò trong tái bản DNA, có thể dễ sửa chữa

2 DNA-polymeraseII: xác định sự bắt đầu tổng hợp DNA

3 DNA-polymeraseIII: điều khiển tổng hợp DNA, thực hiện nhiệm vụ chủ yếu gia tăng chiều dài của một sợi mới

+ Ba loại enzyme DNA-polymerase ở Eukaryote

1 DNA-polymerase α (120.000- 300.000dalton) có chức năng tái bản DNA của nhân

2 DNA-polymerase β (30.000-50.000dalton) sửa đổi DNA

3 DNA-polymerase γ (150.000-300.000dalton) tái bản hệ gen ti thể

c Cơ chế tái bản DNA theo Okazaki-Tái bản nửa gián đoạn

Hình2.4: Tái bản DNA theo Okazaki