U NGUYÊN bào VÕNG mạc tư vấn DI TRUYỀN và CHẨN đoán GEN

BỘ Y TẾ BỆNH VIỆN MẮT TRUNG ƯƠNG CHUYÊN ĐỀ U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC TƯ VẤN DI TRUYỀN VÀ CHẨN ĐOÁN GEN HÀ NỘI - 2016 MỤC LỤC 1 ĐẠI CƯƠNG U nguyên bào võng mạc (UNBVM) khối u bào thai ác tính trẻ nhỏ có nguồn gốc từ tế bào nón võng mạc Tỷ lệ xuất 1/15000-20000 trẻ 90% xuất trước tuổi Khả bảo tồn nhãn cầu hay khơng phụ thuộc vào chẩn đốn có sớm không? Mặc dù phương pháp điều trị có nhiều tiến bộ, tiên lượng thị lực nhiều vấn đề, đặc biệt thị trung tâm khối u nằm vùng hoàng điểm 2/3 số trường hợp bị bệnh mắt tuổi mắc bệnh trung bình tuổi 1/3 số trường hợp bệnh mắt, xuất sớm lứa tuổi trung bình tuổi Đa số trường hợp bị hay mắt mang tính ngẫu nhiên khơng có tiền sử gia đình 10-15% có tiền sử gia đình Phương thức di truyền trội liên kết nhiễm sắc thể (NST) thường thâm nhập cao Khi bệnh mắt chẩn đoán sớm 1.1 Chẩn đoán Các dấu hiệu đến khám ánh đồng tử trắng lác Có khám sàng lọc trẻ từ gia đình có nguy cao lại phát thấy khối u Chẩn đoán dựa vào soi đáy mắt có gây mê, siêu âm Khối u phát triển vào dịch kính hay phát triển bên gây bong VM Phân loại u theo giai đoạn Reese Ellsworth thấy giai đoạn muộn tiên lượng xấu Siêu âm thấy can xi hoá Chụp cộng hưởng từ MRI cho thấy khối u xâm lấn cấu trúc khác nhãn cầu Nếu phải khoét bỏ nhãn cầu xét nghiệm giải phẫu bệnh lại hỗ trợ thêm cho chẩn đoán phân chia giai đoạn Điều trị bảo tồn bao gồm hoá trị liệu, tia xạ, quang đông Khoét bỏ nhãn cầu dành cho u tiến triển 1.2 Các yếu tố dẫn đến bệnh ung thư VM Năm 1971, Knudson dưa mơ hình giải thích UNBVM di truyền mang tính gia đình lại mắt, xuất sớm UNBVM khơng mang tính gia đình lại hay xảy mắt xuất muộn Tác giả đề giả thuyết phải có đột biến xảy với gen kiểm sốt q trình phân chia tế bào ngoại bì thần kinh hạn chế xuất khối u, chưa đủ để làm xuất bệnh UNBVM Ở thể hai mắt, đột biến tế bào mầm, xảy tất tế bào thể đặc biệt tế bào ngoại bì thần kinh Đột biến thứ nhiễm sắc thể (NST) thường mắc phải tháng đầu thời kỳ bào thai (H 1) Xác suất đột biến NST thường gen quan trọng tế bào võng thấp, có khả đột biến đơn xuất gây UNBVM đột biến có sẵn từ trước Điều giải thích trẻ bị đột biến tế bào gốc có nguy xuất bệnh khơng với khối u mà với nhiều khối u Năm 1970, Coming cho thấy đột biến gây xuất UNBVM có bất hoạt alen gen, điều thời Knudson chưa tìm thấy Hình Ở trường hợp mang tính gia đình, đột biến tế bào gốc cha hay mẹ truyền cho Ở thể UNBVM hai mắt rời rạc thể bị nhiều khối u mắt bị UNBVM, đột biến tế bào gốc thường đột biến hoàn toàn xuất tế bào sinh dục cha hay mẹ (trước tạo hợp tử) hay giai đoạn sớm sau thụ thai (sau tạo hợp tử) Đột biến có trước tạo hợp tử kèm cha mẹ lớn tuổi Có số trường hợp, UNBVM xuất rời rạc (sporadic) gen đến từ cha hay mẹ thâm nhập khơng hồn tồn Cho nên dù nguy cao, thâm nhập khơng hồn tồn cha hay mẹ có đột biến tế bào gốc khơng có u võng mạc nhỏ có UNBVM tự thối triển biểu sẹo võng mạc hay u võng mạc lành tính (H 2) Hình Khối u võng mạc thối triển Cho nên cần khám đáy mắt cha hay mẹ để xác định u võng mạc lành tính cho dù tiền sử gia đình khơng có vấn đề thái độ tư vấn di truyền thay đổi hoàn tồn Vấn đề nói kỹ phần tư vấn Đa số trường hợp bị bệnh mắt đột biến xảy NST thường Tuy nhiên 10% bệnh nhân có UNBVM mắt có đột biến tế bào gốc Một số bệnh nhân có u tuyến tùng gọi UNBVM ngồi mắt hay gọi UNBVM ba mắt (H 3) Nguy xuất khối ung thư thứ người có đột biến gen RB1 bên cạnh UNBVM nói đến Trẻ em hay niên bị UNBVM bị saccom xương hay saccom tổ chức mềm Tia xạ làm khởi phát u này, nhiên u xuất vùng tia xạ hay bệnh nhân chưa tia xạ 8,4% bệnh nhân có u ác tính thứ phát 18 năm sau bị UNBVM thể di truyền Trong 6% saccom xương Ngồi người đột biến gen RB1 sau dễ bị khối u biểu mô khác phổi, bàng quang, tuyến vú u hắc tố bào ác tính (melanoma) Nghiên cứu bệnh nhân UNBVM sống đến 86 tuổi thấy tỷ lệ 68% A B Hình Khối u tuyến tùng khối u hai mắt 1.3 Gen RB1 Năm 1963, tác giả phát đột biến đoạn NST 13 mức tế bào gốc (sau gọi NST nhóm D) số bệnh nhân bị UNBVM mắt, có trì trệ tinh thần dị dạng khác Các nghiên cứu so sánh sau tế bào gốc điểm thị di truyền khối u đoạn 13q14 thấy có có tính dị hợp tử 65% số khối u Nói cách khác, 1/2 số khối u có tượng hồn tồn vùng NST Các tác giả nhận thấy thể UNBVM di truyền, alen lại tế bào khối u alen có tất thành viên gia đình bị mắc Đó alen tạo điều kiện cho UNBVM Phân tích nhiều khối UNBVM xác định vùng nhỏ đoạn 13q14 nghiên cứu chuyển hướng tập trung vào vùng Năm 1986, xác định gen khu trú vùng quan tâm hình thành vị trí có đột biến bất hoạt tế bào gốc trẻ em bị UNBVM mắt khẳng định gen tương ứng với gen dễ đưa đến UNBVM Gen đặt tên RB1 (H 4) Việc xác định RB1 khẳng định giả thuyết Knudson Coming, mở lĩnh vực xét nghiệm gen dẫn đến ung thư cho phép xác định nguy bị UNBVM số gia đình đặc biệt Hình RB1 protein trình phân bào RB1 khơng hoạt động trạng thái phosphoryl hóa, phức hợp men cdk làm phospho RB gắn với E2F gây bất hoạt chất ngăn tế bào chuyển từ giai đoạn G1 vào giai đoạn phân bào S Gen RB1 mã hố cho protein có trọng lượng phân tử 110 kD, với protein p107 p130 chúng tạo thành nhóm protein túi (pocket protein) Các protein có phần chung gọi vùng túi cho phép gắn với yếu tố chép họ yếu tố E2F Trong chu trình tế bào G1/S, protein RB gắn với yếu tố E2F ức chế chuyển sang pha S Ngược lại trình phosphoryl hố RB giải phóng yếu tố E2F chu trình tế bào hồn tất Protein RB khơng tham gia vào điều hồ chu trình tế bào mà kiểm sốt kết thúc q trình biệt hố q trình phát triển Nó tương tác với 100 protein khác Vai trò q trình biệt hố protein giải thích UNBVM có nguy xuất sớm gây phá huỷ tế bào ngoại bì thần kinh trẻ nhỏ (H 5) Hình RN protein khơng hoạt động nên khơng điều hòa E2F, hậu trình phân bào diễn liên tục 1.4 Quy trình tư vấn di truyền Khi chẩn đốn UNBVM mắt hay hai mắt đứa trẻ cần xác định xem có yếu tố di truyền hay khơng đứa trẻ có khả bị mắc bệnh hay khơng? Cần phân tích tiền sử gia đình tiền sử bệnh thân bệnh nhân để xác định yếu tố di truyền, nguy mắc bệnh thành viên khác gia đình đứa tẻ hướng dẫn bác sĩ mắt theo dõi thành viên (anh em, bà hay cháu bệnh nhân) Có thể tính xác suất người bà đứa trẻ bị UNBVM có yếu tố di truyền bệnh hay khơng Các phép tính dựa yếu tố sau: 1/ 100% bệnh nhân bị UNBVM mắt 10% bệnh nhân bị UNBVM mắt coi có mang yếu tố di truyền 2/ Cách thức di truyền trội, cha hay mẹ mang gen có 1/2 nguy truyền gen cho đứa 3/ Mức độ xâm nhập 90% lúc sinh, có nghĩa người trưởng thành khơng bị UNBVM nhỏ có xác suất mang gen bệnh thấp 10 lần so với xác suất sinh (H 6) Hình Một số phả hệ đặc biệt Dựa phân tích so sánh nhiều cách tiếp cận theo dõi mắt khác nhiều nước, tác giả viện Curie đề hướng dẫn theo dõi UNBVM người thân bệnh nhân Cách thức theo dõi tuỳ thuộc vào xác suất yếu tố di truyền đứa trẻ theo dõi, tuỳ thuộc vào tuổi đứa trẻ mức độ quan hệ thân thiết với đứa trẻ bị bệnh dựa vào phân bố tuổi lúc chẩn đoán đứa trẻ có yếu tố di truyền theo dõi kể từ lúc sinh Trong 50 trẻ có yếu tố di truyền theo dõi từ sinh, chẩn đoán UNBVM xác định trước tháng tuổi 80% số trường hợp, trước 18 tháng tổi 92% số trường hợp lúc tuổi trường hợp Cuối cùng, với mức nguy thấp cần theo dõi bệnh mắt, cần khám đáy mắt có giãn đồng tử tháng lần lúc 24 tháng tuổi để đảm bảo phòng bệnh triệt để Hướng dẫn chặt chẽ, khám mắt có gây mê tháng đầu, chí tuần đầu chuyên khoa nhãn nhi Chẳng hạn trường hợp có 50% nguy người 10 (1/200) đến 0,0125% (1/8000) 6/ Anh chị em bệnh nhân bị UNBVM mắt ổ không di truyền 7/ Người bà cấp thứ (anh chị em họ) bệnh nhân UNBVM mắt không di truyền 8/ Cháu trai hay cháu gái bệnh nhân có UNBVM mắt khơng di truyền -Tháng tuổi -3 tháng lần lúc tuổi -6 tháng lần tuổi Nguy UNBVM khoảng 0,005% (1/20000) (~nguy quần thể nói chung) 10/ Các bà cấp bệnh nhân bị UNBVM mắt không di truyền Không cần theo dõi Các phép tính nguy ý đến 1/ 100% bệnh nhân bị UNBVM mắt 10% bệnh nhân UNBVM mắt mang gen bệnh 2/ Di truyền trội 3/ 90% thâm nhập lúc sinh lý thuyết người trưởng thành khơng có UNBVM thời nhỏ có xác suất mang gen thấp gấp 10 lần so với xác suất sinh Hướng dẫn cần trì khơng có khám nghiệm di truyền hay chờ kết xét nghiệm tất bệnh nhân bị 11 UNBVM mắt hay hai mắt, sau xét nghiệm bà con, tuỳ theo kết giúp tránh theo dõi sàng lọc không cần thiết nhiều trẻ 1.5 Tư vấn Hiện có kiến nghị xét nghiệm gen RB1 tất bệnh nhân có UNBVM mang tính gia đình hay rời rạc, mắt hay mắt Cần xét nghiệm di truyền tư vấn có phối hợp bác sĩ mắt, nhi, u bướu xạ trị Khi xây dựng phả hệ để xác định thành viên khác gia đình bị khối u khác đặc biệt trường hợp UNBVM khác Bệnh nhân hay cha mẹ bệnh nhân cần thông tin nguy di truyền UNBVM Khám đáy mắt cha mẹ để phát u VM lành tính, tín hiệu yếu tố di truyền mà khai thác tiền sử gia đình nhiều khơng phát Khám đáy mắt bà thân thuộc bệnh nhân UNBVM Lấy máu xét nghiệm gen RB1 để xác định đột biến tế bào gốc Cần ký giấy cam kết trước làm xét nghiệm hay sàng lọc tìm gen RB1 Sau xét nghiệm, kết gửi đến chuyên gia tư vấn di truyền Đưa kết cho cha mẹ hay lưu trung tâm tối thiểu 30 năm để đề phòng bệnh nhân quay lại khối u lúc trưởng thành Hiện nay, xét nghiệm tươi tế bào khối u xác định đột biến nên thực hiện, xét nghiệm đột biến tế bào bạch cầu bệnh nhân tránh nguy bệnh tái xuất anh chị em ruột hay bà (H 7) Hình Xác suất dự kiến với thể UNBVM 12 Xác suất thay đổi theo số mắt bị bệnh, u ổ hay nhiều ổ võng mạc 1.6 Xử trí theo dõi lâm sàng Khi thấy có đột biến trẻ bị bệnh, xét nghiệm di truyền dựa vào việc sàng lọc đột biến nên tiến hành với anh chị em Không cần theo dõi mắt người bà xét nghiệm di truyền khơng thấy có đột biến gia đình Xét nghiệm di truyền nên làm với cha mẹ Nếu cha hay mẹ có mang đột biến, cần chẩn đoán trước sinh với lần mang thai Nếu cha mẹ không mang đột biến, gia đình đảm bảo để khơng phải khám mắt bà Trái lại, xác định mức biểu đột biến trẻ bị bệnh, tế bào sinh dục cha hay mẹ, tượng đột biến hoàn toàn xảy (định lượng tượng khảm tế bào gốc) nói cách khác, khơng thể loại trừ nguy tái xuất bệnh anh chị em trẻ mắc bệnh Trong trường hợp này, với trẻ sinh gia đình, cần xác định gen giai đoạn sinh Có thể tiến hành chẩn đốn trước sinh với trường hợp Khi khơng thấy có đột biến gen RB1 trẻ mắc bệnh: Trong trường hợp UNBVM mắt, kỹ thuật sàng lọc di truyền có hạn chế định khơng tìm thấy đột biến, cần tiếp tục theo dõi bà bệnh nhân (Bảng 1) Cũng thấy tượng khảm tế bào (mosaic) gen RB1 biến đổi q trình phát triển bào thai không biểu DNA bạch cầu Nếu đột biến xảy tế bào gốc, bệnh nhân truyền đột biến cho cháu Hiện có quan điểm nên khám nghiệm gen lại lần sinh với bệnh nhân có tiền sử lúc nhỏ mắc UNBVM mắt mà xét nghiệm gen RB1 thấy âm tính Xét nghiệm RB1 trực tiếp Sàng lọc đột biến tiến hành với tất trường hợp bị UNBVM Xác định thấy đột biến Không xác định thấy đột biến -Tìm gen anh -Tìm gen cha mẹ 1-Phân tích di truyền tế bào- 13 chị em RB1 FISH NST -Tìm gen metaphase cháu 1-Có đột biến 2-Xét nghiệm gián tiếp (với 1-Có đột biến Tiếp tục theo dõi -Chẩn đốn trước hay sau 2-Khơng có đột sinh biến -xét nghiệm anh chị em Dừng theo dõi bố/mẹ mang gen 2-Không có đột biến -Chấn đốn sau sinh -Cân nhắc chẩn đốn trước sinh (giả thuyết khảm tế bào gốc) -Khơng xét nghiệm anh chị em cha hay mẹ DNA khối u có) -Cơ thực gia đình trẻ bị bệnh -Cho phép dừng theo dõi trẻ chung alen RB1 trẻ bị bệnh 3-Xét nghiệm trực tiếp cháu bệnh nhân -giả thuyết khảm tế bào đích 4-Cân nhắc xét nghiệm trực tiếp DNA khối u 14 Bảng Hướng dẫn xử trí theo dõi lâm sàng Trong trường hợp UNBVM mắt rời rạc, người tư vấn di truyền yên tâm hơn, nguy yếu tố di truyền thấp (1% so với 10%, cho độ nhạy sàng lọc 90%, xem đây) Tuy nhiên cần lưu ý lại có vấn đề hạn chế kỹ thuật nguy tượng khảm Cho nên cần tiếp tục khám mắt với cháu bệnh nhân (Bảng 1) Tuy nhiên xác suất yếu tố di truyền trẻ bị UNBVM mắt 1%, nguy cháu mắc bệnh 0,00125% hay 1/80 000 nghĩa thấp quần thể nói chung Và lý dừng theo dõi khám mắt Ở thể mang tính di truyền có trường hợp mắc bệnh, xét nghiệm gen gián tiếp nhanh chóng tìm thấy đột biến alen gen RB1 Có thể sử dụng phương pháp để phát người thân xem có alen di truyền đột biến khơng cho phép chẩn đoán trước sinh Xét nghiệm di truyền gián tiếp áp dụng với gia đình có trường hợp bị mắc UNBVM, lúc chờ kết sàng lọc RB1 hay không thấy có đột biến Mục đích trường hợp để dừng theo dõi mắt trẻ khơng có alen RB1 giống anh chị em mắc bệnh UNBVM, tức 1/4 hay 1/2 thấy có tính dị hợp (loss of heterozygosity) tế bào khối u bệnh nhân, chứng tỏ alen lại alen di truyền bệnh Cần nhấn mạnh trẻ có alen giống bệnh nhân, xác suất người có mang đột biến RB1 thấp (H 1) Tuy nhiên, để cẩn thận, nên tiếp tục theo dõi mắt mà không cần chẩn đốn trước sinh hồn cảnh 1.7 Một số lưu ý Đã từ lâu, người cho tất bệnh nhân có đột biến gen RB1 bị UNBVM loại tổn thương mức độ phân tử Tuy nhiên, nguy gia đình xác định rõ dị hợp, số người không bị UNBVM số lại bị UNBVM mắt hay chí 15 bị khối u thứ phát Có thể đánh giá mức độ nghiêm trọng nguy dựa tỷ lệ-bệnh-mắt (DER), vốn coi cho thấy mức độ xâm nhập mức độ biểu gen DER tỷ số số mắt bị bệnh/ số người mang gen gia đình Một vấn đề tư vấn di truyền với UNBVM đánh giá nguy mắc khối u với đứa trẻ chưa sinh có đột biến gen RB1 tế bào gốc Khi cần có hiểu biết mối quan hệ kiểu gen-kiểu hình Nói chung, thể mang đột biến hệ thứ biểu kiểu hình tượng khảm xảy Loại tổn thương thay đổi theo loại đột biến Những cá thể mang đột biến gây đoạn protein (stop, frameshift) có nguy cao lớn 90% bị UNBVM mắt (DER = 1,85) Cần lưu ý, số đột biến đoạn exon gây UNBVM mức độ thâm nhập thấp khởi phát tương phiên thay Vấn đề phức tạp với loại đột biến mô tả Đột biến nối đoạn (splicing) kèm theo tỷ số DER thấp (1,5) số trường hợp có mức độ thay đổi gia đình lớn với tương xuất thể không bị u thể bị u mắt gia đình Mức độ thay đổi tỷ số DER chủ yếu trì khung và/ hay giữ phần có chức Trường hợp đột biến nối đoạn IVS06 + 1G > T đáng ý, loại đột biến thường gây loại exon khỏi pha khơng có protein, thơng tin bị loại bỏ vùng vô nghĩa (non sense mediated decay-NMD) Loại đột biến kèm theo mức độ thay đổi đáng ý độ thâm nhập gia đình hay gia đình Cơ chế giải thích cho tượng trì khả mã thơng tin bị mất, hiệu ứng người thân (parental effect) hay alen hoang dại (wild type allen) làm cho mức độ biểu RB1 bình thường 16 Bất thường vùng khởi phát (promoter) kinh điển thường kèm theo thay đổi mức độ biểu thông tin dẫn đến tỷ số DER thay đổi thường thấp Đột biến vô nghĩa (missense mutation) gặp Khi không biến đổi tượng nối đoạn (splicing) (xem trên), sinh protein phần chức (R661W) gây tỷ số DER thấp khả bị mắt loại trừ Hiện tượng tái xếp NST (mất hay nhân đoạn hay nhiều exon hay chí tồn gen) kèm theo tỷ số DER thay đổi (trung bình 1,4), tồn RB1 kiểu hình thay đổi từ khơng có tổn thương đến UNBVM mắt (Albretch 2005) Loại đột biến ảnh hưởng đến loại tổn thương, yếu tố thay đổi ảnh hưởng đến nối đoạn, mức độ biểu và/hay khả sống tế bào có vai trò sinh bệnh Chẳng hạn, nghi ngờ có yếu tố gây biến đổi di truyền UNBVM tìm chúng theo đường protein RB hay p53 mà yếu tố MDM2 chủ đạo điều hoà chuyển hoá p53 pRB Gần nhiều tác giả thấy alen MDM2 bao gồm biến đổi trật tự 309T>G (SNP rs2279744) gen khởi động có liên quan đến tỷ lệ UNBVM mắt hay mắt gia đình có người bị UNBVM Khi tư vấn di truyền, khả chẩn đoán trước sinh hay trước cho thụ thai ống nghiệm đề với cặp vợ chồng có 50% nguy truyền đột biến gen RB1 Tình tế nhị gia đình có nguy dị hợp gia đình, àm cho tư vấn di truyền khó khăn Mặc dù khơng thể trấn an với bố/ mẹ vốn khơng có tiền sử UNBVM, mang đột biến RB1 nguy bị u em, khó khuyên đối tượng kỹ thuật để sinh đứa khơng bị đột biến Vì điều quan trọng phải tiếp tục theo dõi gia đình để cải thiện tư vấn UNBVM 17 Các phương pháp xét nghiệm di truyền Bệnh học phân tử RB1 khác mô tả 500 loại đột biến tế bào gốc Các đột biến xảy khắp vùng mã hoá (coding sequencing) vùng khởi động loại trừ exon cuối (H 7) Đa số đột biến xuất hồn tồn Hình Một số hình thái đột biến đoạn Phổ đột biến tế bào gốc chủ yếu bao gồm đột biến vô nghĩa (khoảng 40%), chèn đoạn (frameshift insertion) hay nhiều ba zơ (khoảng 25%), nối đoạn (splicing) bị biến đổi (khoảng 20% tái xếp lại NST cụ thể mất/ nhân hay nhiều exon hay chí tồn gen (khoảng 10%) Các đột biến lại tương ứng với đột biến vơ nghĩa gặp đột biến vùng khởi động Vấn đề biến đổi tỷ lệ tương đối đột biến cho khác biệt số lượng thể nghiên cứu, yếu tố mơi trường có lien quan đến đột biến xuất hoàn toàn Cuối cùng, bất hoạt RB1 trường hợp ngoại lệ có tái xếp cấu trúc NST (chuyển vị, đảo vị) (translocation, inversion) Cùng loại biến đổi thấy khối u tượng methyl hoá mức vùng khởi động NST 18 rộng bao gồm tất vùng RB1 bên(flanking) Nếu có xuất khối u tìm tồn tượng liên quan đến u 2.1 Nguồn Phân tích trường hợp rõ bệnh (index case) cần nhiều nguồn, khác với phân tích người thân quen, vốn tìm đột biến xác định trước cần nguồn 2.2 Nghiên cứu trường hợp rõ bệnh Xét nghiệm đột biến gen RB1 tế bào gốc kinh điển thực DNA chiết xuất từ máu lưu trữ với EDTA Cần có 2-3 micro gram DNA để sàng lọc đột biến điểm đột biến rộng tồn gen Có thể chiết suất với hệ thống thiết bị bán sẵn hay với phenol/chloroform hay perchlorate/chloroform hay kỹ thuật tách muối (salt out) Khi sử dụng DNA để xét nghiệm, cần có RNA thường có biến đổi nối đoạn Phân tích RNA cần thiết để xác định tầm nảh hưởng đột biến giả định xác định DNA RNA lấy từ máu trữ heparin, acid citrte dextrose (ACD) hay EDTA Nuôi cấy tế bào limpho non cách tốt nguồn axit nhân vơ tận lại đắt tiền cần có nơi ni cấy tế bào Sau cùng, phân tích DNA khối u quan trọng với chẩn đoán sinh học phân tử bệnh UNBVM Không dùng bệnh phẩm cố định với Bouin DNA bị phân huỷ nên dùng bệnh phẩm đông lạnh cố định nến Khi phân tích khối u phải cần đủ bệnh phẩm (2-3 microgram) Lượng bệnh phẩm nhỏ đủ để xác định đột biến biết trước Cũng chiết xuất DNA với trang bị bán sẵn hay phenol/chloroform 2.3 Nghiên cứu thành viên gia đình Trong trường hợp này, xét nghiệm gen nhằm tìm đột biến xác định trước lượng DNA vừa đủ (khoảng 50 ng) chiết xuất 19 từ tế bào niêm mạc miệng (dùng tăm để quệt) kỹ thuật FTA Sauk hi quệt tăm bơng lăn tăm bơng lên FTA, tế bào làm vỡ, chiết xuất cố định DNA hỗn dịch FTA Cũng dùng dung dịch bán sẵn để chiết tế bào 2.4 Các phương pháp Có hai loại xét nghiệm di truyền học phân tử để chẩn đoán là: Xét nghiệm trực tiếp xét nghiệm gián tiếp 2.4.1 Xét nghiệm trực tiếp Xét nghiệm trực tiếp tìm biến gen RB1 tế bào gốc vốn yếu tố nguy di truyền gây UNBVM Nghiên cứu thực gia đình thời gian thường phải nhiều tháng Ngược lại, xét nghiệm để phát đột biến xác định gia đình, sàng lọc có chủ đích đột biến xác định trước cần vài ngày Xét nghiệm trực tiếp làm với máu Cần kiểm tra đột biến có hay mẫu lấy khác nhau: mẫu máu lấy vào thời điểm khác hay mẫu máu mẫu tế bào niêm mạc miệng Cũng làm xét nghiệm trực tiếp tế bào khối u Cách sàng lọc có tác dụng với trường hợp bị mắt mà khơng tìm thấy đột biến xét nghiệm máu bị bệnh mắt xác định đột biến khối u có ý ngĩa tư vấn di truyền, loại trừ nguy bệnh tái xuất anh chị em ruột hay bà thân thích (chứ khơng phải sau) Xét nghiệm DNA khối u làm mắt bị bệnh khoét bỏ Mức độ phức tạp phổ đột biến gen RB1 đòi hỏi phân tích tồn vùng mã hố (coding sequence) vùng khởi động nhiều kỹ thuật bổ xung (xem phân tích methyl hố DNA) 2.4.2 Phát đột biến điểm Đột biến điểm thường phát nhiều kỹ thuật khác … 20 Bất kể sử dụng kỹ thuật nào, gen cắt thành nhiều amplicon tương ứng với mã exon điểm nối intron/exon nhằm phát bất thường nối đoạn (splicing consensus sequences) gây ảnh hưởng đến chức DHPLC (denaturing high performace liquid chromatography) áp dụng để phát đột biến điểm Dựa theo nguyên tắc phân tách lý học điều kiện gây biến chất, nhiều đoạn DNA pha di chuyển khác biệt trì pha cứng cột DNA DHPLC có độ nhạy cao giúp nghiên cứu u, hay tượng khảm vốn hay xảy DHPLC có khả phát