ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP-VT2eB TRÊN HEO (Nội dung)

Độc tố verotoxin VT2e do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây bệnh phù trên heo sau cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo ở nƣớc ta.

i    ***000***   PROTEIN MBP- :  : 2001-2005  Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 ii B     PROTEIN MBP-    TR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii  Con t . Ch  -   ch  -             - TS.    -   -  anh         -    -   - B  CNSH27 ch   8   iv TÓM TẮT TRƢƠNG THỊ THẢO UYÊN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP- VT2eB TRÊN HEO” Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Hải Sử dụng kháng nguyên là protein tái tổ hợp MBP-VT2eB pha trong keo phèn với liều 50µg/heo và 75µg/heo có lập lại và không lập lại gây đáp ứng miễn dịch trên heo. Thí nghiệm đƣợc bố trí ngẫu nhiên trên 25 cá thể với 5 lô thí nghiệm. Sau đó thu kháng huyết thanh để định hiệu giá kháng thể theo 2 phƣơng pháp: trung hòa độc tố trên tế bào vero và khuyếch tán kết tủa trên thạch. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ở liều 50µg và 75µg/heo pha trong keo phèn là loại kháng nguyên an toàn với heo. - Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch. - Hoàn thiện qui trình định hiệu giá kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero: huyết thanh phải bất hoạt trƣớc khi thử nghiệm và không bổ sung sodium azid vào trong huyết thanh. - Liều tiêm 50µg và 75µg/heo có lập lại và không lập lại không tạo đủ lƣợng kháng thể để phát hiện bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch và trung hòa độc tố trên tế bào vero. v  Tiêu đề Trang Trang bìa i Trang tựa . ii Lời cảm ơn . iii Tóm tắt . iv Mục lục . v Danh sách các bảng . viii Danh sách các hình ix 1.  1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ . 1 1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1 2. 2 2.1 VACXIN . 2 2.1.1 Lịch sử ra đời vacxin 2 2.1.2 Đáp ứng miễn dịch 2 2.1.2.1Kháng nguyên . 2 2.1.2.2 Kháng thể . 3 2.1.2.3 Cơ chế đáp ứng miễn dịch 4 2.1.2.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến đáp ứng miễn dịch . 7 2.1.3 Phân loại . 9 2.1.3.1 Vacxin sống 9 2.1.2.2 Vacxin vô hoạt . 10 2.1.2.3 Vacxin phân tử . 10 2.2 BỆNH PHÙ VÀ ĐỘC TỐ VT2e 12 2.2 PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB 14 2.3 PHƢƠNG PHÁP OUCHTERLONY 14 2.3.1 Nguyên tắc 14 2.3.2 Định tính kháng nguyên- kháng thể bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch 16 vi 2.4 PHẢN ỨNG TRUNG HÕA ĐỘC TỐ VEROTOXIN TRÊN TẾ BÀO VERO 16 2.4.1 Sơ lƣợc về tế bào Vero 16 2.4.2 Nguyên tắc phản ứng trung hòa độc tố 17 2.4.3 Đánh giá hiệu quả vacxin bệnh phù bằng phƣơng pháp trung hoà độc tố verotoxin trên môi trƣờng nuôi cấy tế bào vero 17 3.  18 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 18 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU . 18 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 18 3.3.1 Sinh vật thí nghiệm 18 3.3.2 Hóa chất thí nghiệm . 18 3.3.3 Dụng cụ thí nghiệm 19 3.4 PHƢƠNG PHÁP 20 3.4.1 Bố trí thí nghiệm 20 3.4.2 Cách pha dịch tiêm . 20 3.4.3 Lấy máu 20 3.4.4 Định tính kháng thể bằng phƣơng pháp Ouchterlony 21 3.4.5 Xác định liều TCID 50 . 22 3.4.5.1Chuẩn bị dịch độc tố . 22 3.4.5.2Chuẩn bị tế bào vero . 22 3.4.5.3Xác định liều TCID 50 23 3.4.6 Thực hiện phản ứng trung hòa độc tố 25 3.5 Các chỉ tiêu theo dõi . 26 4. 27 4.1 CÁC TRIỆU CHỨNG CỦA HEO SAU KHI TIÊM VACXIN . 27 4.2 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH THEO PHƢƠNG PHÁP KẾT TỦA KHUYẾCH TÁN TRÊN THẠCH . 27 4.2.1 Với kháng nguyên là độc tố của E. coli H28 . 27 4.2.2 Với kháng nguyên MBP-VT2eB 28 4.3 LIỀU TCID50 CỦA DỊCH LỌC VI KHUẨN . 27 4.4 HIỆU GIÁ KHÁNG HUYẾT THANH TRÊN MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY vii TẾ BÀO . 30 4.4.1 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid chƣa bất hoạt 30 4.4.2 Đối với mẫu huyết thanh có sodium azid và có bất hoạt . 31 4.4.3 Thí nghiệm chứng minh sodium azid gây chết tế bào vero 33 4.4.3.1 Mẫu huyết thanh có sodium azid . 33 4.4.3.1 Đối với mẫu không có sodium azid . 33 4.4.4 Đối với mẫu huyết thanh không có sodium azid và có bất hoạt 33 5. . 36 5.1 KẾT LUẬN . 36 5.2 ĐỀ NGHỊ 36 6. . 38  . 39 Thành phần hóa chất . 39 Bảng phân tích biến lƣợng tăng trọng heo thí nghiệm . 41 Bảng 3. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid, có bất hoạt 42 Bảng 4. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodium azid, có bất hoạt 43 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 1. Tăng trọng của heo thí nghiệm trong thời gian thí nghiệm 25 Bảng 2. Kết quả đo OD trên đĩa nuôi cấy tế bào với dịch lọc vi khuẩn . 27 Bảng 3. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu có sodium azid 42 Bảng 4. Kết quả đo OD620nm đối với mẫu không có sodium azid 43 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Biểu đồ 4.1 Đồ thị chuẩn độ độc tố 28 Hình 2.1. Cấu trúc kháng thể 3 Hình 2.2. Liên kết kháng nguyên- kháng thể . 15 Hình 4.1 Kết quả dƣơng tính với huyết thanh thỏ 26 Hình 4.2 Kết quả âm tính trên huyết thanh heo 26 Hình 4.3 Hình tế bào vero chết do sodium azid . 33 Hình 4.4 Hình tế bào vero chết do độc tố . 33 Hình 4.5 Giếng đối chứng độc tố đã nhuộm 33 Hình 4.6 Giếng đối chứng tế bào đã nhuộm . 33 1 1   1.1  Độc tố verotoxin VT2e do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây bệnh phù trên heo sau cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi heo ở nƣớc ta. Việc sử dụng kháng sinh để điều trị phù ở heo tuy có hiệu quả nhƣng gây ra nhiều triệu chứng phụ nhƣ rối loạn tiêu hoá, tạo ra các chủng vi sinh vật kháng kháng sinh gây khó khăn cho những lần trị bệnh về sau. Do đó sử dụng vacxin để phòng bệnh phù do E. coli trên heo đƣợc xem là liệu pháp thích hợp nhất. Một số tác giả đã thử nghiệm vacxin nhƣợc độc, hoặc vacxin chết .bƣớc đầu ghi nhận hiệu quả bảo vệ nhất định. Tuy vậy, các phản ứng phụ vẫn là những trở ngại lớn cho việc áp dụng rộng rãi những loại vacxin này. Vacxin tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách loại bỏ yếu tố gây bệnh của vi sinh vật mà vẫn giữ đƣợc đặc tính kháng nguyên của chúng đang đƣợc các nhà khoa học quan tâm nhằm khắc phục những nhƣợc điểm nói trên. Hiện nay, TS. Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra đƣợc E. coli mang gen mã hoá cho tiểu phần B của độc tố VT2e và tinh sạch đƣợc protein này. Từ thực tế đó, đƣợc sự chấp nhận của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, với sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “ -”. 1.2  - Mục tiêu Đánh giá khả năng ứng dụng protein tái tổ hợp MPB-VT2e trong sản xuất vacxin phòng bệnh phù do E. coli trên heo. - Yêu cầu  Xây đựng thí nghiệm kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch của MBP-VT2eB trên heo.  Định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch.  Xác định liều TCID 50 (Tissue Culture Infectious Dose) trên tế bào vero  Kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng MBP-VT2eB bằng phƣơng pháp trung hòa độc tố trên tế bào vero. [...]... trƣng trên tế bào đích Do đó khi tiêm protein MBP-VT2eB trên heo thì heo sẽ tạo ra kháng thể chống lại tiểu phần B của độc tố VT2e Do đó, độc tố này không có khả năng liên kết với các thụ thể đặc hiệu trên tế bào gốc nên mất khả năng gây bệnh Dựa trên phản ứng trung hòa độc tố verotoxin trên tế bào vero, có thể xác định hiệu giá kháng huyết thanh Nhờ đó đánh giá đƣợc khả năng gây đáp ứng miễn dịch của protein. .. xuất ra loại protein của gen kháng nguyên làm vacxin Protein này còn đƣợc gọi là protein tái tổ hợp dùng sản xuất vacxin tái tổ hợp [3] 2.1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch [4] Bản thân túc chủ Những loài khác nhau thì khả năng đáp ứng miễn dịch khác nhau Ở những cá thể khác nhau thì tính sinh miễn dịch cũng khác nhau, do:  Di truyền: ngƣời ta có thể tăng khả năng đáp ứng miễn dịch bằng... gây miễn dịch trên hai qui trình khác nhau thì khả năng gây đáp ứng miễn dịch khác nhau Mỗi một loại kháng nguyên thích hợp với một qui trình gây miễn dịch riêng Đối với những kháng nguyên yếu thì phải tuân theo một qui trình miễn dịch nghiêm ngặt và phải chủng nhiều lần mới có hiệu quả Trong khi đó những kháng nguyên mạnh thì chỉ cần chủng một lần Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên  Các nhà miễn dịch. .. có khả năng đáp ứng miễn dịch cao Tùy cơ địa của từng cá thể mà có thể có hiện tƣợng dị ứng khi gây miễn dịch  Tuổi: thú quá nhỏ thì khả năng đáp ứng miễn dịch không cao do hệ thống cơ quan miễn dịch của thú chƣa phát triển hoàn chỉnh Hơn nữa những thú nhỏ đều có kháng thể do mẹ truyền nên những kháng thể này có thể trung hòa kháng nguyên đƣa vào  Tình trạng sức khỏe: những thú khỏe mạnh khả năng đáp. .. đáp ứng miễn dịch cao hơn những thú bị bệnh hay sức khỏe yếu Do đó chỉ gây miễn dịch với những thú có sức khỏe tốt , không mắc các bệnh truyền nhiễm khác  Chế độ dinh dƣỡng: những thú đƣợc nuôi dƣỡng tốt sẽ đáp ứng miễn dịch tốt hơn những thú không đƣợc chăm sóc tốt Kháng nguyên  Tính lạ kháng nguyên Đáp ứng miễn dịch xảy ra khi có sự khác biệt chủng loài giữa kháng nguyên và túc chủ Khả năng đáp ứng. .. MBP-VT2e trên heo con theo mẹ và đánh giá độ an - toàn của dịch tiêm - Khảo sát liều TCID50 của độc tố VT2e trên tế bào vero - Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng MBP- VT2e theo phƣơng pháp khuyếch tán trên thạch Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng MBP-VT2e bằng phƣơng pháp trung hòa độc tố - trên tế bào vero 3.3 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 3.3.1 Vật liệu và thú thí nghiệm - Heo con theo mẹ: 25 con - Máu heo thí... thanh thu đƣợc theo phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch nhằm đánh giá sơ bộ hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch của protein tái tổ hợp 4.3.1 Với kháng nguyên là độc tố của E coli H28 Thực hiện định tính kháng huyết thanh bằng phƣơng pháp kết tủa khuyếch tán trên thạch với kháng nguyên là độc tố của E.coli H28 đều cho kết quả âm tính với cả mẫu huyết thanh heo và đối chứng dƣơng Đối chứng dƣơng là huyết... đƣợc tổng hợp từ axit amin dạng D thì khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao vì ít bị biến đổi Các kháng nguyên có bản chất là lipit, steroid, axit nucleic khả năng kích ứng miễn dịch thấp hay không có trừ khi chúng đƣợc gắn với protein tải  Kích thƣớc của phân tử kháng nguyên Kháng nguyên có kích thƣớc càng lớn và cấu trúc càng phức tạp thì khả năng kích ức miễn dịch càng cao vì một phân tử kháng nguyên... dàng gây đáp ứng miễn dịch: nhƣ vi khuẩn, virus, tế bào Những kháng nguyên hòa tan thì phải có quy trình gây miễn dịch thích hợp tốt nhất là đƣờng tiêm trong da, dƣới da  Liều lƣợng kháng nguyên: nếu lƣợng kháng nguyên quá thấp thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch Ngƣợc lại nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch  Quy trình gây miễn dịch có ảnh hƣởng lớn tới tính sinh miễn dịch của... Đây là yếu tố đảm bảo tính sinh miễn dịch Hơn nữa kháng nguyên có cấu trúc phân tử càng lớn thì càng dễ bị đại thực bào phát hiện và xử lý nên nó khả năng kích ứng miễn dịch cao Những kháng nguyên có cấu trúc phân tử nhỏ dễ bị đại thực bào bỏ qua nên khả năng kích ứng miễn dịch thấp Cách gây miễn dịch và liều lƣợng kháng nguyên  Đƣờng đƣa kháng nguyên vào cơ thể vật chủ: Với những kháng nguyên mạnh, . 8/2005. “ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN MBP- VT2eB TRÊN HEO Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Ngọc Hải Sử dụng kháng nguyên là protein. miễn dịch cũng khác nhau, do:  Di truyền: ngƣời ta có thể tăng khả năng đáp ứng miễn dịch bằng cách tuyển chọn những nhóm giống có khả năng đáp ứng miễn