Chương 5. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT NUCLEIC ACID VÀ PHẢN ỨNG PCR
5.1. Các phương pháp tách chiết nucleic acid acid
5.1.2. Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA
- Cần phải được nhiều RNA, sạch, toàn phần không bị gãy mới có ý nghĩa trong quá trình nhân gen và nghiên cứu biểu hiện của gen. Muốn vậy cần phải làm bất hoạt enzyme endonuclease như RNase và ngăn cản sự xâm nhập của enzyme RNase từ bên ngoài vào.
- Điều khó khăn là phần lớn các RNA đều không bền, dễ bị phân huỷ bởi các enzyme ribonuclease, vì thế bước đầu tiên của quy trình chiết tách là phân rã tế bào trong môi trường hoá học có khả năng làm biến tính RNase.
- Các enzyme này lại rất bền vững và hoạt động mạnh không cần có sự tham gia của yếu tố cộng nhân tố, thậm chí nhiều khi xử lý ở nhiệt độ 90oC trong một giờ vẫn không làm bất hoạt được men này. Chúng tồn tại ở khắp nơi, ở rất nhiều trên đầu ngón tay, chính vì thế mọi dụng cụ đều phải dùng mới hoặc sử dụng một lần.
- Khi thao tác phải đeo găng tay, khẩu trang, các dung dịch, nước hoặc muối khi sử dụng để chiết xuất RNA đều phải xử lý bằng hoá chất Diethylpysocarbonate (DEPC), hoá chất này làm bất hoạt men RNase bằng cách làm biến đổi liên kết cộng hoá trị phosphodiester.
- Tất cả các dung dịch dùng để chiết xuất RNA tuyệt đối không được lẫn tạp RNase, muốn thế thì tất cả các dung dịch trừ dung dịch TES vì chứa Tris-Cl chất này làm bất hoạt DEPC, sau khi thêm dung dịch Guanidium đều phải được xử lý DEPC.
b. Các bước tách RNA
- Tế bào, mô (nơi có gen mục tiêu hoạt động) được lấy mẫu và nghiền trong dung dịch có chứa các chất tẩy mạnh như SDS và Sarkosyl ở nồng độ cao kết hợp với 2 tác nhân gây biến tính protein mạnh và hiệu quả là: Guanidinium thiocyanate và 2 mercapto ethanol, 2 chất này có tác dụng ức chế hoạt động của các RNase nội bào và tách các protein liên kết ra khỏi RNA.
- Loại bỏ các protein ra khỏi mẫu bằng cách xử lý Phenol: Chloroform rồi quay li tâm, để kết tủa protein và cặn bã còn nucleic axit sẽ hòa tan ở phần trên.
- Kết tủa nucleic axit (RNA và DNA) bằng thêm lượng ethanol dư thừa. Tách DNA ra khỏi RNA nếu cần thiết, trong nhiều trường hợp không cần thiết tách, bằng cách dùng 8M LiCl với lượng thêm vào bằng 1/2 thể tích của mẫu để có nồng độ làm việc của LiCl là 2M, để kết tủa qua đêm ở nhiệt độ 4oC.
- Như chúng ta đã biết, có 3 loại RNA nồng độ mỗi loại khác nhau tùy theo từng tế bào, mô và giai đoạn sinh trưởng phát triển. Nhìn chung, rRNA chiếm 80 - 85%, tRNA từ 15 - 20%, hai loại này có kích thước và trình tự xác định đặc biệt tRNA nhỏ, có thể tách riêng ra một cách dễ dàng bằng li tâm hoặc điện di. Vì mục đích chiết tách RNA chủ yếu là chiết tách được nhiều và được nguyên vẹn mRNA, loại này chỉ chiếm từ 1 - 5% tổng RNA. Tất nhiên, hàm lượng này còn phụ thuộc vào mô tế bào. Đặc điểm của mRNA ở sinh vật nhân thật phần lớn đều có đầu 3’ đính poly A, tuỳ mRNA có thể lên tới 100A. Dựa vào đặc tính này và đặc tính liên kết bổ sung A = T của nucleic acid người ta có thể tách riêng mRNA ra khỏi hỗn hợp RNA tổng số bằng phương pháp sắc ký ái lực trên cột oligo dT cellulose. Hiện nay, trên thị trường người ta bán những bộ KIT, thay bằng cột oligo dT là các viên bi từ có mang oligo dT trên bề mặt. Đổ các viên bi này vào dung dịch RNA tổng số, sau đó các viên bi này được thu
76
nhận lại và rửa bằng môi trường pH kiềm thì các mRNA sẽ được tách rời ra. Nhờ kỹ thuật này đã cho phép chúng ta thu được chỉ mRNA từ những mẫu, mô tế bào nhỏ.
- Sau khi có mRNA thì bước tiếp là phải tinh sạch bằng phương pháp kết tủa, điện di hay sắc ký. Cuối cùng là định tính và định lượng mRNA.
* Phương pháp phenol/SDS tách chiết RNA thực vật a. Quy trình chiết tách
Gồm 2 công đoạn:
- Phân rã tế bào và loại bỏ protein bằng phương pháp chiết xuất Phenol/SDS - Tách RNA khỏi DNA và tạp chất bằng cách kết tủa có chọn lọc sử dụng LiCl b. Hóa chất dụng cụ
Diethylpyrocarbonate (DEPC), nitơ lỏng, dung dịch nghiền mẫu (grinding buffer), phenol hòa tan với dung dịch TLE, chloroform 8M và 2M LiCl, 3M sodium acetate, 100% ethanol, máy polytron (Prinkmann PT10/35) máy li tâm Beckman JA- 10, JA-20 và JA-14rotor, ống nghiệm Oakridge 50ml, ống nghiệm Sarstedt. Sodium acetate, nước, và dung dịch LiCl cần phải xử lý với DEPC để loại trừ hoạt tính của enzym RNase. DEPC là một chất có khả năng gây ung thư cần chú ý khi tiếp xúc.
Nghiền mô và chiết tách protein
1. Làm lạnh cối, chày bằng cách đổ một ít nitơ lỏng vào.
2. Cân 15 gam mô thực vật đựng trong tủ đá lạnh, nếu dùng mẫu tươi thì sau khi thu cần bỏ ngay vào nitơ lỏng, làm càng nhanh càng tốt.
3. Nghiền mô cây trong cối để tạo thành bột mịn, trong quá trình nghiền thường xuyên đổ thêm nitơ lỏng vào và nghiền tiếp.
4. Ngay sau đó chuyển sang một cốc mỏ vịt có dung tích 500ml đang chứa 150ml dung dịch nghiền mẫu, thêm 500ml TLE và phenol lượng tương đương.
5. Nghiền hỗn hợp bằng máy polytron trong 2 phút với tốc độ vừa phải (chỉnh ở tốc độ từ 5-6).
6. Thêm 50ml Chloroform, dùng máy nghiền polytron với tốc độ thấp nhằm trộn đều Chloroform mới thêm vào với mẫu. Chú ý không cần thiết phải thêm Isoamyl alcohol vào với Chloroform ở các bước chiết xuất tiếp theo.
7. Đổ mẫu vào lọ li tâm Nalgen có dung tích 500ml rồi đun nóng ở nhiệt độ 50oC trong 20 phút. Tất cả các công đoạn chiết tách có liên quan đến TLE-Phenol và Chloroform đều cần phải được tiến hành trong những ống nghiệm có khả năng đậy được nắp và chịu được những hóa chất này.
8. Li tâm hỗn hợp mẫu với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC.
9. Hút lấy càng nhiều càng tốt lớp dung dịch phía trên. Chú ý tránh làm và lớp màng ngăn cách rồi chuyển nó sang lọ Nalgen dung tích 500ml. Đổ thêm 50ml TLE- equilibrated phenol vào, lắc lọ để trộn đều phenol với dung dịch sau đó thêm 50ml Chloroform.
10. Lấy lớp dung dịch còn lại cùng với bề mặt phân cách từ phần chiết tách phenol ban đầu rồi chuyển sang ống nghiệm Oakridge dung tích 50ml. Li tâm trong 20 phút với tốc độ 10.000 vòng phút ở nhiệt độ 4oC trên máy JA-20 rotor.
77
11. Lấy lớp dung dịch phía trên và kết hợp với phần dung dịch đã được phân tách ở bước 9. Bước 10 và 11 tiến hành nhằm mục đích thu được thể tích lớn nhất của dung dịch mẫu mà khó tách khỏi giữa bề mặt phân cắt ở lọ 500ml.
12. Lắc mạnh lọ dung tích 500ml chứa lớp dung dịch kết hợp nhằm trộn đều TLE-equilibrated phenol và chloroform với lớp dung dịch. Sau đó li tâm hỗn hợp trên 15 phút với tốc độ 10.000 vòng phút ở 4oC trên máy JA-10 rotor rồi thu lấy lớp dung dịch rồi chuyển vào lọ dung tích 500ml khác.
13. Tiếp tục chiết xuất phần dung dịch với TLE - equilibrated phenol và chloroform cho đến tận khi không còn lớp ngăn cách giữa 2 trạng thái dung dịch (thường phải làm như vậy 3 lần).
14. Chiết tách phần dung dịch lần cuối cùng với chloroform. Bước này nhằm loại bỏ những vệt TLE – equilibrated phenol lẫn trong lớp dung dịch, nếu còn lẫn có thể sẽ gây lên những khó khăn khi kết tủa bằng LiCThu nhận kết tủa RNA, bước này nhằm loại bỏ DNA ra khỏi RNA. Trong trường hợp không cần loại bỏ DNA thí dụ khi muốn chiết tách mRNA có đuôi poly A thì chỉ cần kết tủa đơn giản bằng Ethanol là đủ.
15. Chuyển lớp dung dịch lỏng sang lọ Nalgen dung tích 250ml, sau đó thêm dung dịch 8M LiCl với lượng bằng 1/2 thể tích mẫu để có được dung dịch mẫu có nồng độ làm việc là 2M LiCl. Kết tủa qua đêm ở nhiệt độ 4oC.
16. Thu phần kết tủa bằng li tâm trong 20 phút với tốc độ 10.000 vòng phút (15300xg) ở nhiệt độ 4oC trên máy JA-14 rotor. Rửa pellet với dung dịch 2M LiCl
17. Hòa tan pellet trong 5ml nước rồi chuyển sang ống nghiệm Sarstedt dung tích 15ml. Thêm dung dịch 8M LiCl với lượng đủ để được nồng độ LiCl trong mẫu là 2M rồi kết tủa RNA ở nhiệt độ 4oC trong thời gian ít nhất 2h.
18. Thu nhận RNA bằng cách li tâm trong 20 phút tốc độ 10.000 vòng phút (12100xg) ở nhiệt độ 40C trên máy JA-20 rotor, tiếp tục rửa pellet bằng 2M LiCl.
19. Hòa tan RNA pellet trong 2ml nước, rồi thêm 200μl dung dịch 3M Sodium acetate và 5,5 ml dung dịch 100% Ethanol để kết tủa RNA ở nhiệt độ -20oC qua đêm hoặc trong đá khô hay Ethanol khô trong thời gian 30 phút. RNA có thể được bảo quản trong Ethanol ở nhiệt độ -20oC hoặc -70oC.
20. Phục hồi RNA bằng cách li tâm 15 phút với tốc độ 10.000 vòng phút (17700xg) ở nhiệt độ 4oC trên máy JA- 20 rotor. Hòa tan RNA trong 1ml nước. Pha loãng từ 10μl thành 1ml rồi đo nồng độ RNA ở bước sóng A260 và A280. Lúc này 1OD260 = 40μg/ml RNA.
* Dung dịch nghiền mẫu (Grinding buffer) gồm: 0,18M Tris, 0,09M LiCl, 4,5mM EDTA, 1% Sodium dodecylSulfate (SDS), chỉnh pH đến 8,2 bằng HCl. Dung dịch này tương đương với dung dịch TLE nếu được thêm vào 1 lượng bằng 1/10 thể tích dung dịch 10% SDS.
* Dung dịch TLE gồm: 0,2M Tris, 0,1M LiCl, 5mM EDTA, chỉnh pH đến 8,0 bằng HCl.
* Phenol: Cân bằng phenol mới tan với lượng cứ 250ml dùng cho 15 gam mô mẫu với dung dịch TLE tiến hành trong cùng ngày chiết xuất. Cách thức làm đầu tiên chiết xuất với một thể tích tương đương dung dịch TLE, sau đó thêm 0,5ml dung dịch NaOH 0,15M để pH dung dịch ≈ 8,0. Sau đó chiết tách thêm 2 lần nữa với dung dịch TLE như trên.
d. Tách lọc poly(A)+RNA từ RNA tổng số
78
Như chúng ta đã biết hầu hết các mRNA của sinh vật nhân thật đều có đuôi 3’ tận cùng poly A+ trong khi đó rRNA và tRNA thì không có. Trong số các RNA được tách ra ở trên thì phần lớn là rRNA và tRNA, một lượng rất nhỏ là mRNA. Để tách mRNA nhỏ này ra khỏi hỗn hợp người ta thường cho hỗn hợp RNA tổng số đi qua một cột cellulose có đính oligo dT. Khi đi qua nhờ ái lực giữa T và A đã giữ mRNA lại sau đó các mRNA được tách rửa rời ra bằng cách loại bỏ các muối khỏi dung dịch thì sẽ làm mất tính bền vững giữa T = A.
Vật liệu hóa chất gồm: Diethylpyrocarbonate (DEPC). 5M NaOH; oligo (dT) cellulose, 0,1M NaOH, poly(A) loading buffer, 10M LiCl, Middle wash buffer, 2mM EDTA/0,1% SDS, 3M Sodium acetate, dung dịch TE không có lẫn enzyme RNase, Silanized column. Trước khi tiến hành, các dung dịch sau cần phải được xử lý DEPC để ức chế hoạt tính của enzyme RNase đó là: Nước, 10M LiCl, 3M Sodium acetate.
Quy trình gồm các bước:
- Đổ cột oligo (dT)
1. Rửa cột Silanized bằng 10ml dung dịch 5M NaOH sau đó tráng bằng nước cất.
2. Thêm 0,5 gam bột cellulose oligo (dT) khô vào 1ml dung dịch 0,1M NaOH rồi đổ hỗn hợp sền sệt này vào cột rồi tráng cột bằng khoảng 10ml.
3. Cân bằng cột với 10 - 20ml dung dịch loading buffer. Kết quả pH lúc này tại thời điểm kết thúc rửa cân bằng cột sẽ vào khoảng 7,5.
- Tách poly (A)+RNA
4. Đung nóng khoảng 2mg RNA tổng số trong nước 70oC trong khoảng 10 phút, sau đó thêm đủ lượng dung dịch.
10M LiCl để nồng độ LiCl cuối cùng trong dung dịch là 0,5M
Ghi chú: Việc đun nóng RNA nhằm mục đích phá bỏ cấu trúc bậc 2 có thể được hình thành. Không nên dùng cột quá lớn, nên dùng cột nhỏ để chỉ nên thu được lượng mRNA 500μg poly(A)+ với lượng như vậy sẽ cho hiệu quả tốt nhất, thường cứ 1ml oligo (dT) cellulose đủ để tách chiết lượng RNA tổng số ban đầu khoảng từ 5-10mg RNA.
5. Đổ dung dịch RNA qua cột oligo (dT) sau đó rửa cột bằng 1ml poly (A) loading buffer. Nhớ giữ lại phần dung dịch nước tách rửa.
6. Lại đổ nước tách rửa qua cột 2 lần nữa nhằm đảm bảo cho tất cả các oligo (A) đều bám vào cột oligo (dT).
7. Tráng cột bằng 2ml dung dịch middle washing buffer.
8. Tách rửa mRNA trong ống nghiệm sạch với 2ml EDTA/0.1% SDS.
9. Cân bằng lại cột oligo (dT) như đã làm ở bước 3 thu lấy mRNA lặp lại từ bước 4 đến bước 8. Cột oligo (dT) lần 2 này tiến hành có tách dụng loại bỏ một lượng nhỏ poly(A) + RNA lẫn tạp.
10. Kết tủa mRNA vừa được rửa bằng cách dùng đủ lượng dung dịch 3M Sodium acetate để có nồng độ cuối cùng là 0,3M sodium acetate.
11. Sau đó thêm vào 2,5 lần thể tích ethanol rồi chuyển dung dịch vào 2 ống nghiệm Silanized SW-55. Ủ dung dịch mRNA qua đêm ở nhiệt độ -20oC hoặc là ủ trong Ethanol nằm trong đá khô trong 30 phút. Thu nhận kết tủa bằng cách li tâm trong 30 phút với tốc độ 50.000 vòng phút ở 4oC trên máy Beckman SW-55 rotor, nhằm kết tủa cô đặc mRNA.
79
12. Đổ ethanol đi rồi để pellet khô tự nhiên hoặc trong máy hút chân không. Hòa tan mRNA trong 150μl dung dịch TE sạch RNase. Chất lượng RNA có thể được kiểm tra bằng cách đun nóng 5μl dung dịch ở 70oC trong 5 phút rồi phân tích trên gel 1%
agarose.
Cách pha chế các dung dịch:
+ Middle wash buffer chứa: 0,15M LiCl; 10mM Tris-Cl pH 7,5; 1mM EDTA;
0,1% SDS
+ Poly (A) loading buffer chứa: 0,5M LiCl; 10mM Tris-Cl pH 7,5; 1mM EDTA và 0,1% SDS.