Chương 5. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID VÀ PHẢN ỨNG PCR
5.2. Các phương pháp phân tích định tính và định lương thô nucleic acid
5.3.4. Các phiên bản của PCR và ứng dụng trong thực tiễn
* PCR lồng (Nested-PCR): Sản phẩm DNA của phản ứng PCR thứ nhất được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR thứ hai với khoảng cách (tính bằng bp) giữa hai mồi lần sau ngắn hơn lần trước. Cách tiến hành như vậy nhằm làm tăng tính đặc hiệu, chính xác cho sản phẩm cần nhân bản. Các đoạn DNA không đặc hiệu có thể được tạo ra trong lần PCR thứ nhất nhưng rất khó trở thành khuôn trong lần PCR thứ hai do các sản phẩm đặc hiệu chiếm ưu thế tuyệt đối.
* PCR phức (Multiplex PCR): Phương pháp này sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR để thu được cùng một lúc các băng đặc hiệu cho từng cặp. Nhờ đó giảm được thời gian thí nghiệm cũng như hạn chế việc nhiễm mẫu do thao tác. Ví dụ, bệnh teo cơ Duchenne (DMD) gây ra do thiếu hụt các đoạn DNA ở gen tương ứng.
Gen này dài khoảng 2000 kb gồm 70 exon (kích thước trung bình của intron khoảng 35 kb). Sự mất đoạn chủ yếu xảy ra ở hai vị trí trên gen (các vị trí nhạy cảm đột biến).
Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu của từng exon trong cùng một phản ứng PCR phức, có thể phát hiện được 80-90% bệnh nhân teo cơ do mất đoạn.
* PCR đảo (Inverse-PCR): Dùng phương pháp này để phân lập những phần nằm trước hoặc sau một đoạn DNA đã biết. Từ đó phân tích được chuỗi nucleotide nằm trước hoặc sau của một gen. Đầu tiên DNA genome được cắt bởi enzym giới hạn tạo ra các đoạn DNA khác nhau. Sau đó, các đoạn DNA được nối lại thành dạng vòng và sử dụng như DNA khuôn cho phản ứng PCR với hai oligo xuất phát từ phần DNA đã biết. Phương pháp này tương tự như phương pháp đi trên nhiễm sắc thể. Nó được ứng dụng để xác định promoter hoặc các đoạn nucleotide làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động của gen.
* PCR ngược (Reversed-PCR): Phản ứng này nhằm nghiên cứu số lượng RNAm, làm giàu các RNAm hiếm trong tế bào. Đầu tiên RNA tổng số hoặc RNAm được dùng làm khuôn để tổng hợp DNAc nhờ enzym reverse transcriptase. Sau đó các sợi đơn DNAc được tổng hợp thành sợi kép nhờ Taq polymerase. DNAc dạng sợi kép được sử dụng làm khuôn trong phân đoạn DNA chứa intron tạo ra do nhiễm DNA
96
genome với các đoạn nhân lên từ RNAm (DNAc). Chỉ cần 1 μg RNA tổng số (~106 tế bào) đủ để nhân bản phân tử RNAm hiếm (1-10 copies/tế bào).
* PCR tái tổ hợp: được áp dụng để xây dựng phân tử DNA tái tổ hợp, đưa vào hoặc bỏ đi hoặc thay thế các nucleotide trong một đoạn DNA.
* Nhân ngẫu nhiên các đoạn DNA bằng PCR (RAPD-PCR)(Random Amplified Polymorphic DNA-PCR): Dựa vào các minisatellite hoặc các microsatellite (VNTRs) đã biết để tìm được các đoạn nucleotide nằm trước và sau các VNTR này.
Chúng được dùng làm mồi trong phản ứng PCR. Sản phẩm thu được là những băng DNA có kích thước khác nhau. Phản ứng có thể dùng một mồi riêng biệt. Phương pháp này hay được sử dụng để xây dựng cây phân loài.
5.3.4.2. Ứng dụng PCR trong thực tiễn PCR có những ứng dụng sau:
* Dùng để nghiên cứu quá trình tiến hoá giữa các loài sinh vật và nhân những đoạn DNA (đoạn gen) đặc trưng cho từng loài sinh vật. Trong quá trình tiến hoá trải qua bao niên đại đã tạo ra vô vàn các loài sinh vật trên thế giới rất đa dạng và phong phú như hiện nay. Vậy bản chất của quá trình tiến hoá đứng ở góc độ phân tử là gì?
Hiện nay về vấn đề này đã được sáng tỏ, có nghĩa là các loài, các chi càng gần nhau về mặt tiến hoá thì càng có nhiều đoạn DNA giống nhau, nhiều đoạn DNA đã cùng được tìm thấy ở rất nhiều loài. Tuy vậy mỗi loài đều có một số đoạn DNA đặc thù riêng mà các loài khác không bao giờ có, chính điều này đã phân tách giữa các loài với nhau, công nghệ DNA phân tử đã phục vụ đắc lực cho mục đích này.
* Dùng để phát hiện kiểu đột biến, để phát hiện kiểu đột biến người ta điện di sản phẩm DNA nhân từ phương pháp PCR trên gel, nếu là đột biến mất hay tăng đoạn lớn, hoặc phải xác định trình tự sắp xếp các base trên đó và kết luận nếu nó thuộc vào kiểu đột biến đảo đoạn hay đột biến điểm.
* Chẩn đoán các bệnh ung thu và bệnh di truyền. Hiện nay nguời ta đã dự đoán được khoảng 1/3 số bệnh ở nguời ít nhiều có liên quan đến gen, và nhiều gen đã đuợc định vị trên từng nhiễm sắc thể, thí dụ bệnh mù màu và bệnh chảy máu không đông nằm trên nhiễm sắc thể giới tính X. Có khoảng 600 trong số 3500 bệnh di truyền nằm cả trên nhiễm sắc thể thường đã được nghiên cứu và sáng tỏ cơ chế hoá sinh của bệnh lý. Bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm do gen lặn đột biến ảnh hưởng sai hình tới cấu trúc chuỗi -globin của hemoglobin. Trong bệnh giảm trí nhớ (phenylketonuria) ở người do đột biến lặn đồng hợp tử mất khả năng tổng hợp enzym phenylalanine hydroxylase.
Đối với bệnh di truyền do đột biến lặn có kiểu mang và kiểu bị bệnh, mang bệnh có nghĩa là tại locus đó có một trong số 2 alen bị đột biến lặn. Nếu cấu trúc phân tử của đoạn gen qui định tính trạng bị bệnh và không bị bệnh, hoặc đoạn DNA nào đó có liên kết được xác định thì có thể dễ dàng dùng kỹ nghệ DNA để chẩn đoán sớm và chữa bệnh, cũng như khuyên răn những người mang gen bị bệnh không nên lấy nhau để tránh hậu quả sẽ có 1/4 số đứa con của họ có thể bị bệnh di truyền này.
* Phát hiện bệnh trong chăn nuôi cũng như trong trồng trọt. Áp dụng kỹ thuật PCR sản xuất bộ KIT chuẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm, bệnh vàng lá gân xanh.
Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học- Đại học Cần Thơ.
* Dùng để phát hiện sự xâm nhiễm, tiềm ẩn của vi khuẩn, nấm và virut trong cơ thể kí chủ. Như chúng ta đã biết có rất nhiều tác nhân gây bệnh khi xâm nhập vào cơ thể ký chủ cha biểu hiện ra triệu chứng ngay, thường có thời gian tiềm dục dài ngắn
97
khác nhau, thậm chí có một số kí sinh bệnh không biểu hiện triệu chứng điển hình tùy đối tượng ký chủ. Việc phát hiện sớm cây con nhiễm bệnh có ý nghĩa to lớn.
Bác sĩ Lê Nhật Minh, Phan Lê Thanh Hương và Lê Thị Kim Tuyến đã sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định một số vi khuẩn là căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em. Kỹ thuật PCR sử dụng một cặp mồi chung cho phép nhân lên một đoạn DNA có kích thước 996bp trên gen mã hóa cho yếu tố 16S ribosom của 11 loài vi khuẩn, sau đó sản phẩm PCR được cắt bằng enzim Hae III kết quả đã phân biệt được 11 loài vi khuẩn chuẩn khác nhau và xác định chính xác 9 loài vi khuẩn là căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em. (Trích Hội nghị Khoa học – 2006 – Viện Pasteur TP.HCM)
Hiện nay rất nhiều kí sinh bệnh đã được nghiên cứu ở mức DNA phân tử chính vì vậy chúng ta có thể dễ dàng dùng kĩ nghệ DNA để chẩn đoán sớm được bệnh trong trường hợp mà bằng phương pháp thông thường khó chẩn đoán được. Trên cơ sở biết thông tin phân tử của kí sinh có thể chọn đoạn đặc hiệu nào đó, thiết kế đoạn mồi rồi nghiên cứu, so sánh đối chiếu triệu chứng bệnh, đặc tính gây nhiễm cho từng giống, sự sai khác về cấu trúc phân tử của các kí sinh từ các nguồn khác nhau có thể tìm ra được các chủng virut và nòi sinh lý gây bệnh mới.
Tang và ctv (2000) đã dùng kỹ thuật PCR competitive để định lượng WSSV (White Spot Syndrome Virus) nhiễm trong Penaeus monodon Fabricius để phân loại giai đoạn nhiễm WSSV thành mức độ nhẹ, trung bình và nặng, từ đó có cách xử lý thích hợp làm giảm thiệt hại trong nghề nuôi tôm (Tang, K. F. J., Lightner D. V.,2000.
Quantification of white spot syndrome virus DNA throught a competitive polymerase chain reaction. Aquaculture, 189:11-21)
* Dùng để xác định giới tính đực cái ngay từ giai đoạn phát triển sớm của hợp tử.
Bằng cách chọn đoạn DNA nào đặc thù đã biết trước đối với từng nhiễm sắc thể giới tính rồi tiến hành thiết kế 2 đoạn mồi, lấy mẫu DNA từ hợp tử rồi nhân PCR. Nguyễn Thị Thu Lan, Nguyễn Hoàng Chương, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc. 2003. Xác định giới tính ở heo bằng kỹ thuật PCR. * Dùng PCR để xác định mối liên kết giữa các tính trạng nông sinh học phục vụ cho công tác chọn tạo giống cây con mới.
* Dùng trong cảnh sát để phát hiện tội phạm. Thí dụ khi 2 thủ phạm bị tình nghi giết người, hiện trường để lại chỉ là vết máu chả biết của ai bằng phân tích DNA của hai người và vết máu sẽ là bằng chứng kết luận chính xác thủ phạm.
* Dùng để nghiên cứu sự đa hình về DNA của những kiểu gen khác nhau, sử dụng làm đánh dấu phân tử trong chọn giống. Trần Thanh Mến đã sử dụng kỹ thụât PCR-RFLP để nghiên cứu đa dạng sinh học các giống bưởi (Citrus maxima (Burm.) Merr.) ở Việt Nam. Thực hiện phản ứng PCR với 2 cặp mồi ITS 1 và ITS 2; ITS 1 và ITS 4. Các sản phẩm PCR của từng cặp mồi được cắt bằng 6 enzim giới hạn SmaI, EcoRI, HindIII, PstI, BamHI, KpnI. Dựa vào kết quả thu được ta xác định được mối tương quan di truyền của các giống cây này.
* Xác định cây tái tổ hợp trong chuyển nạp gen, con lai xa, con lai F1, các kiểu gen tự bất hợp, nghiên cứu dẫy alen, các kiểu bất dục đực tế bào chất, và bất dục nhân.
* Việc kết hợp giữa 2 phương pháp RFLP và PCR đã có ứng dụng rất rộng rãi trong chọn giống nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng. Tóm tắt phương pháp này như sau: Từ bản đồ liên kết giữa gen qui định tính trạng nông sinh học nào đó (ví dụ như chống hoặc mẫm cảm bệnh) liên kết chặt với 1 RFLP nào đó chẳng hạn, khoảng
98
cách liên kết phải chặt từ 0,1 - 0,5 cM). Đầu tiên người ta xác định trình tự sắp xếp các nucleotide của RFLP probe đó, sau đó chọn một đoạn DNA đặc hiệu của chuỗi DNA của RFLP đó, tiến hành thiết kế 2 đoạn mồi, nhân bằng PCR tạo ra sản phẩm DNA rồi điện di, nếu thấy có sự sai khác giữa 2 kiểu gen tương ứng thì dừng tại đây, nếu không thì lấy DNA sản phẩm của PCR xử lí 1 hoặc vài enzyme cắt hạn chế thích hợp, sau đó chạy điện di thì có thể tìm ra được sự sai khác giữa hai kiểu gen.
Câu hỏi ôn tập
Câu 1: Trình bày phương pháp tách chiết DNA tổng số.
Câu 2: Trình bày phương pháp tách chiết RNA tổng số.
Câu 3: Trình bày phương pháp tách chiết mRNA.
Câu 4: Trình bày mục đích, cơ sở khoa học và ưu, nhược điểm của phương pháp định lượng DNA, RNA bằng quang phổ kế.
Câu 5: Điện di là gì? Trình bày nguyên lý của phương pháp điện di.
Câu 6: Trình bày phương pháp điện di trên gel agrose
Câu 7: Trình bày phương pháp điện di trên gel polyacrylamid Câu 8: PCR là gì? Trình bày cơ sở khoa học của PCR.
Câu 9: Trình bày nguyên lý của phương pháp PCR.
Câu 10: Phân tích ứng dụng PCR trong đời sống?
99