Chương 6. MỘT SỐ KỸ THUẬT TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ, THÀNH TỰU VÀ TRIỂN VỌNG
6.1. Phân lập gen, tách dòng phân tử và biểu hiện gen
Phân lập gen hay phân lập đoạn DNA là tách một gen hay một đoạn phân tử DNA cần thiết từ hệ gen.
Có thể được tiến hành theo phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế hoặc bằng phản ứng chuỗi PCR. Phân lập gen mang ý nghĩa trong kĩ thuật giải trình tự DNA hay tạo dòng DNA tái tổ hợp trong kĩ thuật chuyển gen.
6.1.1.1. Phân lập gen bằng kĩ thuật cắt hạn chế
Enzyme giới hạn (restrition enzyme) có khả năng cắt DNA ở những điểm đặc hiệu. Với đặc tính đó người ta đã vận dụng để xác định những đoạn DNA mã hoá cho các tính trạng của sinh vật và phân lập đoạn DNA đó. Kĩ thuật phân lập gen nhờ enzyme giới hạn có thể gồm các bước sau:
(1). Tách chiết và tinh sạch DNA.
(2). Cắt DNA bởi enzyme giới hạn.
(3). Điện di trên gel agarose.
(4). Dựa vào DNA marker xác định được đoạn DNA cần phân lập.
(5). Biến tính DNA thành 2 mạch đơn ngay trên gel, rồi chuyển lên màng lai phân tử. Vị trí các đoạn DNA được giữ nguyên.
(6). DNA cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ rửa để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp.
(7). Dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai DNA- mẫu dò.
6.1.1.2. Phân lập gen bằng kĩ thuật PCR
Phản ứng chuỗi polymerase được tiến hành với các primers có trình tự biết trước. Cặp primer gồm primer xuôi (sens primer) và ngược (antisens primer) được thiết kế theo trình tự gen từ ngân hàng gen. Cặp mồi chuyên biệt này được bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA. Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cùng với DNA mẫu, enzyme, dNTP, Mg++, buffer... trong thiết bị nhân DNA (máy PCR) thì đoạn gen từ phân tử DNA mẫu sẽ được khuếch đại.
Phân lập gen bằng PCR có thể được tiến hành theo các bước sau:
(1) Tách chiết và tinh sạch DNA.
(2). Thiết kế primers.
(3). Chọn điều kiện phản ứng PCR.
(4). Nhân đoạn DNA trong máy PCR để phân lập đoạn gen theo mục đích.
6.1.2.Tách dòng phân tử 6.1.2.1. Mục đích
- Tạo ra một lượng lớn bản sao một trình tự DNA xác định.
- Chọn lọc một thư viện gen.
100 6.1.2.2. Các bước của kĩ thuật tách dòng
Hình 6.1. Các bước chính trong tách dòng - Chọn và xử lí vector.
- Xử lí DNA cần tạo dòng.
- Tạo vector tái tổ hợp.
- Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
- Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gen.
6.1.3. Thư viện hệ gen và thư viện cDNA
6.1.3.1.Thư viện hệ gen Thư viện bộ gen là tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen đã được gắn vào vector. Về nguyên tắc, thư viện bộ gen được thiết lập từ bất cứ tế bào nào của sinh vật nghiên cứu.
Các bước thiết lập thư viện bộ gen:
(1) Tách chiết DNA.
(2). Cắt DNA thành những đoạn có kích thước xác định bằng RF.
(3). Gắn đoạn các DNA vào vector để tạo vector tái tổ hợp.
(4). Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
(5). Tế bào chủ nuôi cấy trên môi trường đặc và hình thành nên các dòng.
Ứng dụng:
101
- Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gen, đặc biệt cấu trúc itron, exon của một gen xác định.
- Tạo dòng các trình tự không mã hoá nằm cạnh các gen và đóng vai trò quyết định trong sự điều hoà biểu hiện gen.
6.1.3.2. Thư viện cDNA
Khái niệm: Thư viện DNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mRNA của tế bào. Khác với thư viện bộ gen, thư viện cDNA được thiết lập từ một tế bào xác định trong đó gen nghiên cứu biểu hiện thành mRNA.
Mục đích của thư viện cDNA là nghiên cứu biểu hiện một gen xác định cùng với những vấn đề liên quan như biểu hiện gen, mối tương tác giữa các gen trong quá trình sống.
Các bước thiết lập thư viện cDNA:
(1) Chọn vector.
(2). Tách chiết mRNA.
(3). Tổng hợp cDNA nhờ enzyme sao mã ngược.
(4) Tạo vector tái tổ hợp gồm plasmid và cDNA.
(5) Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn.
(6) Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng, sau chuyển sang đặc. Các dòng vi khuẩn sẽ hình thành các khuẩn lạc.
(7) Phát hiện dòng cần tìm.
Ứng dụng thư viện cDNA
- Nghiên cứu quá trình hoạt hoá của các gen trong từng thời kì sinh trưởng phát triển ở trong từng loại mô, cũng như tốc độ hoạt động của nó, trên cơ sở đó biết được vai trò tác động của các yếu tố môi trường, để tác động các biện pháp kỹ thuật thích hợp nhằm tạo điều kiện cho gen biểu hiện được khả năng tối đa của mình.
- Nghiên cứu cấu trúc và số lượng từng intron và exon của một gen bằng lai DNA với RNA của cùng gen đó.
- Dùng vector cDNA tái tổ hợp để tổng hợp lên protein nhân tạo trong ống nghiệm, sản xuất enzyme và dược liệu công nghiệp.
- Dùng cDNA gắn vào T-DNA plasmid trong chuyển nạp gen thông qua Agrobacterium.
Thành tựu nghiên cứu thư viện cDNA
- Các nhà khoa học thuộc CIAT, Colombia và Nhật Bản đã hoàn thành việc xây dựng thư viện cDNA có chiều dài phân tử đầy đủ, dưới điều kiện bình thường, nóng, khô hạn, độ độc nhôm, và những điều kiện sau thu hoạch làm tổn hại đến sinh lý cây trồng
- Bản chất di truyền của genome khoai mì khá phức tạp với chu kỳ sinh trưởng dài, do đó việc cải tiến giống khoai mì rất ít thành công.
- Áp dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống khoai mì là một chiến lược năng động. Kiến thức cơ bản về các gen điều khiển chống chịu stress sẽ vô cùng cần thiết khi tiếp cận với công nghệ sinh học, thí dụ như chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) và chuyển nạp gen.
102
- Thư viện cDNA của khoai mì là tiềm năng phục vụ cho các nhà khoa học cải tiến giống khoai mì về năng suất trong điều kiện canh tác bị stress phi sinh học; cung cấp chuỗi trình tự đầy đủ của các gen mục tiêu này và phát triển catalog của gen trong genome khoai mì
- Viện di truyền nông nghiệp Việt Nam:
+ Cho tới năm 2007 viện đã thiết lập được 14 thư viện cDNA tổng, mỗi thư viện chứa khoảng 30-40 nghìn clone; thu được 12 thư viện cDNA chọn lọc cho các tính trạng kháng đạo ôn, rầy nâu, hạn, mặn, mỗi thư viện chứa khoảng 800-1.000 clone.
+ Tách dòng tổng cộng được 184 dòng gen hoạt động mạnh trong điều kiện cực đoan; giải mã trình tự DNA và xác định trình tự amino acid của 41 dòng gen hoạt động mạnh. Ngoài ra kết quả đối chiếu với Ngân hàng gen cho thấy tất cả 41 dòng gen trên đều có vị trí xác định trên các clone genomic, BAC và PAC, trong đó có nhiều dòng gen có độ đồng nhất cao (trên 90%) với các clone cDNA của Ngân hàng Gen đã biết rõ chức năng.
+ Đã xác định được 4 dòng gen “kháng đạo ôn”, 2 dòng gen “kháng rầy nâu”, 2 dòng gen “chịu hạn”, và 3 dòng gen “chịu mặn” có thể được thiết kế thành chỉ thị phân tử tiềm năng phục vụ công tác tạo giống lúa.
6.1.4. Biểu hiện gen
6.1.4.1. Các hệ biểu hiện gen
Trong tế bào sống, biểu hiện gen được hiểu là quá trình sinh tổng hợp protein trong mối liên hệ: DNA → RNA → Protein và protein là sản phẩm biểu hiện gen.
Trong kĩ thuật di truyền, biểu hiện gen là hiện tượng protein của gen ngoại lai được tổng hợp trong tế bào chủ.
Hiện nay có 4 hệ sau hay sử dụng biểu hiện gen như Escherichia coli, Bacillus subtilis, nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) và tế bào động vật. Tuy nhiên E. coli và nấm men là hai hệ biểu hiện chính hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng.
Cho đến nay có thể nói rằng vấn đề biểu hiện gen ngoại lai vẫn còn mang tính thực nghiệm đối với từng gen, chưa có một mô hình chung cho phép biểu hiện tối ưu đối với các loại protein khác nhau trong một biểu hiện. Vì vậy, để đạt được mức độ biểu hiện cao đối với một gen ngoại lai. trong nhiều trường hợp phải nghiên cứu thăm dò với các yếu tố khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu.
Các protein biểu hiện trong các tế bào khác nguồn gốc có thể được chia thành 4 nhóm chính:
- Nhóm thứ nhất bao gồm các peptit nhỏ có độ dài dưới 80 amino acid. Đây là đoạn peptit được biểu hiện dễ dàng nhất dưới dạng protein dung hợp (fusion protein) và thường được biểu hiện trong tế bào E. coli.
- Nhóm thứ hai là các chuỗi polipeptit thường được tiết ra ngoài tế bào (như enzyme, cytokin, hormon...) có kích thước trong khoảng 80-500 amino acid. Các protein thuộc nhóm này có thể biểu hiện được trong cả 4 hệ biểu hiện.
- Nhóm thứ ba gồm các protein tiết và protein đóng vai trò thụ thể trên bề mặt tế bào có kích thước hơn 500 amino acid.
- Nhómthứ tư bao gồm tất cả các protein không tiết có kích thước lớn hơn 80 amino acid.
103
Hầu hết các protein đều có thể được biểu hiện trong tế bào E. coli nếu protein đó không quá nhỏ hoặc quá lớn, hoặc quá kị nước, hoặc chứa quá nhiều gốc cystein. Các protein nhỏ và polipeptit thường không bền vững trong tế bào chủ nên muốn biểu hiện tốt trong E. coli thì cần được gắn với một đoàn protein khác. Đoạn protein này sẽ giúp cho đoàn peptit dược bền vững trong tế bào E. coli sau đi được tổng hợp và hiện nay nó có còn được dùng như một dấu nhận biết tinh chế protein lai này. Sở dĩ các protein có chứa nhiều gốc cystein và cầu disulfit không được biểu hiện tốt trong E. coli là do môi trường bên trong tế bào E. coli có tính khử cao.
B. subtilis và nấm men mặc dù không phải là hệ được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu để biểu hiện gen ngoại lai như E. coli nhưng những hệ biểu hiện này cũng có nhiều ưu điểm đáng chú ý. Điển hình là B. subtilis có khả năng biểu hiện và tiết rất tốt protein có nguồn gốc từ Prokaryote ra ngoài môi trường nuôi cấy còn nấm men lại có những ưu điểm quan trọng của cả Eukaryote và Prokaryote. Nấm men sinh trưởng nhanh và có khả năng chế biến protein sau khi dịch mã rất tốt để trở thành dạng protein hoạt động mà hệ biểu hiện gen ở vi khuẩn không có. Hơn nữa nấm men có mức độ an toàn sinh học cao, được sử dụng nhiều trong công nghiệp dược liệu và thực phẩm. Vì vậy, nấm men rất được ưa chuộng để biểu hiện các gen của Eukaryote và gen mã hoá cho protein sử dụng trong thực phẩm và chữa bệnh.
Hệ biểu hiện trong tế bào động vật có khả năng biểu hiện được tất cả protein của 4 nhóm nhưng tốn thời gian và quá trình chọn lọc, nhân dòng và nuôi cấy dòng tế bào phức tạp hơn nên hệ biểu hiện này thường không được sử dụng rộng rãi.
Những đặc tính sinh học phân tử để điều chỉnh sự biểu hiện gen thể hiện ở (1) Đặc điểm tự nhiên của những trình tự promotor và terminator liên quan đến dịch mã;
(2) Độ mạnh yếu và vị trí bám của ribosome; (3) Số phiên bản của gen tách dòng; (4) Vị trí tổng hợp protein trong tế bào, (5) Hiệu suất của quá trình giải mã trong tế bào chủ; (6) Sự bền vững của phân tử protein được mã hoá bởi gen tách dòng trong tế bào chủ.
Mức độ biểu hiện gen ngoại lai (foreign gen) còn phụ thuộc vào sự nhận biết của cơ thể vật chủ. Hiện nay đã có phổ rất rộng các cơ thể biểu hiện gen ngoại lai (cả Prokaryote và Eukaryote) nhưng đa số các sản phẩm được sản xuất bởi công nghệ DNA tái tổ hợp được tổng hợp ở E. coli.
6.1.4.2. Kĩ thuật biểu hiện gen
Gen được biểu hiện là gen đã được phân lập và đã biết trình tự. Các gen này có thể được phân lập bằng các phương pháp khác nhau. Sau khi có đoạn gen mong muốn chúng sẽ được biểu hiện trong các hệ thích hợp theo các bước xác định.
Bước 1: Lựa chọn hệ thích hợp để biểu hiện gen.
Bước 2: Dựa vào trình tự gen, thiết kế các đoạn mồi để nhân gen. Tổng hợp mồi.
Bước 3: Chuẩn bị DNA không để nhân gen.
Bước 4: Nhân gen bằng PCR từ DNA hệ gen của vi khuẩn hoặc từ ngân hàng cDNA nhưng tốt nhất là nhân gen trực tiếp từ chính plasmid mang gen đã từng dùng để đọc trình tự gen đó.
Bước 5: Đưa gen vào vector tách dòng và biến nạp vào tế bào E. coli để khuếch đại dòng gen.
104
Bước 6: Tách plasmid từ các thể biến nạp E. coli. Kiểm tra gen trong vector tách dòng bằng enzym hạn chế. Kiểm tra gen và đặc biệt là chiều của gen trong vector biểu hiện. Gen cần biểu hiện phải nằm đúng chiều của prromotor.
Bước 7: Đưa gen vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào E. coli..
Bước 9: Biến nạp vector biểu hiện có mang gen vào tế bào chủ (E. coli hoặc nấm men). Bắt đầu từ bước này, các thao tác để biểu hiện gen ở các chủng khác nhau là khác nhau.
Bước 10: Kiểm tra sự biểu hiện của gen.