Tổng hợp vật liệu nano bạc chấm lượng tử graphen (AgNPs GQDs) và ứng dụng

thành cao nhưng có thời gian sống ngắn, điều kiện hoạt động nghiêm ngặt vềnhiệt độ, pH, ánh sáng… để sử dụng trong các bộ cảm biến sinh học nhằmchế tạo ra các cảm biến sinh học phát hiện

-Nguyễn Thị Ngọc Lan

TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO BẠC/CHẤM LƢỢNG TỬ GRAPHEN (AgNPs/GQDs) VÀ

ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA VÔ CƠ

Hà Nội - 2019

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Hà Nội - 2019

GS.TS Trần Đại Lâm Mọi kết quả nghiên cứu cũng như ý tưởng của tác giảkhác, nếu có đều được trích dẫn cụ thể Đề tài luận văn này cho đến nay chưađược bảo vệ tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào và cũng chưa

hề được công bố trên bất kỳ một phương tiện nào Tôi xin chịu trách nhiệm

về những lời cam đoan trên

Hà Nội, ngày 11 tháng 4 năm 2019

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Ngọc Lan

Đại Lâm.

Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hóa Vô cơ Đại cương, Viện Kỹ thuậtHóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọiđiều kiện cho tôi làm thực nghiệm, đo mẫu trong thời gian qua

Trong quá trình nghiên cứu, tôi còn nhận được sự động viên, giúp đỡ củacác các thầy cô- Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, bạn bè đãluôn ủng hộ và cho tôi những lời khuyên bổ ích

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, đồng nghiệp vànhững người thân đã luôn sát cánh bên tôi để tôi có thể hoàn thiện khóa học

GQDs Graphene quantum dots

Microscope

Applied Chemistry

Danh mục các bảng

Bảng 3 1 So sánh các cảm biến cholesterol trên cơ sở phương pháp so màu

Error! Bookmark not defined.

Hình 1 2 Các kiểu đầu thu sinh học phổ biến trong cảm biến sinh học 8

Hình 1.3 Phân loại cảm biến trên cơ sở bộ phận chuyển đổi (transducer)[34] 9 Hình 1.4 Cảm biến so màu phổ dụng: (a) giấy đo độ pH; (b) Hộp que thử 10 thông số của nước tiểu và (c) các màu sắc ứng với nồng độ trong 10 thông số của que thử nước tiểu; (d) giấy thử hàn the trong thực phẩm; (e) bộ kit xác định hàm lượng methanol trong rượu và (f) que thử thai 10

Hình 1.5 (a) Cấu trúc của enyzme Cholesterol Oxidase; (b) Sơ đồ cấu trúc của cholesterol và (c) cấu trúc của cholest-4-en-3-one 14

Hình 1.6 Mô hình mô tả tác hịa làm tắc mạch máu, xơ vữa động mạch của cholesterol 15

Hình 1.7 Sơ đồ phản ứng enzyme dùng để xét nghiệm cholesterol theo phương pháp so màu 17

Hình 1.8 (A) Bộ dụng cụ đo nồng độ cholesterol trong máu: (1) hộp đựng que thử; (2) than máy đo; (3) kim chích máu; (4) que đo và (5) bút chích máu (B) Cấu trúc của que thử 17

Hình 1.9 Cảm biến màu cholesterol sử dụng hạt nano vàng (lõi)/bạc (vỏ) thay thế enzyme POD [43] 19

Hình 1.10 Nguyên lý phát hiện cholesterol bằng phương pháp so màu sử dụng hạt graphen nano (GQDs) thay thế enzyme HRP[54] 20

Hình 1.12 Hai nguyên lý trong tổng hợp GQDs 22

Hình 1 13 (a) Dung dịch nano bạc (nano Ag); (b) Phổ UV-Vis của dung dịch nano Ag và (c) ảnh TEM của hạt nano Ag chế tạo được trong luận văn 23

Hình 2.1 Sơ đồ chùm tia tới và chùm tia nhiễu xạ trên tinh thể 30

Hình 2.2 Độ tù của pic phản xạ gây ra do kích thước hạt 31

Hình 2.3 Thiết bị đo nhiễu xạ tia X 31

Hình 2.6 Bước chuyển của các electron trong phân tử 34

Hình 2.7 Hệ đo UV–Vis Agilent 8453 35 Hình 3.1 Sơ đồ mô tả sự hình thành hạt GQDs dots theo phương pháp từ

dưới lên (bottom-up) 37 Hình 3 2.(A) Phổ UV-Vis của GQDs và (B) phổ FL của GQDs với các bước sóng kích thích khác nhau; (D) Ảnh TEM of GQDs;(E) Màu sắc dung dịch

GQDs và mẫu nước ở dưới ánh sáng thường (trái) và dưới tia UV (phải) 38

Hình 3.3 Sơ đồ mô tả sự tạo thành vật liệu AgNPs/GQDs 39 Hình 3.4 (A) Phổ UV-Vis của (a) GQDs, và (b) AgNPs/GQDs; (B) Phổ XRD

của (a) GQDs và (b) AgNPs/GQDs 40 Hình 3 5 (a,b) Ảnh TEM của AgNPs/GQDs; (c) ảnh SEM của sản phẩm AgNPs/GQDs;(d) Phân bố kích thước hạt phân tích theo phương pháp tán xạ

laser (DLS) của mẫu AgNPs/GQDs) 41 Hình 3.6 (A) Phổ FT-IR của: (a) chấm lượng tử graphen (GQDs) và (b)

AgNPs/GQDs và (B) Phổ tán xạ năng lượng (EDX) 43 Hình 3 7 (A) phổ hấp thụ UV-vis của AgNPs/GQDs (a) trước và (b) sau khi thêm 100 μM dung dịch H 2 O 2 ; (B) Biến đổi A/A (%) theo thời gian 44 Hình 3 8 Phổ UV-vis của dung dịch AgNPs/CQDs trước (đường i) và sau khi phản ứng với 100 µM H 2 O 2 ở các pH khác nhau: (a) pH =3; (b) pH = 4;

(c) pH = 7; (d) pH = 9; (e) pH = 11; và (f) Biến đổi tín hiệu A/A0 (%)và biến đổi tín hiệu  max của cảm biến khi có mặt 100 µM H 2 O 2 tại các pH

khác nhau 46 Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả hiệu quả làm việc của cảm biến phát hiện H 2 O 2 Nồng độ H 2 O 2 sử dụng là 20, 40, 60, 80 và 100 µM pH =7 47

Hình 3.10.Cơ chế phản ứng của cảm biến phát hiện H 2 O 2 48

nhau từ 0, 0.5; 1; 5; 10; 20; 30; 40; 50 và 100 μM H 2 O 2 ;(B) Đường chuẩn của cảm biến để xác định nồng độ H 2 O 2 (hình chèn: màu sắc của các cảm biến tương ứng với các nồng độ H 2 O 2 ) 50 Hình 3.13 (A) Phổ UV-Vis của cảm biến H 2 O 2 với các nồng đô H 2 O 2 khác nhau từ 0, 0.5; 1; 5; 10; 20; 30; 40; 50 và 100 μM H 2 O 2 ;(B) Đường chuẩn của cảm biến để xác định nồng độ H 2 O 2 (hình chèn: màu sắc của các cảm biến tương ứng với các nồng độ H 2 O 2 ) 51 Hình 3.14 Phổ UV-Vis của dung dịch cảm biến khi có mặt: (1) mẫu trắng; (2) có 0,5 mM glucose; (3) 1 mM glucose; (4) 0,5 mM axit ascorbic; (5) 1mM axit ascorbic; (6) 1 mM galactose; (7) 0,02 mM H 2 O 2 52 Hình 3.15 Thành phần của bộ kit xét nghiệm H 2 O 2 53 Hình 3.16 Bảng màu chuẩn để đọc kết quả nồng độ H 2 O 2 trong mẫu 53 Hình 3.17 Cơ chế hoạt động của cảm biến Cholesterol trên cơ sở

AgNPs/CQDs 54 Hình 3.18 Độ chọn lọc của cảm biến cholesterol: A) Phổ UV-Vis của cảm biến với sự có mặt của các sacarit khác nhau ở nồng độ 4 mM và (B) Độ thay đổi tín hiệu cường độ pic A/A 0 of ứng với các sacarit ở hình A Hình chèn:

màu sắc của các dung dịch cảm biến tương ứng 55 Hình 3.19.(A) Phổ UV-vis của cảm biến với nồng độ cholesterol khác nhau (hình chèn: màu sắc của các dung dịch cảm biến tương tứng); (B) Đường

chuẩn xác định nồng độ cholesterol của cảm biến 56 Hình 3.20 Ảnh TEM mẫu AgNPs/GQDs sau khi phản ứng với hỗn hợp ChOx

và 1 mM cholesterol ở thang đo (a) 100nm và (b) thang đo 20 nm 58

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 CẢM BIẾN SINH HỌC, CẤU TRÚC, CÁC TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG VÀ PHÂN LOẠI. 6

1.1.1.Định nghĩa cảm biến sinh học. 6

1.1.2 Cấu trúc và thành phần của cảm biến sinh học 7

1.1.2.1 Đầu thu sinh học (capture probe) 7

1.1.2.2 Bộ phận chuyển đổi 9

1.1.3 Cảm biến so màu 9

1.1.4 Các đặc trưng của cảm biến sinh học 11

1.1.4.1 Độ nhạy 11

1.1.4.2 Độ chọn lọc (độ đặc hiệu) 12

1.1.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD) 12

1.2 ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL 13

1.2.1 Enzyme 13

1.2.2 Cấu trúc phân tử và đặc tính xúc tác ưu việt của enzyme 13

1.2.5 Enzyme Cholesterol oxidase 13

1.3 CHOLESTEROL VÀ BỆNH RỐI LOẠN MỠ MÁU. 15

1.3.1 Cholesterol và bệnh rối loạn mỡ máu 15

1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm nồng độ cholesterol 16

1.3.2.1 Phương pháp so màu trên cơ sở sử dụng enzyme đặc chủng như cholesterol oxidase (ChOx) 16

1.3.2.2 Xét nghiệm bằng máy đo sử dụng cảm biến sinh học điện hóa

sử dụng các enzym đặc chủng 17

1.3.3 Các xu hướng phát triển cảm biến cholesterol 18

1.3.3.1 Tổng hợp và ứng dụng các vật liệu thay thế enzyme cholesterol oxidase (ChOx) trong chế tạo cảm biến. 18

1.3.3.2 Tổng hợp và sử dụng các vật liệu có hoạt tính xúc tác thay thế enzyme peroxidase (POD). 18

1.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU TRONG LUẬN VĂN 21

1.4.1 Vật liệu chấm graphen lượng tử (Graphene quantum dots-GQDs) 21 1.4.2 Vật liệu nano bạc (silver nanoparticles- AgNPs) 23

1.5 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI. 24

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 26

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ 26

2.1.1 Hóa chất, vật liệu 26

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 26

2.2 CHẾ TẠO VẬT LIỆU CQDs VÀ AgNPs/GQDs 27

2.2.1 Chế tạo cacbon dots bằng phương pháp từ dưới lên (bottom-up) 27 2.2.2 Chế tạo vật liệu nano Ag/Cacbon dots (AgNPs/GQDs) 27

2.3 CHẾ TẠO CẢM BIẾN H2O2 VÀ CHOLESTEROL 27

2.3.1 Chế tạo cảm biến phát hydrogen peroxide 27

2.3.2 Chế tạo cảm biến cholesterol 28

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VẬT LIỆU VÀ CẢM BIẾN 29

2.4.1 Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction-XRD ) 29

2.4.2 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 31

2.4.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) 32

2.4.4 Phổ hấp thụ electron (UV-Vis) 33

2.4.5 Phổ tán sắc năng lượng tia X (EDX) 35

2.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 ĐẶC TRƯNG CỦA VẬT LIỆU 37

3.1.1 Đặc trưng chấm graphen lượng tử (Graphene quantum dots- GQDs) 37 3.1.2 Đặc trưng vật liệu AgNPs/GQDs 38

3.2 CHẾ TẠO CẢM BIẾN HYDROGEN PEROXIDE TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU AgNPs/GQDs 43

3.2.1 Khảo sát thời gian phản ứng và tìm hiểu cơ chế phản ứng 43

3.2.2 Đường chuẩn xác định nồng độ hydrogen peroxide (H2O2) 50

3.2.3 Bộ kit xét nghiệm xác nồng độ hydrogen peroxide (H2O2) 52

3.3 CHẾ TẠO CẢM BIẾN CHOLESTEROL TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU AgNPs/GQDs 53

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 59

HƯỚNG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC – BÀI BÁO KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ

đo và cho kết quả nhanh nên cảm biến so màu đã và đang có vai trò rất quantrọng và phổ biến trong thời đại mới vì tính tiện dụng, nhanh chóng và sửdụng đơn giản Vì vậy, nhu cầu về các cảm biến đặc biệt là cảm biến so màurất đa dạng để áp dụng trong thực phẩm, môi trường, dược phẩm, xét nghiệmbệnh tật Tuy nhiên cảm biến so màu hóa học có tính chọn lọc không cao vìvậy để phát triển cảm biến có độ chọn lọc cao cần có các đầu thu sinh học, khi

đó ta có cảm biến so màu sinh học

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ và vật liệu nano đã cho ra đờicác kết cấu vật liệu mới, với tính chất lý hóa, sinh học rất mới và có tiềm năngứng dụng rất lớn Các ứng dụng vật liệu nano bạc (nano Ag) có những tínhchất hóa lý rất đáng quan tâm như: thay thế được enzym horseradishperoxidase (enzym HRP) cho phản ứng phân hủy H2O2; có pic hấp thụ đặctrưng tại 420 nm đặc trưng của nano Ag; có tính dẫn điện tốt và có hoạt tínhđiện hóa…Do đó việc phát triển các ứng dụng sâu hơn của chúng sẽ mở ranhiều ứng dụng mới như thay thế các enzym như HRP; loại enzym có giá

thành cao nhưng có thời gian sống ngắn, điều kiện hoạt động nghiêm ngặt vềnhiệt độ, pH, ánh sáng…) để sử dụng trong các bộ cảm biến sinh học nhằmchế tạo ra các cảm biến sinh học phát hiện các chỉ dấu sinh học (nhưhydrogen peroxide, cholesterol, glucozơ…) một cách nhanh, nhạy và rất chọnlọc với chi phí thấp và thời gian bảo quản dài hơn

Các hạt nano kim loại quý, đặc biệt là hạt nano bạc(AgNP), đã thu hútđược sự chú ý đáng kể do đặc tính quang học độc đáo và đặc trưng của phổplasmon bề mặt Phổ này sẽ bị thay đổi khi có các tác nhân tấn công sự tồntại hoặc làm biến dạng hình học các hạt AgNPs và bằng mắt thường cũng cóthể quan sát được sự biến đổi này.Vì vậy thời gian gần đây có nhiều nghiêncứu ứng dụng các tính chất này để chế tạo cảm biến hóa học, sinh học Tuynhiên để đáp ứng cho các ứng dụng này thì AgNPs yêu cầu có độ sạch caotrong mẫu không có dư lượng sản phẩm phụ hoặc các sản phẩm phụ khôngảnh hưởng/ tương tác với các chất trong hệ ứng dụng của AgNPs Do đó cácphương pháp truyền thống tổng hợp AgNPs tỏ ra bị hạn chế khi sản xuấtnano bạc cho các ứng dụng này Để khắc phục hạn chế đó, tôi chọn đề tài:

“Tổng hợp vật liệu nano bạc/chấm lượng tử graphen (AgNPs/GQDs) và

ứng dụng” Trong công trình này, chúng tôi trình bày phương pháp “xanh” để

tổng hợp các hạt nano bạc (silver nanoparticles- AgNPs), trong đó điểm mới là

sử dụng các hạt nano cacbon (hay chấm lượng tử graphen -GQDs) làm chất khử

và đồng thời làm chất ổn định Tiếp đó chúng tôi dùng AgNPs tổng hợp được đểlàm đầu dò đa chức năng để chế tạo cảm biến hydrogen peroxit (H2O2), tiếp đó,chúng tôi kết hợp cảm biến H2O2 và enzyme cholesterol oxidase (ChOx) để chếtạo cảm biến cholesterol theo phương pháp so màu Đây đều là các nội dungnghiên cứu mới và có ý nghĩa thực tiễn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 CẢM BIẾN SINH HỌC, CẤU TRÚC, CÁC TÍNH CHẤT ĐẶCTRƯNG VÀ PHÂN LOẠI

1.1.1.Định nghĩa cảm biến sinh học.

Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of

Pure and Applied Chemistry) năm 1992[1] đã định nghĩa: “Cảm biến sinh học

(biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer)” Chất được gắn trên bộ phận chuyển đổi được gọi là “phần tử

dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích trong mẫu được gọi là

“phần tử đích” Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên cácphản ứng đặc hiệu: kháng nguyên/kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóaDNA-DNA(cảm biến DNA) hoặc enzym/cơ chất (cảm biến enzym)… Trên cơ

sở các phản ứng đặc hiệu này, phần tử nhận biết sinh học giữ vai trò dò tìmđối tượng đích trong mẫu phân tích và phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyểnđổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đưa qua

bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo (hình 1.1)

Hình 1.1 Nguyên lý cấu tạo của cảm biến sinh học[2]

Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổiquang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằngcác hệ vi cơ… Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo

nguyên lý điện hóa có nhiều khả năng ứng dụng trong phân tích các đối tượng

ysinh vì độ nhạy tốt và có thể vi cấu trúc hóa để chuyển đổi thành các thiết bịcầm tay Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển cáctín hiệu của phản ứng sinh hóa giữa phần tử nhận biết sinh học và phần tửđích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu được nhận biết bởi kỹ thuậtđiện hóa Các kỹ thuật điện hóa có thể được sử dụng để đánh giá một cáchđịnh lượng (theo nồng độ) hoặc định tính (âm tính/dương tính) sự có mặt củacác thành phần sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…) trong dungdịch Có nhiều phương pháp để đo tín hiệu điện hóa khi có sự tương tác giữađầu thu sinh học và chất cần phân tích như đo dòng, đo thế, đo độ dẫn và đophổ tổng trở…[54] Tuy nhiên, bên cạnh đó cảm biến sinh học điện hóa cũng

có nhiều nhược điểm như (i) cần thiết bị nghiên cứu đắt tiền (máy đo), và (ii)các điện cực để nghiên cứu cũng có chi phí cao, gia công phức tạp

1.1.2 Cấu trúc và thành phần của cảm biến sinh học

1.1.2.1 Đầu thu sinh học (capture probe)

Cảm biến sinh học là khái niệm chỉ cảm biến mà có đầu thu là các phần

tử sinh học (bio-receptors) như là enzyme, kháng thể (antibody), các chuỗiDNA hoặc RNA hoặc các chuỗi peptit hoặc protein dùng để phát hiện các chấtcần phân tích Quan hệ giữa đầu dò (probe) và đối tượng cần phát hiện (còngọi là đích- target) chủ yếu gồm các nhóm chính như sau (hình 1.2):

(i) Với đầu dò là enzyme ta có cảm biến enzyme dùng để phát hiện các phân

tử đích (target) đặc trưng của chúng (hay còn gọi là cơ chất của enzyme) Một

số cảm biến enzyme đã được phát triển và ứng dụng[3-9] Ví dụ với đầu dòenzyme glucose oxidase (GOx) dùng để phát hiện glucose ; enzymecholesterol oxidase (ChOx) dùng để phát hiện cholesterol….Do cảm biếnenzym rất nhạy, phản ứng nhanh và chọn lọc nên cảm biến enzyme còn đượcdùng trong việc khuếch đại tín hiệu để nâng cao giới hạn phát hiện cho cácloại cảm biến khác; chẳng hạn phép phân tích sàng lọc ELISA dùng trongbệnh viện để xét nghiệm ung thư, bệnh tật hoặc các ca nhiễm độc bởi các chấtđộc hại như clozapine[10], phenolthiazines[11], rifampicin[12], thuốc trừ sâu,diệt cỏ[13] Với ứng dụng này thì enzym thường được dùng là loại enzym

oxidase (chủ yếu là enzym horseradish peroxidase-HRP).

(ii) Với đầu dò là kháng thể (antibody) thì sẽ dùng để phát hiện kháng nguyên(antigen) tạo ra cảm biến miễn dịch (immunosensor) Một kháng thể(antibody) sẽ liên kết một cách đặc hiệu với một đối tượng kháng nguyên(antigen) [14-19], tạo ra độ chọn lọc cao (tính đặc hiệu tốt) cho phép phântích Cảm biến kiểu này dùng rất phổ biến với nhiều bộ kit được phát triển đểphân tích các mẫu thực phẩm, nước uống, bệnh phẩm…với tên gọi chung là

bộ kit ELISA Ví dụ bộ kit xét nghiệm là các chất độc hại như 2,4-D (chấtđộc màu da cam); các phụ gia trong sản xuất giấy gói có ảnh hưởng đến sứckhỏe như bisphenol A; các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu như atrazine hoặccác loại protein bệnh như virus cúm, bệnh ung thư…

(a) Enzyme (b) Khángthể (Antibody) (c) DNA

Hình 1 2 Các kiểu đầu thu sinh học phổ biến trong cảm biến sinh học.

(iii) Nếu đầu dò là các đoạn DNA hay RNA hoặc axit nucleic peptide sẽ ứngdụng trong chế tạo các bộ cảm biến DNA hay RNA nhằm phát hiện ra cácđoạn DNA hoặc RNA dùng trong các nghiên cứu sinh học xét nghiệm huyếtthống bệnh tật, trong chuyển đổi gen Nguyên tắc hoạt động là các chuỗi này

có quan hệ bổ sung (ghép cặp) rất nhạy và rất chọn lọc nên cảm biến loại này

có độ nhạy cao và tính chọn lọc [16, 20-33] Ngày nay, chủ yếu là

oligodeoxyribonucleotides tổng hợp (ODNs) được sử dụng làm đầu dò trongcảm biến DNA Các phần ghép thêm vào như đuôi thiol (-SH), amin (-NH2)hoặc biotin được kết hợp để cố định ODN trên bề mặt của cảm biến

1.1.2.2 Bộ phận chuyển đổi

Hình 1.3 Phân loại cảm biến trên cơ sở bộ phận chuyển đổi (transducer)[34]

Bộ phận chuyển đổi trong các cảm biến sinh học là bộ phận chuyển đổi tínhiệu của việc bắt cặp nhau giữa đầu dò và đích thành các tín hiệu có thể đođược [1, 35, 36] Tùy vào tín hiệu đầu ra (out put signal) mà chúng ta có thểgọi tên là cảm biến điện hóa hay cảm biến quang…Như tóm tắt ở hình 1.3,cảm biến sinh học có thể xây dựng trên một trong 5 loại bộ phận chuyển đổitín sau đây: điện hóa (electrochemical), điện (electrical), quang (optical),cơ/áp điện (piezoelectric) hoặc nhiệt (thermal) Mặc dù có rất nhiều loại bộphận chuyển đổi như trên, nhưng trong thực tế bộ phận chuyển đôi điện hóa

và quang là được dùng phổ biến nhất trong cảm biến sinh học

Trong luận văn này chúng tôi sử dụng bộ phận chuyển đổi quang học haycòn gọi là cảm biến quang với sự đổi màu của chất chỉ thị nên còn có thể gọi

là cảm biến so màu So với cảm biến điện hóa thì cảm biến so màu có một sốlợi thế như có thể quan sát bằng mắt thường nhờ sự chuyển màu của các chấtchỉ thị, dụng cụ tiến hành đơn giản, gia công dễ dàng…Do đó cảm biến sinhhọc so màu đang được dùng nhiều trong thực tế và đã khẳng định được sự tincậy như phép xét nghiệm ELISA trong xét nghiệm bệnh ung thư, cảm cúm,các bệnh do virus, ở bệnh viện

1.1.3 Cảm biến so màu

Từ khi ngành hóa học phát triển đã sử dụng các chất chỉ thị, chất chỉ thịmàu để phát hiện môi trường các chất một cách nhanh chóng và đến nay cácchất chỉ thị vẫn được sử dụng rộng dãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau Để

nâng cao độ tiện dụng cũng như để ứng dụng rộng rãi trong đời sống người ta

đã chế tạo ra các bộ kit so màu để xác định nồng độ một số chất thậm chí đểxác định tình trạng bệnh tật Chẳng hạn, bộ so màu đơn giản và hay dùng nhất

là giấy pH (hình 1.4a), sau đó là các que thử như thử 10 chỉ tiêu trong nướctiểu (gồm pH, tỷ trọng) (hình 1.4b và hình I.4c), giấy thử hàn the trong thựcphẩm như chả, bún, phở (hình 1.4d); bộ kit xét nghiệm sự có mặt củamethanol trong rượu (hình 1.4e) và cao cấp là que thử thai (hình 1.4f)

(a)

(d)

Hình 1.4 Cảm biến so màu phổ dụng: (a) giấy đo độ pH; (b) Hộp que thử 10 thông số của nước tiểu và (c) các màu sắc ứng với nồng độ trong 10 thông số của que thử nước tiểu; (d) giấy thử hàn the trong thực phẩm; (e) bộ kit xác

định hàm lượng methanol trong rượu và (f) que thử thai.

Nguyên tắc hoạt động của cảm biến so màu ở dạng giấy chỉ thị khá đơngiản, đó là trên cơ sở giấy có độ tro thấp, người ta sẽ tẩm các hóa chất đóngvai trò là chất chỉ thị lên Khi thử, gặp các tác nhân cần kiểm tra ở trong mẫuthì chỉ thị sẽ biến đổi màu, tùy thuộc vào màu sắc và cường độ để xác định sự

có mặt của tác nhân cần kiểm tra cao hay thấp Đại đa số cảm biến so màu làcảm biến hóa học, chỉ một số ít là cảm biến sinh học, như que thử thai là cảmbiến sinh học dựa theo phản ứng kháng nguyên - kháng thể để xét nghiệmhormone HCG (Human Chorionic Gonadotrophin) Theo đó, ở vùng phảnứng, các sợi thấm đã được ngâm tẩm với một loại protein kháng thể đặc biệt

có hình chữ Y (Ab1) được đánh dấu bằng các hạt vàng hoặc hạt huỳnhquang, Các kháng thể này sẽ bắt cặp với HCG (ở đây được xem là các khángnguyên) có trong mẫu nước tiểu Hiện nay ngày càng có nhiều cảm biến sinhhọc dựa trên phương pháp so màu đang được phát triển vì tính tiện lợi và đơngiản của quy trình xét nghiệm Cảm biến so màu không chỉ được phát triển đểxét nghiệm các hóa chất hay các phần tử sinh học, loại cảm biến này đang đượcphát triển cho xét nghiệm quản lý môi trường, kiểm tra chất lượng nước.

1.1.4 Các đặc trưng của cảm biến sinh học

Một cảm biến sinh học dù theo phương pháp đo nào cũng cần có cácchỉ số để đánh giá chất lượng của chúng, bao gồm các đặc tính sau:

1.1.4.1 Độ nhạy

Đối với cảm biến tuyến tính, giữa biến thiên đầu ra

đầu vào m có sự liên hệ tuyến tính:

s và biến thiên

Trong đó: Đại lượng S xác định bởi biểu thức, được gọi là độ nhạy củacảm biến.Trường hợp tổng quát, biểu thức xác định độ nhạy S của cảm biếnxung quanh giá trị của đại lượng đo xác định bởi tỷ số giữa biến thiên s củađại lượng đầu ra và biến thiên Δm tương ứng của đại lượng đo ở đầu vàoquanh giá trị đó Để phép đo đạt độ chính xác cao, khi thiết kế và sử dụng cảmbiến cần làm sao cho độ nhạy S của nó không đổi, nghĩa là ít phụ thuộc nhấtvào các yếu tố sau:

- Giá trị của đại lượng cần đo m và tần số thay đổi của nó,

1.1.4.2 Độ chọn lọc (độ đặc hiệu)

Độ đặc hiệu của một xét nghiệm là tỷ lệ những trường hợp thực sựkhông có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trườnghợp không bị bệnh Độ đặc hiệu được tính theo công thức sau:

Độ đặc hiệu = Số trường hợp âm tính thật/ (số trường hợp âm tínhthật + số trường hợp dương tính giả)

Đối với một xét nghiệm để xác định xem ai mắc bệnh nào đó, độ đặchiệu 100% có nghĩa là toàn bộ những người khỏe mạnh (không mắc bệnh)được xác định là khỏe mạnh Một mình độ đặc hiệu không cho chúng ta biếttoàn bộ về xét nghiệm bởi vì 100% độ đặc hiệu có thể có được một cáchthông thường bằng việc gán cho toàn bộ các trường hợp kết quả xét nghiệm

âm tính Chính vì vậy, chúng ta cần phải biết thêm về độ nhạy của xét nghiệm

1.1.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện (hay còn gọi là limit of detection – LOD) là giới hạndưới về nồng độ mà cảm biến có thể nhận biết được sự có mặt của chất cầnphân tích với mẫu trắng (mẫu không có mặt chất cần phân tích hoặc chất cạnhtranh) Thông thường LOD được tính theo công thức[34]:

Trong đó :ALOD – tín hiệu mẫu ứng với nồng độ thấp nhất mà cảm biến

có thể phát hiện (LOD);

̅̅ : tín hiệu trung bình của mấu trắng; và:

ϭBlank : sai số tuyệt đối của mẫu trắng Sai số này được tính theo côngthức:

√

Với : N- số thí nghiệm với mẫu trắng, để có ý nghĩa thống kê tốt thì N

phải lớn (thường N>5) ;

ALOD tính toán được, nội suy hoặc ngoại suy từ đường chuẩn ta tính toánđược giá trị LOD.

Ngoài ra cảm biến sinh học cần có thêm các tính chất khác như: Độbền, độc lập, tính lặp lại, dễ sử dụng và vận chuyển…

1.2 ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL

1.2.1 Enzyme

Enzyme (hay còn gọi là men) là chất xúc tác sinh học có thành phần cơbản là protein Trong cuộc sống sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học,với một hiệu suất rất cao, mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, ápsuất, pH Sở dĩ như vậy vì nó có sự hiện diện của chất xúc tác sinh học đượcgọi chung là enzyme; như vậy, enzyme là các protein xúc tác các phản ứnghóa học Trong các phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình đượcgọi là cơ chất, enzyme sẽ biến đổi chúng thành các phân tử khác nhau.Enzyme có tính chọn lọc rất cao đối với cơ chất của nó Hầu hết phản ứngđược xúc tác bởi enzyme đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không đượcxúc tác Có trên 4 000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzyme Tuy vậy,hoạt tính của enzyme chịu tác động bởi nhiều yếu tố (nhiệt độ, áp suất, pH,môi trường, chất ức chế, ngộ độc…)

1.2.2 Cấu trúc phân tử và đặc tính xúc tác ưu việt của enzyme

Bản chất enzyme là những protein đặc hiệu có cấu tạo phân tử rất phứctạp, do vậy nó có tất cả các thuộc tính hóa học của protein Enzyme có khảnăng và hiệu lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu rất cao Để đảm bảo chochức năng của enzyme là chất xúc tác sinh học, cấu trúc của enzyme phải rấttinh vi và phức tạp Enzyme là những loại phân tử lớn, phần nhiều nhữngenzyme đã được nghiên cứu có trọng lượng phân tử từ 10.000 đến 1.000.000dalton

1.2.5 Enzyme Cholesterol oxidase

Cholesterol oxidase còn có các tên gọi khác như Cholesterol-O2oxidoreductase; beta- hydroxy steroid oxidoreductase; beta- hydroxysteroid:oxygen oxidoreductase Cholesterol oxidase (hình 1.10a) thuộc nhóm 1

(Oxydoreductase) (EC 1.1.3.6) có tác dụng xúc tác cho phản ứng oxy khử Cholesterol oxidase thường được thu từ Streptomyces, Pseudomonas,Brevibacterium… Enzyme này có tính đặc hiệu cao đối với cholesterol trongkhoảng pH thích hợp từ 4,0 đến 7,0 (tính đặc hiệu cao nhất tại pH=7,0) Đặctính của enzyme ChOx là chất đặc hiệu để phát hiện và định lượngcholesterol.Phản ứng với xúc tác ChOx Phản ứng oxy hóa cholesterol (hình1.10b) dưới tác dụng của ChOx tạo ra H2O2 và cholest-4-en-3-one (hình1.10c):

hóa-→

Hình 1.5 (a) Cấu trúc của enyzme Cholesterol Oxidase; (b) Sơ đồ cấu trúc

của cholesterol và (c) cấu trúc của cholest-4-en-3-one

Ngày nay, enzyme ChOx được sử dụng rộng rãi trong chế tạo các bộ kitxét nghiệm cholesterol theo kiểu cấu trúc điện hóa phục vụ nhu cầu tự kiểm tratheo dõi nồng độ cholesterol trong máu; còn trong xét nghiệm ở các bệnh việnchủ yếu cảm biến cholesterol hoạt động theo cơ chế cảm biến so màu

1.3 CHOLESTEROL VÀ BỆNH RỐI LOẠN MỠ MÁU.

1.3.1 Cholesterol và bệnh rối loạn mỡ máu

Hình 1.66 Mô hình mô tả tác hịa làm tắc mạch máu, xơ vữa động mạch của

Lượng cholesterol nội sinh được sản xuất hàng ngày trong gan mỗi ngày từ1,5g – 2g Cholesterol đóng vai trò trung tâm trong nhiều quá trình sinh hoá,nhưng lại được biết đến nhiều nhất do liên hệ đến bệnh tim mạch gây ra bởinồng độ cholesterol trong máu tăng Khi cholesterol trong máu quá dư thừathì chúng sẽ đóng thành mảng mỡ trong mạch máu và các mảng này gây trởngại cho dòng máu chảy trong các động mạch (hình 1.11) Khi đó, máu mangoxy sẽ không chảy đủ tới tim và như vậy nguy cơ bị lên cơn đau tim sẽ tăng;nếu máu chạy lên não mà thiếu thì sẽ gây ra đột quỵ (stroke) Chứng bệnh dưcholesterol huyết (hypercholesterolemia) không có triệu chứng gì đặc biệt, chỉ

có thử máu mới phát hiện được vì vậy xét nghiệm cholesterol trong máu làchỉ số quan trọng trong kiểm tra sức khỏe Việc xét nghiệm, kiểm tra thườngxuyên nồng độ cholesterol trong cơ thể sẽ góp phần kiểm soát, phát hiện sớmbệnh rối loạn mỡ máu để kịp thời điều trị, qua đó sẽ góp phần giảm chi phí

điều trị Hiện nay, việc xét nghiệm cholesterol chủ yếu là tiến hành trên mẫumáu và thực hiện ở bệnh viện, thường là lấy máu để xét nghiệm khi đói, nếugiá trị vượt ngưỡng thì mới thực hiện các xét nghiệm khác để sàng lọc, theodõi Cảm biến xét nghiệm cholesterol hiện đang áp dụng trong các cơ sở y tếchủ yếu là theo phương pháp so màu Theo quy định, nồng độ cholesteroltoàn phần đối với người bình thường tùy thuộc vào độ tuổi, chẳng hạn trẻdưới 10 tuổi là 100-180 mg/dL máu hay 2,6-4,7 mM; từ 10 -20 tuổi thì giá trịnày là 120 -180 mg/dL (3,1 – 4,7 mmol/L); lứa tuổi trên 20 tuổi thì giá trị bìnhthường là 120 – 200 mg/dL (3,1 – 5,2 mmol/L).

1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm nồng độ cholesterol

Hiện nay có 2 cách chính để xác định nồng độ cholesterol trong máu đó

là xét nghiệm ở bệnh viện hoặc tự đo ở nhà Cả hai cách này đều có điểmchung là sử dụng hệ 2 enzym giống nhau là enzyme cholesterol oxidase(ChOx) và enzyme peroxidase (POD); cơ chế hoạt động của chúng cũnggiống nhau, chỉ khác về nguyên lý đo và tính chất của bộ phận chuyển đổi tínhiệu (transducder): với cảm biến so màu là tín hiệu quang, còn với cảm biếnđiện hóa là tín hiệu điện

1.3.2.1 Phương pháp so màu trên cơ sở sử dụng enzyme đặc chủng như cholesterol oxidase (ChOx)

Đây là phương pháp kinh điển và chuẩn mực để xét nghiệm cholesteroltrong các bệnh viện từ trước đến hiện nay Nguyên tắc của phương pháp, lấyxét nghiệm cholesterol làm ví dụ, là sử dụng enzyme cholesterol oxidase(thường được ký hiệu là ChOx) để oxy hoá cholesterol trong mẫu thànhcholest-4-en-3-onevà giải phóng peroxide hydrogen (H2O2) Sau đó hydrogenperoxid được tạo thành bị enzyme peroxidase (hiệu là POD) (thông thườngenzyme POD hay được sử dụng nhất là horseradish peroxidase -HRP) phânhuỷ H2O2 và giải phóng oxy Oxy giải phóng oxy hoá chất chỉ thị, phổ biến là

hệ 4 – aminophenzon (4-AAP)/phenol hay hệ 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB) để tạo ra sản phẩm có màu đặc trưng (cơ chế được minh họa trên hình1.12), TBM tạo ra dạng TMB dạng oxi hóa có màu xanh lá cây Cường độ

màu tỷ lệ với hàm lượng cholesterolqua đó sử dụng đường chuẩn sẽ xác địnhđược nồng độ cholesterol.

Hình 1.7 Sơ đồ phản ứng enzyme dùng để xét nghiệm cholesterol theo

Cấu trúc của que thử.

Về nguyên tắc thì phương pháp so màu đã nói ở trên và phương pháp nàygiống nhau ở chỗ là sử dụng các enzyme đặc chủng (ChOx) để chuyển hóa chỉdấu sinh học là cholesterol thành cholest–4 –en – 3 –one tương ứng và giảiphóng ra H2O2 Sự khác biệt ở đây là tín hiệu đầu ra thu được là dòng điệndùng để hiển thị giá trị nồng độ các chỉ dấu sinh học trong mẫu thay vì thayđổi màu sắc như trong phương pháp so màu Cấu trúc và cấu tạo cảm biếnđiện hóa xét nghiệm cholesterol được mô tả như trên hình 1.13

1.3.3 Các xu hướng phát triển cảm biến cholesterol

1.3.3.1 Tổng hợp và ứng dụng các vật liệu thay thế enzyme cholesterol oxidase (ChOx) trong chế tạo cảm biến.

Gần đây một số báo cáo mới đã nghiên cứu thay thế cả 2 enzyme trongcảm biến phát hiện cholesterol Theo đó, kiểu thứ nhất là cảm biến sẽ không

sử dụng enzyme cholesterol oxidase mà sẽ sử dụng các vật liệu có hoạt tínhxúc tác để oxi hóa trực tiếp cholesterol Tuy nhiên phương pháp này có khánhiều nhược điểm, thứ nhất là sẽ không có độ chọn lọc vì không có đầu dòsinh học đặc hiệu; thứ hai là phải có các thiết bị/phương pháp hỗ trợ để ghinhận tín hiệu của quá trình đó như phương pháp điện hóa Joshi và cộng sự

[41] đã nghiên cứu sử dụng hệ compozit laponite (L) với

montmorillonite

(MMT) trong phân tán nước để phủ lên điện cực ITO sau đó dùng để oxi hóatrực tiếp axit ascorbic (AA), axit oxalic (OA), glucose (Glu) và cholesterol(ChO) bằng phương pháp quét thế vòng tuần hoàn Kiểu thứ hai trong xuhướng này là sử dụng các vật liệu nano và các nhóm chức có cơ chế tiếp nạpcholesterol vào một cấu trúc nào đó, sự tiếp nạp đó sẽ gây ra các thay đổi vềtính chất lý-hóa của hệ qua đó sẽ xác định được nồng độ cholesterol

1.3.3.2 Tổng hợp và sử dụng các vật liệu có hoạt tính xúc tác thay thế enzyme peroxidase (POD).

Một xu hướng có nhiều triển vọng hơn là xu hướng thay thế enzymeperoxidase trong hệ 2 enzyme Do enzyme peroxidase chỉ đóng vai trò là hiểnthị tín hiệu nên sự thay thế đó không gây ra các vấn đề về tính chọn lọc củacảm biến Hơn nữa các vật liệu vô cơ sẽ bền hơn và ổn định hơn enzyme PODnên khả năng sử dụng, vận hành sẽ thuận tiện hơn Có hai kiểu thay thếenzyme PDO: (i) kiểu thứ nhất là sử dụng các vật liệu nano vừa thay thế hoạttính của POD vừa có tính chất quang/điện để khi có H2O2 sẽ gây ra các phảnứng làm thay đổi tính chất quang/điện của các hạt nano này Kiểu này sẽ hìnhthành nên loại cảm biến là không đánh dấu (label-free) hay không chỉ thị(reagentless), hoạt động của cảm biến kiểu này vẫn tuân theo nguyên lý củacảm biến kinh điển (hình I.1), tuy nhiên sẽ đơn giản hơn vì không cần dùngchỉ thị oxi hóa khử; (ii) kiểu thứ hai là thay POD bằng vật liệu nano vô cơ

nhưng vẫn dùng các chỉ thị/cơ chất được gọi là kiểu phát hiện gián tiếp(indirect-detection mode) Cơ chế hoạt động loại này giống hệt nguyên lýtrong cảm biến cholesterol kinh điển đã nêu ở hình I.1.

Hình 1.9 Cảm biến màu cholesterol sử dụng hạt nano vàng (lõi)/bạc (vỏ)

thay thế enzyme POD [43].

Đặc trưng cho kiểu thứ nhất, X Zhang và các cộng sự [43] đã sử dụng

hệ nano bạc/nano vàng (AuNPs@AgNPs) cấu trúc lõi vỏ để phát hiệncholesterol theo cơ chế so màu Cơ chế được mô tả trên hình I.15.Theo đó, họchế tạo ra các hạt nano vàng làm lõi sau đó bọc lớp vỏ bạc bên ngoài, tínhchất của hạt này sẽ giống tính chất của nano bạc Sử dụng enzyme ChOx đểoxi hóa tạo ra H2O2, chất này sẽ ăn mòn lớp vỏ bạc làm hạt nano vàng lộ ra sẽlàm phổ UV-Vis thay đổi từ 1 pic của nano Ag ở khoảng 400 nm thành 2 pic(thêm 1 pic đặc trưng của nano Au ở 550 nm) (hình chèn ở I.10a) Ngoài ra,màu sắc của dung dịch cũng thay đổi (hình I.8b), khi đó màu sắc của dungdịch chuyển từ màu vàng (của nano Ag) thành màu cam hoặc màu tím (củanano Au) tùy vào nồng độ của cholesterol

Đối với kiểu thứ hai, đã có nhiều nghiên cứu đã thay thế enzymeperoxidase (POD) bằng các vật liệu có hoạt tính xúc tác tương tự nhưenzyme HRP, các vật liệu thường được sử dụng là các oxit kim loại chuyểntiếp như Co3O4[44]; Fe3O4[45-48], Prussian blue ( Fe7(CN)18 ) [49] hay cácvật liệu trên cơ sở carbon như C60[50] Các vật liệu tổ hợp trên cơ sở các oxittrên với các vật liệu như ống nano cacbon (CNTs), graphen/ graphen oxit như

Fe3O4/graphen [45, 46, 51], Fe2O3/graphene [51] để tăng cường hoạt tínhthông qua khả năng chuyển điện tích nhanh giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn,nhạy hơn Thêm vào đó, việc thay thế enzyme HRP làm cho cảm biến có thờigian bảo quản đơn giản hơn và dài hơn (vì enzyme HRP sẽ bị mất hoạt tínhkhi gặp ánh sáng nên để sử dụng chúng cần thao tác trong điều kiện thiếusáng ) Ngoài ra các kim loại quý và các vật liệu tổ hợp trên cơ sở các hạtnano kim loại này có hoạt tính xúc tác tương tự như enzyme HRP cũng đãđược nghiên cứu thay thế HRP trong phát hiện glucose như nano bạc(nanoAg)[52], nano platin (nano Pt) hay nano paladi (nano Pd) hay nanoPtPd[53].

Chẳng hạn, Nirala và các cộng sự [54], đã chế tạo thành công và ứngdụng các hạt nano graphen kích thước 2 -4 nm (GQDs) có hoạt tính xúc táctương tự như enzym HRP để chế tạo cảm biến so màu nhằm xác định nồng

độ cholesterol Nguyên lý hoạt động của cảm biến được mô tả trên hình 1.16

Hệ cảm biến sử dụng enzym đặc chủng cholesterol oxidase (ChOx) để oxi hóacholesterol thành cholest-4-ene-3-one và H2O2, sau đó GQDs có nhiệm vụxúc tác cho phản ứng giữa H2O2 và TMB (chất chỉ thị màu oxi hóa khử) đểtạo ra sản phẩm nước (H2O) và TMB dạng oxi hóa (TMBox) có màu xanh đặctrưng Đo cường độ màu của TMBox sẽ cho biết nồng độ cholesterol trongmẫu Cảm biến này có khả năng phát hiện cholesterol trong dải nồng độ từ0,02 – 0, 6 mM với giới hạn phát hiện (LOD) là 0,06 mM

Hình 1.70 Nguyên lý phát hiện cholesterol bằng phương pháp so màu sử

dụng hạt graphen nano (GQDs) thay thế enzyme HRP[54]

1.4 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU TRONG LUẬN VĂN

1.4.1 Vật liệu chấm graphen lượng tử (Graphene quantum

dots-GQDs)

Chấm graphene lượng tử hay chấm lượng tử cacbon (graphenequantum dots –GQDs hoặc hạt nano carbon -CQDs) là hạt nano carbon nhỏ(kích thước nhỏ hơn 10 nm) với bề mặt đã thụ động hóa GQDs được pháthiện đầu tiên bởi X Xu và các cộng sự vào năm 2004[55] một cách vô tìnhkhi chế tạo ống nano cacbon đơn tường ngăn Phát hiện này đã thu hút cácnhà khoa học tiến hành các nghiên cứu sâu rộng để khai thác các tính chấtphát huỳnh quang của GQDs Nhiều tiến bộ đã đạt được trong quá trình tổnghợp, tính chất và ứng dụng của GQDs GQDs là một loại cấu trúc mới của vậtliệu nano carbon huỳnh quang (hình 1.17), GQDs có các thuộc tính hấp dẫncủa sự ổn định cao, dẫn điện tốt, độc tính thấp, thân thiện với môi trường, cáctuyến đường tổng hợp đơn giản cũng như tính chất quang học so sánh với cácchấm lượng tử Chấm lượng tử Carbon đã được nghiên cứu rộng rãi đặc biệt

là do tính chất phát xạ mạnh và khả năng phát huỳnh quang của chúng, chophép các ứng dụng của chúng trong y sinh học, thiết bị quang điện tử, xúc tác,

và cảm biến

Hình 1.81 Sơ đồ cấu trúc của các vật liệu nano cacbon[56]

Tùy vào nguồn gốc tiền chất mà cấu trúc và thành phần của GQDs tạothành sẽ khác nhau và điều đó cũng ảnh hưởng lớn đến tính chất của chúng.Đáng chú ý là GQDs đã được ứng dụng trong cảm biến sinh học do khả năngphân tán cao trong nước, khả năng có thể điều khiển trong chế tạo, không độchại, độ ổn định quang tốt và khả năng tương thích sinh học tuyệt vời Cáccảm biến sinh học dựa trên GQD có thể được sử dụng để theo dõi hình ảnhcủa các tế bào, glucose, pH, phát hiện ion thủy ngân, và axitnucleic[57].Ngoài ra, theo các công bố mới đây thì GQDs cũng có thể được

sử dụng làm chất khử cho tổng hợp các hạt nano kim loại với độ phân tán tốt

và ổn định cao Trong luận văn này chúng tôi dùng GQDs làm chất khử đểtổng hợp ra hạt nano bạc (AgNPs)

Hình 1.9 Hai nguyên lý trong tổng hợp GQDs

Nhiều phương pháp đã được đề xuất để tổng hợp GQDs (Cacbon chấmlượng tử) trong thập kỷ qua, có thể được phân loại thành phương pháp tiếpcận "từ trên xuống dưới" và "từ dưới lên" và chúng có thể được điều chỉnhtrong quá trình tổng hợp hoặc xử lý sau tổng hợp (hình 1.18) Cần phải chú ýđến 3 vấn đề trong việc tổng hợp GQD: (i) sự kết hợp cacbon trong suốt quátrình cacbon hóa, có thể tránh được bằng cách sử dụng quá trình tổng hợpđiện hóa, hạn chế sự nhiệt phân hoặc những phương pháp phân tán hóa học,

(ii) kiểm soát kích thước và tính đồng nhất, quan trọng trong nghiên cứu về cơchế và tính đồng nhất và có thể được tối ưu hóa thông qua quá trình xử lý sautổng hợp, như điện di gel, ly tâm, thẩm tích và (iii) các tính chất bề mặt có vai

trò quan trọng đối với độ hòa tan và độ chọn lọc, có thể điều chỉnh trong quátrình tổng hợp hoặc xử lý sau tổng hợp Chúng tôi sẽ thảo luận về các phươngpháp chính để tổng hợp GQDs, kiểm soát kích thước thông qua nhiệt phân vàbiến tính GQDs, bao gồm chức năng hóa, doping (pha tạp) và nanohybrids(vật liệu lai ghép cấp độ nano) Tùy vào mục đích, nhu cầu mà phương pháptổng hợp có thể linh hoạt lựa chọn để tổng hợp GQD.

1.4.2 Vật liệu nano bạc (silver nanoparticles- AgNPs)

Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng

để làm chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi… Có thể kể một vài sản phẩmchứa hạt nano bạc như: (i) Các dụng cụ chứa thực phẩm: Những đồ dùngbằng nhựa có pha thêm hạt nano bạc có tác dụng khử trùng Qua kiểm tra chothấy chúng có khả năng diệt 99.9% vi khuẩn; (ii) Đồ may mặc: hạt nano bạcđược tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử mùi; (iii) Các thiết bị điện tử:Điều hòa, tủ lạnh, máy giặt; (iv) Ứng dụng trong Y tế như khẩu trang nanobạc: Được thiết kế với 3-4 lớp gồm 2 lớp vải, một lớp vật liệu tẩm nano bạc

và than hoạt tính ở giữa, loại khẩu trang này có khả năng diệt khuẩn, diệtvirus, lọc không khí rất tốt Lớp vải tẩm nano bạc có chức năng diệt vi khuẩn,virus, nấm bị giữ lại trên khẩu trang đồng thời có tác dụng khử mùi; (v) Sản

xuất thuốc chữa bệnh; (vi) Ứng dụng trong màng hô hấp: Đó là một tấm màngmỏng có thể cho khí và hơi nước qua nhưng không thể cho chất lỏng đi qua,

có vô số những lỗ khí nhỏ tồn tại trong tấm film Các hạt nano bạc gần đây đãđược kết hợp với film polyolefin với đặc tính kháng khuẩn rất tốt và (vii) cácsản phẩm tiêu dùng khác như các dung dịch xịt khử mùi cho tủ lạnh, cho giầydép; nước sục miệng; bàn chải đánh rắng…Ngoài ra, các hạt nano bạc có hiệntượng cộng hưởng plasmon bề mặt Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàngnhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụthuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano Do các thuộc tính quang học củadung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ củahạt (hình 1.19a), nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định các thuộc tínhtrên Do hạt nano bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặtplasmon duy nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duynhất (hình 1.19b) Người ta xử dụng tính chất này để xác định hình dạng củahạt nano bạc Trong nghiên cứu này chúng em sử dụng tính chất này củaAgNPs và kết hợp với tính chất hóa học của bạc để phát triển nên cảm biếnxác định nồng độ hydrogen peroxide và Cholesterol theo phương pháp somàu[58-60]

1.5 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Việc nghiên cứu chế tạo các thiết bị thử y tế (que thử, bộ kit thử…) phục

vụ theo dõi, kiểm tra sức khỏe tại nhà có nhu cầu ngày càng lớn, chẳng hạncác cảm biến đo đường huyết, để sớm phát hiện ra các bệnh tật nhằm chữa trịkịp thời cũng như để theo dõi sự ổn định của sức khỏe Rộng hơn, nghiên cứuchế tạo các cảm biến sinh học có độ nhạy cao, phát hiện nhanh, hàng loạt sẽmang lại giá trị vô cùng to lớn trong xét nghiệm ở các bệnh viện Đề tài sẽ bắtđầu từ việc chế tạo các vật liệu cấu trúc nano có hoạt tính phân hủy H2O2 và

từ đó ứng dụng để chế tạo cảm biến sinh học phát hiện hydrogen peroxide(H2O2) vì H2O2 là sản phẩm của quá trình phân hủy các phân tử nhỏ cần pháthiện như cholesterol…bởi các enzyme đặc hiệu tương ứng (ChOx), cho nênphát triển các cảm biến H2O2 có độ nhạy cao, độ đặc hiệu lớn, nhanh, rẻ…cũng chính là một bước quan trọng để tiến tới chế tạo các cảm biến nói

trên Tiếp theo, trên cơ sở cảm biến H2O2 đề tài sẽ sử dụng để cấu trúc nêncảm biến phát hiện cholesterol Như đã trình bày ở phần trên, cảm biếncholesterol cũng như cảm biến H2O2 có thể phát triển theo 2 hướng, cảm biến

so màu (quang học) hoặc cảm biến điện hóa, cả 2 loại này về nguyên lý hoạtđộng và vận hành hoàn toàn giống nhau, chỉ khác tín hiệu đầu vào/ra là quanghay điện, chính vì vậy, để phát triển cảm biến có thể phát hiện hàng loạt(array), đề tài tập trung vào cảm biến quang học (theo phương pháp so màu),

so với cảm biến điện hóa để phát hiện hàng loạt thì cảm biến so màu đơn giảnhơn về mặt chế tạo và chi phí cũng thấp hơn.Mục tiêu của đề tài là:

(1) Tổng hợp vật liệu chấm lượng tử cacbon (Carbon Quantum Dots – GQDs)

(2) Vật liệu tổ hợp của chúng với hạt nano bạc (AgNPs/GQDs) có hoạt tính xúc tác cho quá trình phân hủy H2O2 một cách nhanh chóng, triệt để

(3) Sử dụng các vật liệu trên để thiết kế và chế tạo ra các cảm biến sinh học nhằm phát hiện hydrogen peroxit (H2O2) và cholesterol

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ

2.1.1 Hóa chất, vật liệu

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu này gồm:

- Axit xitric monohydrate (C6H8O7.H2O) (A.R, Trung Quốc);

- Thio-ure (SC(NH2)2) (A.R, Trung Quốc);

- Urea(CH4N2O)(A.R, Trung Quốc);

- AgNO3 tinh thể (Sigma Aldrich -Đức).;

- NaOH (A.R, Trung Quốc);

- HCl (A.R, Trung Quốc);

- Viên đệm PBS (Sigma Aldrich -Đức);

- Glucose (C6H12O6) (A.R, Sigma Aldrich -Đức),

- Saccarose( C12H22O11)

- Axit Ascorbic( C6H12O6) (A.R, Sigma Aldrich -Đức),

- Cholesterol (C27H46O) (A.R, Sigma Aldrich -Đức),

- Axit Acetic (CH3COOH)(A.R, Trung Quốc);

- Hydro peroxide (H2O2) dung dịch 30%(A.R, Trung Quốc);

-Cholesterol oxidase (ChOx) (Sigma Aldrich-Đức);

- Nước cất 1 lần được dùng để chế tạo vật liệu và pha chế các dung dịch

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị

- Máy ly tâm tốc độ cao Tommy (Nhật), (tốc độ tối đa 15.000

vòng/phút);

- Máy ly tâm mini Cubee (tốc độ tối da 4.000 vòng/phút);

-Bể điều nhiệt Laudra (Pháp);

- Các dụng cụ thủy tinh khác như cốc, ống đong, bình tam giác…2.2 CHẾ TẠO VẬT LIỆU CQDs VÀ AgNPs/GQDs

2.2.1 Chế tạo cacbon dots bằng phương pháp từ dưới lên up)

(bottom-GQDs được tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt theo quy trình đã công bố trước đây của nhóm [56].Theo đó, 1 mmol axit xitric (0,21 g) và 0,18 gurê (3 mmol) hòa tan trong 5 ml nước Cho hỗn hợp trên vào autoclave và tiến hành gia nhiệt ở 160 oC trong vòng 8h Làm nguội tự nhiên về nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong vòng 30 phút để thu được chất rắn là bột nano cacbon (GQDs) Sấy khô ở 80 oC trong 10h để thu được GQDs ở dạng bột màu nâu đen, đem phân tán lại trong nước cất thu được dung dịch GQDs

2.2.2 Chế tạo vật liệu nano Ag/Cacbon dots (AgNPs/GQDs)

Quy trình tổng hợp tiến hành theo điều kiện tối ưu trong công bố trướcđây của nhóm[56], cụ thể: Dùng bình thủy tinh sạch để lấy 15 ml dung dịch gốc GQDs pha trong 500mL nước cất ( đo pH=9, dung dịch GQDs có màu vàng nhạt) Tiếp theo dùng một bình thủy tinh sạch khác lấy lần lượt 300mL dung dịch GQDs thêm từ từ dung dịch CH3COOH 0,1 M đến pH = 7, sau đó thêm từ từ 50 ml dung dịch AgNO3 nồng độ 0,1 M, thêm tiếp 100mL nước cất để thu được 450mL dung dịch khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ

Để phản ứng tiến hành ở nhiệt độ 900C trong máy ổn định nhiệt khoảng 2 giờ thì được kết tủa đen Lấy bình ra để nguội ở nhiệt độ phòng sau đó đem ly tâm thu được AgNPs/GQDs Rửa sạch bằng cồn, sấy khô ở nhiệt độ phòng thu được bột AgNPs/GQDs Đem phân tán bột trong nước cất thu được dungdịch AgNPs/GQDs màu đỏ đậm

2.3 CHẾ TẠO CẢM BIẾN H2O2 VÀ CHOLESTEROL

2.3.1 Chế tạo cảm biến phát hydrogen peroxide

Pha dung dịch H2O2 với các nồng độ khác nhau Lấy 200 L dung dịch

H2O2 đã chuẩn bị cho vào ống eppendorf loại 1,5ml Sau đó, cho vào đó 1 mL

dung dịch AgNPs/GQDs, lắc trộn dung dịch trên máy vortex trong khoảng 10giây rồi đem ống eppendorf ngâm vào bể ổn nhiệt ở 40oC trong vòng 45 phút.Lấy ống eppendorf ra, để nguội đến nhiệt độ phòng và đem đo độ hấp thụquang của dung dịch ở bước sóng 417nm (OD425nm) Phần trăm chênh lệch

độ hấp thụ quang ở 417nm ((A/A) của dung dịch có và không có mặt H2O2

được sử dụng làm tín hiệu của cảm biến để xác định nồng độ H2O2 trong mẫutheo công thức:

(II.1)Trong đó: A =A0 - ACvới A0và AClần lượt là độ hấp thụ quang A ởbước sóng 417nm (OD425nm) của dung dịch AgNPs/GQDs trước và sau khi

có mặt H2O2 ở nồng độ C (mM)

Trên cơ sở thí nghiệm này, các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng đãđược khảo sát và tối ưu, bao gồm:

(i) thời gian phản ứng;

(ii) yếu tố môi trường (pH);

(iii) nhiệt độ phản ứng

Để khảo sát độ chọn lọc của cảm biến, các phân tử khác được sử dụngthay thế dung dịch H2O2 như dung dịch glucose; axit ascorbic; saccarose vànước cất Quy trình thí nghiệm không có gì thay đổi như đã nêu ở trên

2.3.2 Chế tạo cảm biến cholesterol

Trước hết, 100 μL dung dịch cholesterol với các nồng độ khác nhau (từ0,1 mM đến 2 mM) pha trong 75μL đệm PBS (pH=7) được lấy vào ốngeppendorf, tiếp đó 25 μL dung dịch ChOx (nồng độ 2 mg.mL-1pha trong đệmPBS nồng độ 0.001 M) được thêm vào trong ống Hỗn hợp được khuấy trộnbằng máy votex trong 30 giây, sau đó đem ủ trong bể ổn nhiệt ở 40 oC trong 1giờ Tiếp theo, 1 mL dung dịch AgNPs/GQDs được thêm vào ống, hỗn hợpđược trộn đều rồi ủ trong bể ổn nhiệt ở 40 oC trong vòng 45 phút, sau đó lấy

ra để nguội đến nhiệt độ phòng rồi chuyển vào cuvet để đo độ hấp thụ A ởbước sóng 417nm Phần trăm chênh lệch độ hấp thụ ở bước sóng 417nm

(A/A) được dùng làm tín hiệu để xác định nồng độ cholesterol trong mẫutheo công thức (2.1) tuy nhiên, với A =A0 - AC với A0 và AC lần lượt là độhấp thụ quang A ở bước sóng 417nm (OD425nm) của hỗn hợp chứaAgNPs/GQDs khi không có và có mặt cholesterol ở nồng độ C (mM).

2.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VẬT LIỆU VÀ CẢM BIẾN

2.4.1 Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction-XRD )

Bản chất vật lý của tia X là bức xạ sóng điện từ vừa có tính chất sóngvừa có tính chất hạt Tia X được truyền đi trong không gian với tốc độ ánhsáng và mang năng lượng từ 200eV đến 1 MeV và được xác định theophương trình:

Trong đó: v (Hz) là tần số của bức xạ tia X; λ (A0 ) là bước sóng củabức xạ tia X; c là số tốc độ ánh sáng, c=3.108 m/s; h là hằng số Planck,h=6,62x10-34 J.s

Cơ sở của phương pháp nhiễu xạ tia X là dựa vào hiện tượng nhiễu xạcủa chùm tia X trên mạng lưới tinh thể Khi bức xạ tia X tương tác với vậtchất sẽ tạo hiệu ứng tán xạ đàn hồi với các điện tử của các nguyên tử trong vậtliệu có cấu trúc tinh thể, sẽ dẫn đến hiện tượng nhiễu xạ tia X Theo lý thuyếtcấu tạo tinh thể, mạng tinh thể được xây dựng từ các nguyên tử hay ion phân

bố đều đặn trong không gian theo một trật tự nhất định Khi chùm tia X tới bềmặt tinh thể và đi sâu vào bên trong mạng lưới tinh thể thì mạng lưới nàyđóng vai trò như một cách tử nhiễu xạ đặc biệt Các nguyên tử hoặc ion bịkích thích bởi chùm tia X sẽ thành các tâm phát ra các tia phản xạ Mặt khác,các nguyên tử hoặc ion này được phân bố trên các mặt phẳng song song Mốiliên hệ giữa khoảng cách hai mặt nhiễu xạ song song (dhkl ), góc giữa chùmtia X và mặt phẳng phản xạ (θ) với bước sóng (λ) được biểu thị bằng hệphương trình Vulf – Bragg (hình 2.1):

Hình 2.1 Sơ đồ chùm tia tới và chùm tia nhiễu xạ trên tinh thể

Đây là phương trình cơ bản để nghiên cứu cấu trúc tinh thể Căn cứ vàocực đại nhiễu xạ trên giản đồ (giá trị 2θ) có thể suy ra d theo công thức trên

So sánh giá trị d tìm được với giá trị d chuẩn sẽ xác định được cấu trúc mạngtinh thể chất cần nghiên cứu (hình 2.2) Thông qua giản đồ XRD ta cũng cóthể tính được kích thước trung bình của hạt theo phương trình Scherrer:

(II.4)

Trong đó: λ là bước sóng của tia X, trong phép đo này λ = 1,5406 A0; θ

- góc nhiễu xạ Brag (độ); D: kích thước hạt (nm); B=β1/2: độ rộng bán chiều

cao của đỉnh nhiễu xạ có cường độ mạnh nhất (rad)

Hình 2.2 Độ tù của pic phản xạ gây ra do kích thước hạt

Hình 2.3 Thiết bị đo nhiễu xạ tia X

Trong luận văn này các mẫu được đo XRD trên thiết bị đo D8 Advance(Bruker) dùng bức xạ của CuKα, λ=1,5406 A0, khoảng quét 2θ = 1-700

2.4.2 Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM: Transmission ElectronMicroscope) được phát triển từ năm 1930 là công cụ kĩ thuật không thể thiếucho nghiên cứu vật liệu Dựa trên nguyên tắc hoạt động cơ bản của kính hiển

vi quang học, kính hiển vi điện tử truyền qua có ưu điểm nổi bật nhờ bước sóngcủa chùm electron ngắn hơn rất nhiều so với ánh sáng nhìn thấy nên nó có thểquan sát với kích thước cỡ 0,2 nm Ảnh thu được từ kính hiển vi điện tử truyềnqua cho ta hình dạng và kích thước của hạt chất nghiên cứu Các electron từcatot bằng dây Vonfram đốt nóng đi tới anot và được hội tụ bằng “thấu kính từ”lên mẫu đặt trong chân không Tác dụng của tia electron tới mẫu có thể tạo rachùm electron thứ cấp, electron phản xạ, electron Auger, tia X thứ cấp, phátquang catot và tán xạ không đàn hồi với đám mây electron truyền qua mẫu đượckhuếch đại và ghi lại ở dạng ảnh huỳnh quang hoặc ảnh kỹ thuật số

Nhiễu xạ electron có thể cung cấp những thông tin rất cơ bản về cấutrúc tinh thể và đặc trưng vật liệu Chùm electron nhiễu xạ từ vật liệu phụthuộc vào bước sóng của chùm electron tới và khoảng cách mặt mạng trongtinh thể, tuân theo định luật phản xạ Bragg như đối với nhiễu xạ tia X: 2dsin