Enzyme trong sinh học phân tử

Chương 4: MỘT SỐ ENZYME VÀ VECTOR TẠO DÒNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ

4.1. Enzyme trong sinh học phân tử

4.1.1.Enzyme giới hạn(RE - restriction endonuclease) 4.1.1.1. Khái niệm

Enzyme giới hạn là những enzyme chỉ cắt DNA ở những trình tự đặc hiệu (vị trí nhất định). Mỗi enzyme giới hạn nhận biết được một trình tự đặc trưng và cắt trình tự đó tại một điểm cố định. Các enzyme giới hạn có vị trí cắt rất đặc hiệu nhưng lại không đặc hiệu về loài, có nghĩa là chúng có khả năng cắt bất kể loại DNA nào chiết tách được từ các nguồn khác nhau (vi sinh vật, thực vật, động vật). Cho đến nay người ta đã tách chiết được hàng ngàn các enzyme giới hạn khác nhau từ các vi khuẩn và nó trở thành nhóm enzyme quan trọng hàng đầu sử dụng trong công nghệ DNA tái tổ hợp.

4.1.1.2.Phân loại và cách gọi tên enzyme giới hạn a. Phân loại

- Loại 1: Khi nhận biết được trật tự đặc hiệu , enzyme giới hạn sẽ di chuyển dọc theo DNA đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 - 5000 nucleotide, cắt tại đó và giải phóng khoảng vài chục nucleotide.

- Loại 2: enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ngay tại đó. Loại này được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu hiện nay.

- Loại 3: enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách xa đó khoảng 20 nucleotide.

b. Cá ch gọi tên

Cách gọi tên được quy định như sau: Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tiên trong tên chi (genus) vi khuẩn mà từ đó các enzyme giới hạn được phát hiện. Tiếp theo là hai chữ đầu tiên của tên loài không viết hoa. Sau đó là một chữ viết hoa chỉ tên chủng vi khuẩn và cuối cùng là chữ số La mã chỉ thứ tự enzyme giới hạn được phát hiện.

Ví dụ như HpaI và HpaII là enzyme giới hạn thứ nhất và thứ 2 cùng được tách ra từ Haemophilus painfluenzae.

4.1.1.3. Một số enzyme giới loại 2 đang sử dụng hiện nay

* Một số enzyme giới hạn loại 2

Có thể nói các RE này là những công cụ thực thụ để cắt các DNA. Sự cắt này xảy ra ở một vùng đặc biệt được nhận biết bởi enzyme. Mỗi một enzyme nhận biết một đoạn nucleotide khác nhau rất đặc hiệu đối với nó và được gọi là trình tự nhận biết (chuỗi đích) hay đoạn đọc ngược xuôi.

Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi đơn. Các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ 4 đến 6 đôi base. Ví dụ như đoạn DNA được đóng khung sau

Hình 4.1 Trình tự nhận biết của enzyme EcoRI

60

* Một số loại enzyme giới hạn loại 2 thường sử dụng trong công nghệ gen hiện nay:

Bảng 4.1: Một số loại enzyme giới hạn Enzym Vi khuẩn có Enzym Vùng nhận biết

EcoRI Escherichia coli GA-A-T-T-C

C-T-T-A-AG

EcoRV Escherichia coli G-A-TA-T-C

C-T-AT-A-G

Tagi Thermus aquaticus TC-G-A

A-G-CT

HbaI Haemophilus baemoliticus GC-G-C

C-G-CG

DdeI Desulfovibrrio desulfuricans CT-N-A-G

G-A-N-TC

Pst I Providencia stuarti C-T-G-C-AG

GA-C-G-T-C

MstII Microcoleuss stuati C-CT-N-A-G-G

G-G-A-N-TC-C

NotI Nocardia otitidiscaviarum G-CG-G-C-C-G-C

C-G-C-C-GG-C-G

BamHI Bacilus amyloliquefaciens GG-A-T-C-C

C-C-T-A-GG

HaeIII Haemophilus aegyptius G-GC-C

C-CG-G

HhaI Haemophilus haemoliticus G-G-CC

CC-G-G

* Các kiểu cắt của enzyme giới hạn loại 2.

Mỗi Enzyme giới hạn có khả năng nhận biết các trật tự đặc hiệu có từ 4 - 8 cặp nucleotide trên chuỗi DNA. Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các nucleotide là ngẫu nhiên thì xác xuất để một đoạn trình tự được nhận biết sẽ là 4n (n là số cặp base của chuỗi được nhận biết). Như vậy, chuỗi trình tự nhận biết càng ngắn bao nhiêu thì xác xuất nó tình cờ xuất hiện trong một đoạn DNA càng lớn bấy nhiêu. Giả sử đoạn cần nhận biết có 4 nucleotide thì cứ 44 = 256 cặp base sẽ gặp lại đoạn đó một lần, nếu có 5 nucleotide thì cách 45 = 1024 cặp base mới gặp lại đoạn trình tự đó.

61

Enzyme giới hạn có khả năng cắt sợi kép DNA ở những vị trí rất đặc biệt, ở vị trí này các cặp base có cấu trúc đối xứng đặc biệt. Các enzyme giới hạn thường cắt theo 2 kiểu khác nhau:

- Cắt tạo ra đầu bằng (Blunt ends): là các enzyme giới hạn cắt cả hai mạch DNA cùng một vị trí. Các đoạn cắt theo kiểu này không có khả năng tự kết hợp lại với nhau.

Để gắn lại đòi hỏi có các enzyme gắn (Ligaza) hoặc các adaptor đặc trưng cho từng loại enzyme.

Hình 4.2. Kiểu cắt tạo đầu bằng

- Cắt tạo ra đầu so le (cohesive ends): Các enzyme giới hạn cắt 2 mạch của DNA ở 2 vị trí lệch nhau. Kết quả tạo nên các đoạn DNA có các đầu so le có các trình tự nucleotide bổ xung cho nhau nên có thể tự nối lại với nhau. Chính vì thế các đầu so le này được gọi là đầu dính.

Hình 4.3. Kiểu cắt tạo đầu so le

Từ đây xuất hiện khả năng chắp nối các đoạn DNA từ các nguồn khác nhau nếu chúng cùng được cắt bởi một loại enzyme giới hạn thì các đầu cắt của mẫu DNA hoàn toàn khớp nhau (tương ứng theo nguyên tắc bổ xung) và chúng rất dễ dàng gắn lại với nhau.

Điều quan trọng của các enzyme giới hạn kiểu II là tác động của nó không bị sai lạc. Khi một mẫu DNA được xử lí bằng một trong những enzyme này thì các mẫu cùng kiểu sẽ được sản sinh hay nói cách khác toàn bộ các điểm nhận biết đều bị cắt.

Như vậy, có thể xây dựng các bản đồ cắt giới hạn của DNA cho các enzyme cắt khi cho DNA bị cắt bởi các enzyme giới hạn kiểu II khác nhau cũng như với tổ hợp của các enzyme này. Vị trí của các điểm cắt có thể suy ra nhờ việc phân tích kích thước đoạn cắt thông qua phát hiện được khi điện di trên gel agarose.

4.1.1.4. Hiện tượng methyl hoá và hoạt động của enzyme giới hạn

- Hiện tượng methyl hóa là khả năng của enzyme xúc tác quá trình gắn các gốc CH3

vào vị trí các base adenine hoặc cytosine trong nội tại trình tự nhận biết đặc thù. Như enzyme EcoRI có khả năng methyl hóa các base adenine trong nội tại vùng nhận biết của enzyme này. Như vậy đã ngăn cản không cho chính enzyme này cắt tại vị trí đó.

62

- Một số enzyme cắt giới hạn bị ức chế hoạt tính cắt do đoạn nhận biết có những nucleotide bị methyl hóa.

- Chủng vi khuẩn E. coli nào chứa một trong 2 trình tự base nếu có vị trí Adenin trong trình tự GATC và cytosine ở giữa trình tự CC(A/T)GG dễ bị methyl hoá Vì thế DNA của những plasmid được chiết xuất từ 2 chủng E. coli này thường có thể bị cắt một phần hoặc không bị cắt bởi những enzyme cắt giới hạn có đoạn nhận biết giống với một trong 2 trình tự trên. Để tránh điều này xảy ra, trong kỹ thuật nhân dòng gen, nên chỉ chiết tách và dùng DNA của plasmid từ những chủng vi khuẩn E. coli không có chỗ nào bị methyl hóa.

- DNA động vật có vú hiếm khi chứa 5’- cytosine bị methyl hóa, ngược lại chúng thường có 5’- Guanine bị methyl hóa. Mức độ methyl hóa biến động từ vị trí này đến vị trí khác, đặc biệt theo loại tế bào từ đó DNA được chiết xuất ra.

- Mức độ methyl hóa trong DNA genome sinh vật bậc cao có thể được nghiên cứu bằng cách sử dụng những đồng enzyme (isoschizomer), có khả năng mẫn cảm với methyl hóa khác nhau. Thí dụ enzyme MspI cắt đoạn CCGG cả khi Cytosine ở giữa bị methyl hoá, trong khi đó enzyme HpaII cũng cắt đoạn CCGG nhưng lại rất mẫn cảm nếu cytosine này bị methyl hóa.

- Hiện tượng methyl hóa ngăn cản hoạt tính enzyme cắt giới hạn nhiều khi lại có lợi và nếu những trình tự nhận biết men methylase nằm gần với trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn nào đó thì có thể sẽ ức chế hoạt động cắt tại vị trí này, vì thế sẽ làm đảo lộn tính đặc thù trình tự cắt hiển nhiên của enzyme.

- Trong trường hợp muốn sử dụng đoạn kết gắn linker nhằm biến đổi trình tự các đầu của 1 đoạn DNA, khi đó lại cần phải bảo vệ bằng được những vị trí cắt của enzyme hạn chế ở bên trong, bằng cách tiến hành methyl hóa trước khi tiến hành dựng enzyme cắt thành các đoạn sau đó kết gắn với linker.

4.1.1.5. Ứng dụng của enzym giới hạn

Enzyme giưới hạn được sử dụng cho nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau như:

- Dùng để thiết lập bản đồ cắt giới hạn của DNA plasmid hoặc dòng thực khuẩn thể. Bản đồ cắt giới hạn là vị trí cắt của mỗi RE trên phân tử DNA, nhóm liên kết hay cả bộ genome.

- Phân cắt tạo ra các đoạn nhỏ từ DNA genome trước khi phân tách bằng điện di và tiến hành lai DNA, dùng trong phương pháp RFLP.

- Tạo ra các đoạn để nhân dòng trong vector thích hợp.

- Tạo ra các đoạn DNA mẫu dò để đánh dấu, sử dụng trong phương pháp lai DNA.

4.1.2. Chức năng của một số loại enzym khác 4.1.2.1.Polymerase

Các polymerase tham gia vào quá trình tái bản DNA và phiên mã tổng hợp RNA và được sử dụng nhiều trong kĩ thuật di truyền. Các polymeasase gồm 2 nhóm:

- DNA-polymerase xúc tác tổng hợp chuỗi polynucleotide theo chiều từ 5' đến 3'.

Taq polymerase (enzyme tách từ vi khuẩn suối nước nóng) có khả năng chịu nhiệt, sử dụng trong phản ứng chuỗi PCR. Enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase:

RT-ase) xúc tác tổng hợp c DNA từ khuôn RNA;

63

- Các RNA-polymerase tham gia tổng hợp RNA. Ngoài các enzyme trên còn có nhiều enzyme tham gia sửa chữa những sai sót trên phân tử DNA.

a. DNA polymerase

* DNA-polymerase I

Enzyme DNA-polymerase I, ngoài chức năng polymerase, còn có hoạt tính của exonuclease 5' → 3' và 3' → 5'. Enzyme này xúc tác phản ứng thay thế sợi, trong phản ứng đó chức năng exonuclease 5' → 3' phân huỷ sợi không làm khuôn trong khi polymerase tổng hợp bản sao mới. Chức năng exonuclease 5'→3' của DNA polymerase I có thể được loại bỏ bằng cách cắt enzyme để tạo ra đoạn Klenow. Đoạn này vẫn duy trì các hoạt tính polymerase và exonuclease 3'→ 5'. Đoạn Klenow được sử dụng khi cần sao chép một phân tử DNA mạch đơn.

* Taq polymerase

Taq polymerase được tách chiết từ một loại vi khuẩn Thermus aquaticus suối nước nóng. Taq polymerase được sử dụng trong PCR và RAPD tổng hợp đoạn DNA trong điều kiện có dung dịch đệm, Mg+, primers. Hiện nay các nhà khoa học có thể phân lập gen xác định enzyme polymerase, tách dòng và biểu hiện gen này. Chính vì vậy bằng công nghệ DNA tái tổ hợp có thể tạo ra lượng lớn enzyme Taq polymerase sử dụng trong kĩ thuật di truyền.

* T4 DNA - polymerase

Enzyme T4 DNA-polymerase có nguồn gốc từ phage T4 kí sinh trong tế bào vi khuẩn. Hoạt tính của enzyme này giống như hoạt tính đoạn Klenow và được sử dụng trong tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao. Bởi vì hoạt tính exonuclease 3'-5' mạnh hơn T4 DNA-polymerase.

* Enzyme phiên mã ngược

Enzyme phiên mã ngược được phát hiện từ 1970 có chức năng tổng hợp DNA từ RNA. Trong tự nhiên, enzyme này do Retro virus sản sinh để phiên mã ngược từ hệgen RNA của chúng để thực hiện quá trình xâm nhập vào hệ gen của tế bào chủ.

Reverse Transcriptase được sử dụng trong kĩ thuật tạo cDNA bằng phản ứng PCR ngược (RT-PCR).

Enzyme phiên mã ngược là một DNA-polymerase phụ thuộc RNA,vì vậy nó sản sinh ra sợi DNA từ sợi khuôn RNA. Nó không có hoạt tính exonuclease kèm theo.

Enzyme này chủ yếu được sử dụng để sao chép các phân tử mRNA khi chuẩn bị cDNA (DNA bổ trợ hoặc DNA bản sao) để tách dòng, mặc dù nó cũng có tác động trên khuôn DNA.

b. RNA polymerase:

RNA polymerase được sử dụng nhiều nhất: SP6 RNA polymerase, T3 và T7 RNA polymerase.

* SP6 RNA polymerase được tách chiết từ phage xâm nhiễm Salmonella typhimurium.

* T3 và T7 RNA polymerase được tách chiết từ phage xâm nhiễm E. coli.

Xúc tác sự tổng hợp RNA từ một mạch của một phân tử DNA mạch đôi theo chiều 5’  3’.

Không cần mồi nhưng khuôn DNA phải có mang một promoter đặc trưngcủa phage.

64

Dùng để tạo một lượng lớn RNA từ một trình tự DNA được nối ngay sau một promoter thích hợp.

4.1.2.2. Enzyme nối Ligase

Enzyme nối DNA-ligase xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA và RNA. DNA-ligase là một enzyme nối quan trọng trong tế bào vì chức năng của nó là sửa chữa các mối liên kết photphodiester bị đứt gãy một cách ngẫu nhiên hoặc trong tái bản DNA hay tái tổ hợp DNA. DNA-ligase được sử dụng trong kĩ thuật tạo dòng và thường được kết hợp với các enzyme Alkalinephosphatase và polynucleotide kinase. Nhóm enzyme ligase được sử dụng nhiều nhất trong các thí nghiệm với DNA và RNA chủ yếu gồm E.coli DNA-ligase, T4 DNA-ligase và T4 RNA-ligase.

* E.coli DNA-1igase

Enzyme E.coli DNA-ligase được tách chiết từ E.coli, xúc tác cho các phản ứng nối hai trình tự DNA có đầu dính (sole).

* T4 DNA-ligase

Enzyme T4 DNA - ligase chiết từ phage T4 kí sinh ở E.coli, xúc tác cho phản ứng nối hai trình tự có đầu bằng, được sử dụng nhiều trong kĩ thuật tạo dòng.

* T4 RNA-ligase

Enzyme T4 RNA-ligase chiết từ phage T4 kí sinh ở E.coli, xúc tác cho phản ứng nối hai trình tự RNA bằng liên kết phosphodiester. Enzyme T4 RNA- ligase thường được sử dụng để đánh dấu phóng xạ ở đầu 3' của RNA trong kĩ thuật sản xuất mẫu dò (probe).

Như vậy, enzyme ligase có hiệu quả trong sự gắn các khe hở của các trình tự có đầu dính hoặc đầu bằng với nhau trong những điều kiện thích hợp.