15.10 THỬ NGHIỆM NHẬN DẠNG HUYẾT THANH MIỄN DỊCH Mục đích thử nghiệm nhận dạng huyết miễn dịch nhằm khẳng định huyết thử nghiệm chứa protein từ lồi động vật đăng kí sản xuất Có thể tiến hành theo kỹ thuật sau: Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch (Ouchterlony) Nguyên lý Kỹ thuật dựa nguyên lý khuếch tán kép tự kháng nguyên kháng thể từ giếng riêng biệt tạo gel agarose 1% vào môi trường tạo thành cung tủa phản ứng đặc hiệu chúng Vật liệu thiết bị Phiến kính Agarose 1% đệm phosphat pH 7,4 Hộp ẩm Huyết miễn dịch thử nghiệm Huyết kháng loài Dung dịch nhuộm: Coomasie blue 0,025% Dung dịch tẩy màu: Methanol: Acetic acid: Nước cất (4:1:5) Tiến hành Đổ gel agarose 1% lên phiến kính Dùng dụng cụ đục giếng loại có đường kính mm tạo giếng phiến kính (1 giếng giữa, giếng cách xung quanh) Nhỏ huyết kháng loài vào giếng xung quanh huyết thử nghiệm vào giếng Đặt phiến kính vào hộp ẩm từ 12 - 48 Nhuộm gel với dung dịch nhuộm coomasie blue 0,025% Tẩy màu dung dịch tẩy màu, sau rửa nước cất Để khơ phiến kính nhiệt độ phòng Kỹ thuật điện di miễn dịch Nguyên lý Dưới tác động điện trường môi trường gel agarose, kháng nguyên tích điện âm từ giếng phía cực âm kháng thể tích điện dương từ giếng phía cực dương di chuyển ngược chiều nhau, gặp hình thành đường tủa nhìn thấy Vật liệu thiết bị Phiến kính Thạch 3% nước cất Agarose 1,5% đệm barbital pH 8,4 Huyết miễn dịch thử nghiệm Huyết kháng loài Máy điện di, nguồn điện Dung dịch nhuộm, rửa, tẩy màu Tiến hành Đổ thạch 3% lên phiến kính Đổ agarose 1,5% lên thạch Sau agarose đơng, đục giếng có đường kính mm, khoảng cách giếng 4-5 mm Nhỏ huyết thử nghiệm huyết kháng loài vào giếng Đặt phiến kính vào máy điện di Tiến hành điện di 10 V/cm từ 10 đến 60 phút tuỳ thử nghiệm Ngừng điện di, quan sát kết Để dễ quan sát đường tủa, cần loại protein khơng tủa cách ngâm phiến kính đệm PBS Phủ giấy lọc Whatman lên phiến kính sấy 37 oC đến khô Nhuộm xanh với Coomasie blue 20 phút Tẩy màu, rửa với nước cất, để khô Nhận định kết Huyết miễn dịch thử nghiệm nhận dạng xuất đường tủa mẫu thử nghiệm huyết kháng loài tương ứng