Chương 2 HỆ GEN - ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT ĐỘNG CỦA GEN
2.3. Hoạt động của gen
2.3.1. Cơ chế tái bản và sửa chữa DNA
Một trong những đặc tính quan trọng của cơ thể sống là đặc tính tự sinh sản ra những cơ thể mới mang các tính trạng hình thái sinh lý giống bố mẹ. Đặc tính đó dựa trên cơ sở sự tái bản (replication) của phân tử DNA, qua đó một phân tử DNA mẹ đã sinh ra 2 phân tử DNA con, giống hệt DNA mẹ và thông qua cơ chế phân bào, 2 phân tử DNA con được phân ly về 2 tế bào con, do đó mà 2 tế bào con mang đặc tính di truyền như tế bào mẹ.
2.3.1.1. Quá trình tái bản a. Các kiểu tái bản DNA
Người ta đưa ra 3 giả thuyết về các kiểu tái bản DNA:
Kiểu bảo toàn: Chuỗi DNA mẹ giữ nguyên, DNA mới được tổng hợp từ nguyên liệu (chưa có bằng chứng trong tự nhiên).
Kiểu phân tán: DNA ban đầu đứt ra từng đoạn nhỏ, mỗi đoạn nhỏ làm khuôn để tổng hợp các đoạn nhỏ khác. Các đoạn nhỏ nối lại với nhau thành DNA.
Kiểu bán bảo toàn:Watson và Crick cho rằng nếu hai sợi DNA tách rời nhau, mỗi sợi có thể sẽ được sử dụng làm khuôn để tổng hợp một sợi mới vì các base luôn có xu hướng bắt cặp với nhau theo nguyên tắc: A liên kết với T bằng hai liên kết hidro, G liên kết với C bằng ba liên kết hidro và ngược lại.
Những thí nghiệm của Meselson và Stahl (1957) đã chứng minh lý thuyết tái bản DNA theo kiểu bán bảo toàn (Hình 2.3). Các tác giả trên đã nuôi cấy E. coli qua nhiều thế hệ trong một môi trường chứa 15NH4Cl là nguồn cung cấp nitrogen duy nhất. Bằng cách này, DNA được tổng hợp có 15N (15N là một chất phóng xạ nặng hơn chất phóng xạ thông thường 14N). Ở một thời điểm nhất định (thời điểm 0), các tác giả này đã chuyển nuôi cấy vào một môi trường chứa 14NH4 Cl. Tiếp đến, sau từng thời gian đều đặn, họ phân tích DNA chiết xuất từ vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm theo gradient CsCl.
Hình 2.3. Thí nghiệm của Meselson và Stahl (1957) Kết quả thực nghiệm cho thấy:
- Ở thời điểm 0: chỉ có một phân tử tương ứng với DNA nặng 15N.
34 - Sau một thế hệ trong môi trường chứa 14N: những phân tử DNA gồm một chuỗi nặng 15N (chuỗi mẹ) và một chuỗi nhẹ 14N (mới được tổng hợp).
- Sau hai thế hệ trong môi trường chứa 14N: có hai phân tử lai (gồm một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ) và hai phân tử đều gồm những chuỗi nhẹ không có chuỗi nặng.
Thí nghiệm trên đã chứng minh giả thuyết của Watson- Crick là chính xác. Quá trình tổng hợp DNA phải được thực hiện theo khuôn, hai mạch ban đầu được tách ra, mỗi mạch làm khuôn để tổng hợp sợi mới. Kết quả là mỗi phân tử con đều mang một mạch cũ và một mạch mới. Kiểu sao chép như vậy được gọi là “ sao chép bán bảo tồn”
(semi- conservation)
b. Thành phần tham gia - DNA mẹ dùng làm khuôn.
- Nguyên liệu: Các nucleotide - Tri - photphas (dATP, dGTP, cDTP và dTTP).
- Các loại protein: Tham gia tái sinh DNA có nhiều loại protein đặc hiệu như protein SSB, protein Dna ....
- Hệ enzyme tham gia tái bản DNA:
+ Helicase : tháo xoắn DNA
+ DNA – ligase: Nối các đoạn okazaki
+ RNA – polymerase (primase) : Tổng hợp mồi + Ba loại enzyme DNA-polymerase ở E.Coli
1. DNA-polymeraseI: giữ vai trò trong tái bản DNA, có thể dễ sửa chữa.
2. DNA-polymeraseII: xác định sự bắt đầu tổng hợp DNA.
3. DNA-polymeraseIII: điều khiển tổng hợp DNA, thực hiện nhiệm vụ chủ yếu gia tăng chiều dài của một sợi mới.
+ Ba loại enzyme DNA-polymerase ở Eukaryote
1. DNA-polymerase α (120.000- 300.000dalton) có chức năng tái bản DNA của nhân.
2. DNA-polymerase β (30.000-50.000dalton) sửa đổi DNA.
3. DNA-polymerase γ (150.000-300.000dalton) tái bản hệ gen ti thể.
c. Cơ chế tái bản DNA theo Okazaki-Tái bản nửa gián đoạn
Hình2.4: Tái bản DNA theo Okazaki
35 Cơ chế và quá trình tái bản nửa gián đoạn được tóm tắt như sau:
Hiện tượng duỗi xoắn, khởi đầu tái bản bằng RNA mồi (primer)
Phân tử DNA được duỗi xoắn và mở xoắn thành hai mạch đơn tạo nên chạc ba tái bản (hình chữ Y) lộ ra hai mạch khuôn nhờ 2 enzyme gyrase và helicase.
+ Enzyme Gyrase hay còn gọi là enzyme topoisomerase chức năng làm duỗi xoắn.
+ Enzyme helicase có tác dụng làm đứt các liên kết hydro giữa hai mạch và tách thành 2 mạch đơn.
Protein là SSB (single stranded binding protein) bám vào sợi đơn DNA luôn ở trạng thái mở xoắn, mỗi SSB bám vào 8 base và mỗi chạc tái bản có 250 SSB.
RNA polymerase hoạt động tổng hợp đoạn RNA mồi ngắn tạo ra đầu 3'OH tự do, sau đó DNA polymerase III hoạt động tái bản. Đối với E.coli primer được tạo ra bởi enzyme primase.
Tổng hợp: Kéo dài, loại bỏ mồi và hình thành các phân đoạn Okazaki
Giai đoạn ḱéo dài bao gồm sự tổng hợp cùng một lúc hai chuỗi DNA. Một chuỗi được tái bản cùng hướng phát triển của chạc ba sẽ liên tục (sợi chủ), còn chuỗi kia sẽ không liên tục bao gồm các đoạn Okazaki (sợi thứ). Các nucleotide gắn vào đầu 3’ tự do, và không dài chuỗi ra nhờ enzyme DNA polymerase III theo chiều 5’3’. Trong giai đoạn này, nhiều enzyme đã tham gia vào sự tổng hợp hai chuỗi DNA tại chạc tái bản. DNA helicase tiếp tục tách hai chuỗi DNA mẹ, DNA gyrase mở xoắn, protein SSB ổn định những chuỗi DNA đơn đã được tách ra, DNA ligase gắn các đoạn Okazaki trên sợi thứ.
Chuỗi DNA xoắn kép như vậy được tách đôi ở các vị trí sẽ xảy ra sinh tổng hợp, hình thành các chạc ba. Cả hai chuỗi DNA mạch đơn đều được sử dụng làm khuôn mẫu cùng một lúc. Trên một chuỗi, sinh tổng hợp sẽ diễn ra theo chiều từ 5’3’ cùng chiều với chiều phát triển của chạc tái bản. Trên sợi còn lại, sinh tổng hợp vẫn diễn ra theo chiều 5’3’ nhưng ngược chiều với chiều phát triển của chạc tái bản, và chỉ thực hiện được từng đoạn ngắn khoảng 1000 nucleotide (đoạn Okazaki). Trong khi di chuyển từng quãng, enzyme primase sẽ tổng hợp những đoạn RNA primer ngắn (111 nucleotide) để từ đó DNA được tiếp nối nhờ DNA polymerase III. Khi đoạn Okazaki mới được hoàn chỉnh, RNA primer được tách ra nhờ DNA polymerase I (hoạt tính exonulease 5’3’) và được thay thế bởi DNA cũng nhờ tác dụng của cùng enzyme. Các khe hở còn lại giữa các đoạn Okazaki được DNA ligase gắn và DNA trở lại dạng chuỗi xoắn kép: một phân tử DNA mới được hình thành.
Kết thúc
Cuối cùng, hai chạc ba tái bản gặp nhau ở phía đối diện của nhiễm sắc thể vòng của E. coli. Người ta biết rất ít về những phản ứng của giai đoạn này. Có thể hoạt động của một loại DNA topoisomerase là cần thiết để tách hai phân tử DNA vòng đã được tổng hợp. Quá trình phân đôi hai phân tử DNA trong tế bào con khi phân chia tế bào cũng chưa được biết rõ.
* Lưu ý
- Mạch DNA mới được tổng hợp theo chiều 5'- 3', một mạch polinucleotide được tổng hợp liên tục và một mạch được tổng hợp gián đoạn.
- Mỗi bước của quá trình tái bản đều có sự tham gia của các loại enzyme tương ứng.
36 - Quá trình liên kết với các nucleotide thực hiện theo nguyên tắc bổ sung
-Có sự tham gia của primer (RNA mồi).
- Mỗi DNA con được tạo thành đều chứa một mạch cũ và một mạch mới d. Cơ chế tái bản ở eukaryote
Sự tái bản ở tế bào eukaryote phức tạp hơn so với ở tế bào prokaryote nhưng cơ chế của sự tái bản ở eukaryote cung tương tự như ở prokaryote và tiến hành theo các nguyêntắc:
- Hai hướng.
- Bổ sung, đối song song, theo chiều 5’3’.
- Không liên tục ở một trong hai chuỗi.
- Cần những RNA primer.Tuy nhiên, có một số điểm khác như sau:
- Trong khi ở prokaryote chỉ có một điểm khởi đầu, thì sự tái bản ở eukaryote bắt đầu cùng một lúc ở nhiều điểm khởi đầu. Điều này là cần thiết do DNA của eukaryote có chiều dài rất lớn.
- Vận tốc phát triển của chạc ba tái bản ở eukaryote (khoảng 50 nucleotide/s) chỉ bằng 1/10 so với ở E. coli.
2.3.1.2 Quá trình sửa chữa DNA
Phân tử DNA có thể bị biến đổi trong quá trình sao chép hoặc ngay cả khi không sao chép, dù trong trường hợp nào các cơ chế sửa sai cũng luôn xuất hiện kịp thời.
Nhiều các sai hỏng nằm ngoài tầm kiểm soát của các cơ chế sửa chữa, chúng có thể được di truyền cho thế hệ sau.
a) Cơ chế phòng ngừa
Tế bào có những hệ thống ngăn chặn tác hại có thể có của nhiều chất chuyển hoá trong hay ngoài tế bào xâm nhập vào: các ion H+, …Có các hệ thống khử bằng NADPH2, Glutathion và sinh tố E. Ngoài ra ở sinh vật đa bào việc khử độc và loại bỏ nhiều hoá chất gây độc được tiến hành bởi gan và thận. Hiện nay người ta đã biết đến hàng trăm protein tham gia vào quá trình sửa sai DNA.
b. Cơ chế đảm bảo sự trung thành trong sao chép
* Cơ chế đọc sửa – Proofreading repair:
Sự tổng hợp DNA theo nguyên tắc khuôn và bổ sung xảy ra rất chính xác với tần số sai sót chỉ khoảng 10-9(cứ 109 nucleotit được tái bản có một sai sót). Tần số này nhỏ hơn rất nhiều lần so với tần số sai sót do sự bắt cặp sai lệch giữa các base trong quá trình tái bản, ví dụ bắt cặp sai T-G hay C-A với tần số khoảng 10-5. Sự giảm thiểu tần số sai sót là do có cơ chế sửa chữa DNA trong quá trình tái bản cho phép loại trừ những cặp base sai lầm, được gọi là cơ chế “đọc sửa” (proofreading repair).
Sự phát hiện và loại bỏ các cặp base liên kết sai nguyên tắc bổ sung là phụ thuộc vào đặc tính của enzym DNA polimerase. Chức năng chủ yếu của các DNA polimerase là xúc tác tổng hợp DNA nhưng chúng lại không có khả năng khởi động sự gắn kết hai nucleotide với nhau để tổng hợp sợi mới. Để thực hiện được việc này đòi hỏi phải có đoạn mồi, khi đã có đoạn mồi DNA polimerase sẽ lắp ráp các nucleotide tạo cặp bổ sung trên sợi khuôn bằng cách gắn vào vị trí 3’ nhờ liên kết photphodieste giữa nhóm OH và gốc photphas. Mọi sự ghép cặp không tuân theo nguyên tắc bổ sung đều được chúng phát hiện, cắt bỏ và loại trừ. Chính liên kết bổ sung của nucleotit cuối
37 cùng tại đầu 3’ của đoạn mồi với khuôn đóng vai trò quyết định để DNA polimerase nhận biết các bắt cặp sai và tự sửa chữa.
* Sửa chữa ghép đôi lệch
Sửa chữa ghép đôi lệch (mismatch-repair) giữa các sợi DNA là một trong những mục tiêu chính của hệ thống sửa sai. Sửa chữa ghép đôi lệch được tiến hành khi phát hiện trên DNA các base nằm cạnh nhau mà không bắt cặp thích hợp. Các ghép đôi lệch tăng lên trong suốt quá trình tái bản được sửa chữa bằng cách phân biệt giữa các sợi cũ và mới và được ưu tiên sửa chữa trình tự của các sợi được tổng hợp mới. Ghép đôi lệch được tạo ra bởi các biến đổi base, là một kết quả của sự khử amine (deamination).
Ghép đôi lệch thường được sửa sai bằng phương thức sửa chữa cắt bỏ, được khởi đầu bằng một enzyme nhận biết một base sai hỏng thực sự hoặc có sự thay đổi chiều hướng không gian (spatial path) của DNA.
Sự nhận biết và sửa chữa các sai lệch do bắt cặp base sai trên DNA được phát hiện ở E. coli, nấm men và tế bào động vật có vú. Ở vi khuẩn E. coli, có ba hệ thống enzyme khác nhau được sử dụng để sửa chữa các sai lệch bằng cách:
- Loại bỏ chỗ sai trong tái bản (errors in replication).
- Loại bỏ ghép đôi lệch bên trong các đoạn trung gian của tái tổ hợp (mismatchwithin recombinant intermediates)
- Loại bỏ thymine của cặp GT trong trường hợp 5-methylcytosine bị mất nhóm amine (NH2) thành thymine.
2.3.1.3. Các biến đổi của DNA: đột biến, tái tổ hợp, các yếu tố di truyền vận động a. Các tác nhân gây đột biến
Tác nhân thường do môi trường sinh ra, chúng xảy ra với tần số nhất định và xuất hiện cả ở tế bào sinh dục cũng như tế bào sinh dưỡng. Các tác nhân sau có thể gây ra đột biến vật chất di truyền :
- Các tia phóng xạ ion hoá như tia γcó thể gây ion hoá làm biến đổi các basebase, cắt đứt các mạch...
- Tia cực tím trong ánh sáng mặt trời gây nên sự dimmer hoá các thymin hình thành nên 2 liên kết bất thường, khiến nó mất khả năng liên kết với adenin.
- Các chất hoá học: có thể tương tác với DNA làm biến đổi cấu trúc các basebase, vì vậy thường xảy ra sự bắt cặp nhầm giữa các basebase.
b. Đột biến gen (còn gọi là đột biến điểm)
Đột biến gen là những biến đổi xảy ra trong một gen, thể hiện sự thay đổi một vài nucleotit hay một vài codon. Đột biến bao gồm các dạng
- Đột biến đồng nghĩa: Một nucleotit thứ 3 trong codon bị thay đổi nhưng vẫn mã hoá cho ra axitamin đó.
- Đột biến sai nghĩa: Khi đột biến codon bị thay thế bằng codon khác. Làm thay đổi bản chất của protein so với ban đầu.
- Đột biến làm thay đổi khung đọc: Là đột biến xảy ra khi mất đi hoặc chèn các base làm sai lệch khung đọc, đột biến mang lại hậu quả nghiêm trọng nếu xảy ra ở đầu 5’.
- Đột biến vô nghĩa: Bộ ba mã hoá cho axitamin bị thay đổi trở thành một trong những bộ ba kết thúc UAA, UAG, UGA. Dạng đột biến này làm mất đoạn trong sợi polypeptid do quá trình tổng hợp protein bị ngừng lại
38 c. Đột biến nhiễm sắc thể
+ Đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể : do đứt đoạn thường gây nên các hậu quả sau:
- Mất đoạn: ví dụ ở người bệnh máu trắng là do nhiễm sắc thể 22 bị mất đoạn.
Nếu mất một đoạn dài NST có thể gây ra tử vong vì mất cân bằng di truyền bộ gen - Đảo đoạn: Làm thay đổi vị trí nhiễm sắc thể 1800
- Lặp đoạn: Một đoạn nào đó của nhiễm sắc thể tăng lên, không gây hậu quả nghiêm trọng mà có lợi cho tiến hoá.
+ Đột biến số lượng nhiễm sắc thể (Đa bội thể) d. Tái tổ hợp
Quá trình tái tổ hợp di truyền khi trao đổi chéo tạo nên tính đa dạng giữa các cá thể trong loài. Các hình thức trao đổi chéo gồm có:
- Trao đổi chéo tương đồng: xảy ra khi cặp nhiễm sắc thể tương đồng trao đổi đoạn DNA cho nhau
- Trao đổi chéo đặc hiệu: Xảy ra ở vị trí đặc hiểu trên DNA, quá trình này đòi hỏi phải có các enzym tham gia, đó là những đoạn bất kỳ không nhất thiết phải tương đồng, không đòi hỏi sự tạo cặp bổ sung giữa các sợi đơn của phân tử DNA.
- Trao đổi chéo sai lệch: Là sự thêm đoạn, mất đoạn hoặc nối không đúng các đoạn DNA với nhau trong quá trình tái bản hoặc trao đổi chéo không cân giữa các nhiễm sắc thể
e. Các yếu tố di truyền vận động
Khái niệm:
Trong genome đã phát hiện ra sự chuyển dịch của những đơn vị vật chất di truyền từ vùng này tới vùng khác trên một nhiễm sắc thể, hay giữa các nhiễm sắc thể với nhau. Hiện tượng này gọi là hiện tượng chuyển vị (transposition), các yếu tố di truyền tham gia vào sự chuyển vị gọi là các yếu tố di truyền di động, hay gọi tắt là các yếu tố di truyền động - Yếu tố nhảy (các gen nhảy).
Các yếu tố di truyền vận động ở prokaryote: Trình tự đoạn xen (insertion sequence) của vi khuẩn Trình tự xen đoạn là một đoạn DNA của vi khuẩn di chuyển từ một vị trí trên nhiễm sắc thể đến vị trí mới trên cùng nhiễm sắc thể hoặc trên nhiễm sắc thể khác. Khi xen vào giữa gen, yếu tố IS làm gián đoạn trình tự mã hóa và làm bất hoạt sự biểu hiện của gen. Một số trường hợp, có tín hiệu kết thúc phiên mã và dịch mã, yếu tố IS làm cản trở sự biểu hiện ở sau promotor trong cùng operon.. Yếu tố IS được tìm thấy đầu tiên ở operon gal của E. coli, chia làm bốn nhóm: IS1, IS2, IS3 và IS4. Chúng có thể phân bố rãi rác trên nhiễm sắc thể chính của vi khuẩn và trên các plasmid. Ví dụ yếu tố IS1 có khoảng 5-8 bản sao trên nhiễm sắc thể với chiều dài 768 bp. Tất cả các yếu tố IS đều chứa đoạn DNA mã hóa cho protein, được gọi là transposase, là enzyme cần thiết cho sự di chuyển của yếu tố IS từ một vị trí trên nhiễm sắc thể đến vị trí khác. Đoạn gen này nằm giữa 2 đoạn lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR) ngắn. Ví dụ yếu tố IS1 có khoảng 5-8 bản sao trên nhiễm sắc thể với chiều dài 768 bp, đoạn lặp lại đảo ngược có kích thước 18-23 bp, yếu tố IS2 có 5 bản sao và các yếu tố IS khác. Yếu tố IS là những vùng của các trình tự xác định, chúng là những vị trí xảy ra trao đổi chéo. Ví dụ: Sự tái tổ hợp của plasmid và nhiễm sắc thể của E. coli tạo ra những chủng Hfr xảy ra qua trao đổi chéo đơn giữa yếu tố IS trên plasmid và yếu tố IS trên nhiễm sắc thể