Chương 4: MỘT SỐ ENZYME VÀ VECTOR TẠO DÒNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ
4.2. Vector trong sinh học phân tử
4.2.3. Một số loại vector dùng trong chuyển nạp gen
4.2.3.1. Plasmid
Plasmid là các thông tin di truyền ngoài nhân có trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA mạch vòng, sợi đôi, kích thước từ 1- 200 kb, có khả năng tự sao chép để tồn tại độc lập trong tế bào. Các plasmid có thể mang một số gen của vi khuẩn và các gen này có thể biểu hiện ra protein.
Plasmid mang các gen mã hóa cho các enzyme thường có lợi cho vi khuẩn vật chủ. Các plasmid có thể mang các kiểu hình khác nhau như: kháng kháng sinh, sản xuất kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp, sản xuất các enzyme hạn chế và enzyme biến đổi (modification enzymes).
Các plasmid có thể được chuyển vào trong vi khuẩn sau khi vi khuẩn được xử lý để tế bào có thể cho plasmid thấm qua. Quá trình này được gọi là sự biến nạp (transformation). Vi khuẩn được biến nạp thành công có thể được chọn lọc dựa trên kiểu hình mới mà chúng nhận được từ plasmid, như khả năng kháng kháng sinh.
Ký hiệu một plasmid bao gồm chữ đầu p (viết tắt của plasmid), chữ thứ 2,3 là BR (chữ đầu tiên là của tác giả, hoặc tên loài vi khuẩn phát hiện ra plasmid đó), còn các chữ số sau cùng (chỉ thứ tự chủng vi khuẩn)
VD: pBR322. (B- Bolivar, R- Rodriguez)
Plasmid có thể được cắt ở một vị trí xác định bằng enzyme hạn chế. Vì thế, các đoạn được tạo ra có thể tạo vòng bằng cách kết hợp các đầu dính bổ sung. Hơn nữa, các đoạn được tạo ra bởi một enzyme đặc biệt hoạt động trên một phân tử DNA sẽ có đầu tương đồng (đầu dính) với đoạn được tạo ra bởi cùng một enzyme hoạt động trên một phân tử DNA khác. Vì thế, các đoạn từ hai phân tử DNA khác nhau, từ hai cơ thể khác nhau có thể kết hợp bằng các liên kết hydrogen thuận nghịch khi các đoạn này được trộn lại.
Nếu sự kết hợp được gắn lại sau khi bắt cặp, thì các đoạn được kết hợp cố định bền vững, sự kết hợp của các đoạn này được thực hiện nhờ enzyme DNA ligase (còn gọi là polynucleotide ligase) liên kết cộng hóa trị các phân tử tái tổ hợp bằng cách tạo
66
ra liên kết phosphodiester giữa nhóm 5’-PO4 của polynucleotide này với nhóm 3’-OH của polynucleotide khác. Plasmid được chia thành 3 loại:
Các plasmid thế hệ thứ nhất: Thế hệ đầu tiên đó là các plasmid tìm thấy trong tự nhiên pSC101 (Stalay-Cohen), ColE1 là vector plasmid đầu tiên tham gia vào tạo dòng. Tuy vậy, các plasmid này có rất ít những đặc tính cần thiết. Sau này, các nhà nghiên cứu đã tìm ra các plasmid nhân tạo thế hệ hai, ba bằng cách tập trung nhiều đặc tính quí của nhiều plasmid tự nhiên vào một cấu trúc duy nhất.
Plasmid thế hệ thứ hai pBR322 do Bolivar Rodrigues tìm ra năm 1977 - là plasmid được sử dụng phổ biến vào những năm 1980 để nhân dòng trong tế bào E.
Coli. Vector chuyển gen 4/15 Các plasmid thế hệ thứ 2 được cấu tạo phức tạp hơn bắt nguồn từ plasmid nhỏ và được cấu tạo thêm nhiều đoạn gen quí.
pBR322 có kích thước 4.363bp và hai gen kháng thuốc, một chống chịu được ampicilline (ampR) và một chống chịu được tetracycline (tetR).
Có nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn chế và trong số đó có nhiều điểm nhận biết nằm trong gen kháng kháng sinh.
Ví dụ, gen kháng ampicilline có ba trình tự nhận biết bởi ba enzyme cắt hạn chế là PstI, PvuI, ScaI. Còn gen kháng tetracycline có sáu điểm nhận biết là: EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII, NnuI.
Hình 4.5. Vector pBR322
Việc cài DNA lạ được tiến hành một trong hai gen kháng thuốc. Nếu chỉ còn một gen kháng với kháng sinh là do một trong hai gen đã không nhận đoạn cài. Điều này cho phép để chọn lựa các plasmid tái tổ hợp.
pBR322 có số bản sao lớn. Thực nghiệm cho thấy cứ 15 plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong E. Coli, số lượng này có thể tăng lên từ 1.000 đến 3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt.
Các plasmid thế hệ ba: Đây là các plasmid mạnh và đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khác nhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker. Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế
67
bào vi khuẩn, tạo số lượng bản sao lớn. Các plasmid thế hệ 3 được chia làm 3 nhóm lớn:
- Dãy pUC là plasmid của University California, có kích thước 2,6 kb và có một số đặc trưng sau
+ Có một mảnh operon lacZ, các vi khuẩn chủ yếu sử dụng với pUC dùng để tổng hợp enzyme β-galactosidase.
+ Có vùng polylinker với nhiểu điểm giới hạn của enzyme cắt hạn chế.
+ Ở pUC18, vùng hạn chế (EcoRI, SacI, KnpI, XmaI, BamHI, XbaI, SalI, HindI, AccI, BspmI, PstI, SphI, Hind III).
+ Ở pUC 18, vùng polylinker có trình tự ngược lại (Hind III ...EcoRI).
+ Có một gen bền với ampicilline, gen này mã hoá cho protein (enzyme) vốn được tiết ra trong khoảng ngoại biên màng sinh chất của vi khuẩn.
Hình 4.6. Cấu tạo pUC 18
Sự hiện diện của lacZ tạo thuận lợi cho vector tái tổ hợp bằng cách quan sát các vi khuẩn trên thạch để chọn vi khuẩn có khả năng tiếp nhận một plasmid. Sự có mặt của gen kháng ampicilline cho phép pUC được tiến hành nuôi cấy trên môi trường có ampicilline
Ưu điểm: Kích thước nhỏ, dễ biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Vùng polylinker cho phép gắn xen bất kỳ trình tự DNA lạ nào, hoặc có thể cho phép tạo dòng đoạn DNA có hai đầu dính khác nhau mà không cần chất gắn. Plasmid pGEM
Kích thước khoảng 3kb, mang gen kháng ampicilline (AmpR) và vùng polylineker gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzymee cắt hạn chế tương tự như vùng polylineker của pUC19 .
Hai promotor đặc trưng cho RNA-polymerase Sp6 và T7 ở hai bên vùng polylinker. Vì vậy có ưu điểm là cho phép phiên mã đoạn DNA gắn trong vector thành nhiều RNA, mà các RNA này thường được dùng làm mẫu dò, hoặc dùng trong nghiên cứu cấu trúc chức năng của RNA.
68
Hình 4.7. Cấu tạo vector pGEM – T Easy
- Nhóm các plasmid bluescript: là vector lai nhân tạo phage sợi và plasmid vì vậy nó được kết hợp tất cả những ưu điểm của các phage và ưu điểm của các plasmid, có thể xem đó là nhóm có tiềm năng nhất hiện nay.
Cấu tạo: Bluescript có cấu tạo dạng vòng khép kín, kích thước vào khoảng 2.961bp, bao gồm:
Hình 4.8. Cấu tạo vector Bluescript II KS/SK(+)
+ Một mảnh lacZ ở đầu 5’ của gen này có cài sẵn polylinker gồm 21 vùng giới hạn: KpnI, ApaI, DraII, XhoI, AccI, HindII, SalI, ClaI, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI, NotI, XmaI, SacII, BstXI, SacI hoặc ngược lại. Ở vùng polylinker người ta còn tìm thấy một vùng nhận biết tương đối hiếm (NotI) mà không có ở dãy pUC. Với 2 promoter T3 và T7 để thu được đoạn cài RNA cùng chiều hoặc ngược chiều qua việc sử dụng RNA- polymerase của phage T3 nhận biết promoter T3 hoặc ngược lại.
+ Một mảnh DNA của phage tùy mục đích sử dụng có thể là phage M13 hoặc phage f1 .Vùng này sẽ sử dụng khi người ta muốn DNA tái bản dưới dạng sợi đơn
69
hoặc sợi đôi, ngoài ra ở vùng này còn chứa điểm khởi đầu cho sự tái bản (ori). Song sự tái bản chỉ có thể xảy ra bởi sự đồng gây nhiễm với một virus trợ giúp (virus helper).
Virus này sẽ bổ khuyết những chức năng thiếu bằng cách mang đến những gen mã hóa các enzyme cần thiết cho sự tái bản. Phụ thuộc vào sự cài đặt của mảnh DNA này so với chiều của gen lacZ, người ta sẽ có vector bluescipt + hoặc −. Cặp này cho phép nhận được sợi cùng chiều hoặc ngược chiều.
Một gen chống chịu được ampicilline, gen này cho phép chọn lựa tất cả những vi khuẩn đã sát nhập một bluescript. Trong vector bluescript còn có điểm khởi đầu sao chép colEI ori, chuỗi này cho phép nhân bản của phagemid (bluenscript) ở trong E.
Coli như plasmid. Giống gốc E. Coli được sử dụng thường là XL1Blu, trong bộ máy di truyền của chúng có chứa gen mã hóa tổng hợp tetracycline. Điều này cho phép dễ dàng chọn lựa những vector đã sát nhập vào vi khuẩn.
Ứng dụng: Tùy theo điều kiện thao tác người ta có thể sử dụng bluescript để nhân bản một đoạn DNA sợi đơn hoặc sợi kép hoặc sao chép RNA invitro để sản xuất đầu dò lai hóa hoặc tạo ngân hàng cDNA.
4.2.3.2.Vector là phage
Các bacterio phage có nhiều ưu điểm khi được sử dụng làm vector tạo dòng.
Vector được sử dụng rộng rãi nhất là bacteriophage λ để gây nhiễm vào tế bào E. coli.
Một trong những ưu điểm chính của phage λ là có hiệu quả chuyển DNA vào trong tế bào vi khuẩn cao. Ưu điểm thứ hai là một phần ba của genome phage là không cần thiết cho sự xâm nhiễm và sinh sản của nó trong tế bào vật chủ, không có những gen này, một tiểu thể λ vẫn chuyển thành công DNA của nó vào vi khuẩn và sinh sản được. Các gen không cần thiết này, khoảng >15 kb, có thể được thay thế bằng một đoạn DNA ngoại lai khoảng 15-23 kb. Ưu điểm thứ ba là DNA sẽ không bị đóng gói trong vỏ λ trừ khi nó dài từ 40-50 kb; vì thế các đoạn DNA ngoại lai không bao giờ được chuyển vào tế bào trừ khi chúng được chèn vào trong genome phage λ, điều kiện cần thiết để đảm bảo đoạn DNA ngoại lai sẽ được tái bản sau khi nó vào trong tế bào vật chủ.
Các phage sử dụng làm vector tách dòng hiện nay phần lớn bắt nguồn từ phage λ.
Phage λ có DNA mạch kép, có kích thước khoảng 48,500 bp. Có nhiều loại phage EMBL3, EMBL4, λGEM11, λGEM13, λGT11, phage M13...
Các gen cần thiết của genome phage λ được định vị trong một cụm. Các chủng của phage λ, được gọi là vector thay thế, đã được biến đổi di truyền với một vị trí RE duy nhất cho EcoRI (chủng phage λ thế hệ mới EMBL3 có ba vị trí cho các RE:
EcoRI, BamHI và SalI) trên một mặt khác của các gen không cần thiết (Hình 4.9). Vì thế, có thể loại bỏ các gen không cần thiết bằng EcoRI. DNA ngoại lai được cắt bằng EcoRI sẽ có đầu dính bổ sung cho đầu của các đoạn DNA của phage λ cần thiết (nhánh trái và phải), để có thể được kết nối bằng DNA ligase. Genome của phage λ có các đoạn sợi đơn ngắn được gọi là các vị trí cos cần cho sự đóng gói DNA trong đầu của phage. Genome tái tổ hợp của phage λ sau đó có thể được đóng gói trong vỏ protein và được bổ sung vào trong E. coli. Các phage λ gây ra sự xâm nhiễm DNA tái tổ hợp của chúng vào trong tế bào vật chủ, nơi nó sẽ được tái bản. Chỉ các đoạn DNA có kích thước thích hợp và mang các gen cần thiết được đóng gói trong các vỏ của phage, cung cấp một hệ thống chọn lọc tự động cho các vector tái tổ hợp.
70
Hình 4.9. Quá trình hoạt động của vector bacteriophage λ l
4.2.3.3 Một số vector tạo dòng khác a. Cosmid vector
Hình 4.10.Vector cosmide
71
Các vector phage λ chỉ có thể mang các đoạn DNA có kích thước khoảng 15-23 kb. Tuy nhiên, các cosmid vector lại mang được các đoạn DNA có kích thước lớn hơn nhiều, khoảng 45 kb
Cosmid là các plasmid nhỏ mang các vị trí cos của phage; chúng có thể được đóng gói trong vỏ virus và được chuyển vào vi khuẩn nhờ sự xâm nhiễm của virus. Do tất cả các gen virus, ngoại trừ các vị trí cos, là không có, nên cosmid có thể mang các đoạn DNA ngoại lai lớn hơn hai lần các đoạn mà phage λ vector có thể mang.
Các cosmid vector có các thành phần sau: (1) một điểm khởi đầu sao chép của plasmid (ori); (2) một số các vị trí cắt hạn chế đơn; (3) một hoặc hơn các gen chỉ thị chọn lọc; và (4) các vị trí cos cho phép đóng gói DNA trong đầu của phage. DNA ngoại lai được chèn vào trong cosmid trong cùng một phương thức với plasmid:
cosmid và DNA ngoại lai đều được cắt bởi cùng một RE để tạo ra các đầu bổ sung (đầu dính), và chúng được liên kết với nhau bằng DNA ligase. Các cosmid tái tổ hợp được hợp nhất trong vỏ, và các tiểu thể phage được sử dụng để xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn, ở đó cosmid sẽ tái bản như một plasmid.
b. Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC (Yeart- Artificial Chromosomes) Do nhu cầu cần tạo dòng với những trình tự DNA ngày càng lớn, các nhà nghiên cứu tạo ra YAC cho phép tạo dòng những đoạn DNA dài 150-1000kb, trung bình là 350kb. Bằng nghiên cứu cho thấy ở nấm men, nhiễm sắc thể muốn nhân đôi và phân ly tốt cần 3 trình tự:
+ 2 TEL (telomere): Trình tự đầu cuối của nhiễm sắc thể
+ CEL (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm của NST, đảm bảo chia đôi và đi về 2 cực của tế bào.
+ ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự sao chép tự chủ tương tự như ori ở plasmid.
Dựa vào đó người ta đã tạo ra NST nhân tạo có đủ 3 trình tự nói trên với cấu tạo gồm 2 cánh, giữa 2 cánh có thể cài đặt một đoạn DNA cần tạo dòng có kích thước khoảng 150 - 1000kb. Trên mỗi cánh gồm các gen đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế bào nấm men có chứa YAC và các chuỗi tận cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST.
c. Các nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú
Cấu tạo: Tương tự như YAC và bao gồm: trình tự TEL,rình tự CEN,rình tự ARS Nhưng khác với YAC là trình tự TEL và CEN có nguồn gốc từ người. Điều này cho phép MAC (Mammalian Artificiel Chromosomes) vào tế bào động vật có vú và giữ được ổn định trong tế bào.