Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(2): 231-239, 2015 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC LÊN SỰ NHÂN CHỒI, SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY HOA HỒNG (ROSA SP.) IN VITRO Dương Tấn Nhựt1, Nguyễn Xuân Tuấn1, Nguyễn Thị Thùy Anh1, Hồ Viết Long1, Hoàng Thanh Tùng1, Nguyễn Bá Nam1, Nguyễn Phúc Huy1, Vũ Quốc Luận1, Vũ Thị Hiền1, Lê Thị Thu Hiền2, Nguyễn Hồi Châu3, Ngơ Quốc Bưu3 Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Công nghệ Môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngày nhận bài: 19.5.2015 Ngày nhận đăng: 30.6.2015 TÓM TẮT Hoa hồng loại hoa trồng phổ biến giới, ưa thích đa dạng màu sắc chủng loại Tuy nhiên, việc vi nhân giống loài hoa lại gặp nhiều khó khăn vàng cụm chồi, rụng rễ hóa đen in vitro Gần đây, nano bạc sử dụng nuôi cấy mô thực vật, nhằm tăng cường khả sinh trưởng, phát triển trồng với ưu điểm tăng tiếp xúc, bám dính lên bề mặt tế bào, dẫn tới hiệu tác động cao Trong nghiên cứu này, nồng độ nano bạc khác (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l) sử dụng để khảo sát hiệu nhân nhanh chồi, sinh trưởng phát triển hoa hồng Kết sau 30 ngày nuôi cấy, sinh trưởng phát triển chồi môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar, 2,5 mg/l BA mg/l nano bạc cho hiệu tốt việc nhân nhanh chồi (tăng số chồi hình thành gấp 4,09 lần so với đối chứng khơng sử dụng nano bạc) Mơi trường MS có bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar, 0,5 mg/l IBA mg/l nano bạc tối ưu cho trình rễ, sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro so với đối chứng với tiêu chiều cao cây, số lá/cây, chiều dài lá, chiều rộng lá, khối lượng tươi, khối lượng khô, chlorophyll a b cao vượt trội (2,93 cm; lá; 1,9 cm; 1,6 cm; 517, 67 mg; 52 mg; 6,80 µg/g; 3,49 µg/g; tương ứng) Đồng thời, chồi sinh trưởng khỏe mạnh, khơng quan sát thấy tượng vàng lá, rụng so với đối chứng trường hợp Cây có chiều cao đồng đều, xanh, hệ rễ dày phát triển khỏe mạnh so với đối chứng Từ khóa: Hoa hồng, nano bạc, nhân chồi, sinh trưởng phát triển, vi nhân giống ĐẶT VẤN ĐỀ Hoa hồng loài hoa trồng phổ biến nhiều quốc gia giới có nước ta khả phân bố rộng từ miền ôn đới đến nhiệt đới, đa dạng chủng loại màu sắc Sản lượng hoa hồng hàng năm chiếm tỉ trọng cao nhất, chiếm 35% tổng sản lượng hoa cắt cành toàn giới Dự kiến nhu cầu hoa hồng cắt cành tăng mạnh năm (Nguyễn Xuân Linh, 2000) Với khả tăng trưởng nhanh mặt thương mại, nhu cầu giống hoa hồng chất lượng cao (đồng đều, bệnh) với số lượng lớn ngày trở nên cần thiết Kể từ đời, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đóng vai trò quan trọng việc nhân giống Đây phương pháp làm tăng nhanh số lượng chất lượng trồng, cung cấp nguồn bệnh với số lượng giống lớn thời gian ngắn sản xuất quanh năm (Dhawan, Bhojwani, 1986) Kỹ thuật ứng dụng cho nhiều loại khác cúc, cẩm chướng,… có hoa hồng Tuy nhiên, việc vi nhân giống in vitro hoa hồng thường gặp nhiều vấn đề vàng cụm chồi, rụng rễ hóa đen in vitro, sinh trưởng phát triển kém; kết chất lượng giống khả sống sót ngồi vườn ươm giảm Sự đời vật liệu nano khắc phục vài bất lợi kể trên số loài thực vật Vật liệu nano gồm nhiều loại khác như: nano bạc, nano vàng, nano sắt, nano kẽm, … với kích thước hạt nhỏ (1-100 nm) nên hạt nano có diện tích bề mặt lớn làm tăng khả tiếp xúc với không gian bên ngồi Do đó, bám dính lên bề mặt tế bào gia tăng dẫn đến hiệu tác động cao (Shah, Belozerova, 2008) Hiệu dung dịch nano báo cáo phụ thuộc vào kết 231 Dương Tấn Nhựt et al hợp hóa học, kích cỡ, bề mặt bao phủ, tương tác hóa học (Khodakovskaya et al., 2012), nồng độ loài thực vật sử dụng (Ma et al., 2010) Hiệu tác động nano bạc báo cáo nhiều đối tượng vi sinh vật tế bào động vật Tuy nhiên đối tượng thực vật in vitro nhiều hạn chế (Monica, Cremonini, 2009) Nano bạc có ảnh hưởng lên nảy mầm hạt Bacopa monnieri, cảm ứng tổng hợp protein carbohydrate, giảm lượng phenol tổng hoạt động enzyme peroxidase (Krishnaraj et al., 2012) Hiệu nano bạc việc tăng cường khả sinh trưởng, phát triển giải số bất lợi không mong muốn số loại thực vật in vitro báo cáo Nano bạc làm tăng cường tiêu sinh trưởng thuộc tính hóa học lồi Brassica juncea, đậu ngô (Sharma et al., 2012); giúp cảm ứng hình thành rễ khóa tín hiệu ethylene Crocus sativus (Rezvani et al., 2012) Trong nghiên cứu này, nano bạc sử dụng nhằm đánh giá hiệu loại nano lên trình nhân nhanh chồi, rễ, sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Nguồn mẫu sử dụng thí nghiệm chồi hoa hồng cam (Rosa sp.) in vitro tháng tuổi, cao khoảng cm, cấy chuyền nhiều lần mơi trường, có sẵn phòng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng, Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Môi trường thí nghiệm Mơi trường MS (Murashige, Skoog, 1962) bổ sung 30 g/l sucrose, g/l agar Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường với loại nồng độ khác tùy vào mục đích thí nghiệm trước điều chỉnh pH 5,8 Môi trường hấp khử trùng 121°C, atm 20 phút Dung dịch nano bạc Viện Công nghệ Môi trường cung cấp với hạt nano bạc có kích thước trung bình ≤ 20 nm thiết lập theo tỷ lệ: [AgNO3] = 750-1000 ppm, [β-chitozan] = 250300 ppm, [NaBH4] = 200 ppm, tỷ lệ mol [NaBH4]/[AgNO3] = ¼ với tốc độ nhỏ giọt NaBH4 10-12 giọt/phút (Chau et al., 2008) 232 Phương pháp Xác định hàm lượng chlorophyll Hàm lượng chlorophyll a b đánh giá phương pháp phân tích quang phổ hấp phụ dịch chiết dung dịch acetone máy đo quang phổ UV-2900 Hitachi, Nhật Bản) Độ hấp phụ (OD) đo bước sóng 662 645 nm (Lichtentaler, Wellburn, 1985) Bố trí thí nghiệm Ảnh hưởng BA lên khả nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro Các chồi hoa hồng (0,5 cm) cấy vào bình thủy tinh (thể tích 250 ml) có chứa 40 ml mơi trường khống MS bổ sung g/l agar, 30 g/l sucrose BA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; mg/l) nhằm tìm mơi trường thích hợp cho khả nhân nhanh chồi Sau 30 ngày nuôi cấy ghi nhận tiêu: Số chồi, chiều cao chồi (cm), số đốt, khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg) Ảnh hưởng nồng độ nano bạc lên khả nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro Các cụm chồi hoa hồng (0,5 x 0,5 cm) cấy vào mơi trường thích hợp cho q trình nhân nhanh chồi thí nghiệm có bổ sung nồng độ nano bạc khác (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l) Sau 30 ngày nuôi cấy ghi nhận tiêu: Số chồi, chiều cao chồi (cm), số đốt, khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg) Ảnh hưởng IBA lên khả rễ, sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro Các chồi hoa hồng khoảng cm được cấy vào vào môi trường MS bổ sung g/l agar, 30 g sucrose nồng độ khác IBA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; mg/l) nhằm tìm mơi trường thích hợp cho trình rễ, sinh trưởng phát triển chồi hoa hồng in vitro Sau 30 ngày nuôi cấy ghi nhận tiêu: Chiều cao (cm), số lá, số rễ, chiều dài rễ (cm), khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg) Ảnh hưởng nồng độ nano bạc lên khả sinh trưởng, phát triển hoa hồng in vitro Các chồi hoa hồng khoảng cm được cấy vào vào môi trường tốt cho khả rễ, sinh trưởng phát triển chồi hoa hồng in vitro bổ sung thêm nồng độ khác nano bạc (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l) Sau 30 ngày nuôi cấy ghi nhận tiêu: Chiều cao (cm), số lá, số rễ, Tạp chí Công nghệ Sinh học 13(2): 231-239, 2015 chiều dài rễ (cm), khối lượng tươi (mg), khối lượng khô (mg) Điều kiện thí nghiệm Mẫu ni cấy đèn huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 40-45 µmol.m-2.s-1, nhiệt độ 25 ± 2°C, độ ẩm trung bình khoảng 55-60% Bố trí thí nghiệm xử lý số liệu Mỗi thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên yếu tố Các số liệu xử lý phần mềm SPSS 22.0 theo Ducan’s test (Duncan, 1955) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng BA lên khả nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro Sau 30 ngày nuôi cấy, tất nghiệm thức bổ sung BA, tiêu số chồi cao so với đối chứng Nồng độ BA mg/l cho hiệu tái sinh nhiều chồi (8,66 chồi/mẫu); nhiên, nghiệm thức chồi nhỏ, mảnh, thấp so với nghiệm thức lại, khối lượng tươi (826 mg) khối lượng khô (83 mg) cụm chồi thấp (Bảng 1, Hình 1) Trong đó, nồng độ 2,5 mg/l BA số chồi khơng khác biệt có ý nghĩa so với nồng độ mg/l BA Ở nồng độ này, số chồi/mẫu (8,00 chồi) không nhiều chồi có kích thước lớn chồi nồng độ mg/l BA (nồng độ có số chồi đạt cao nhất), cao đồng (1,00 cm), nhiều xanh (5 lá/chồi), khỏe mạnh; đặc biệt khối lượng tươi cụm chồi (1279,33 mg), khối lượng khô cụm chồi (135,33 mg) thu đạt cao (Bảng 1) Trong quy trình nhân nhanh chồi lồi thực vật nuôi cấy mô, BA cytokinin sử dụng nhiều Nồng độ phù hợp cho đáp ứng nhân chồi tốt báo cáo từ 0,1-3,0 mg/l BA (Posada et al., 1999) Như vậy, từ kết thí nghiệm kết luận rằng, nồng độ BA tối ưu cho nhân chồi hoa hồng môi trường MS bổ sung g/l agar 30 g/l sucrose 2,5 mg/l Bảng Ảnh hưởng BA lên khả nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro BA (mg/l) Số chồi Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) 1,00d* 1,00c 3,00d 170,00e 16,67e 0,5 1,67d 1,08c 4,67c 325,67d 32,00de 1,0 3,33c 1,25bc 6,00a 411,00d 41,67d 1,5 3,33c 1,67a 5,67ab 901,00c 92,67c 2,0 5,33b 1,50ab 5,33ab 1144,33b 113,67b 2,5 8,00a 1,00c 5,00bc 1297,33a 135,33a 3,0 8,66a 0,58d 3,33d 826,00c 83,00c Ghi chú: * Các kí tự khác (a,b,c…) cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 theo Duncan’s test Hình Chồi hoa hồng sau 30 ngày nuôi cấy mơi trường có bổ sung BA (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 mg/l từ trái sang phải) 233 Dương Tấn Nhựt et al Ảnh hưởng nồng độ nano bạc lên khả nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro Sau 30 ngày nuôi cấy mơi trường tối ưu thí nghiệm có bổ sung nano bạc nồng độ khác (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l), kết cho thấy có khác rõ rệt tiêu sinh trưởng chồi nghiệm thức (Bảng 2) Ở nghiệm thức bổ sung nano bạc cho số chồi tạo cao đối chứng Đồng thời, chồi tạo thành môi trường cao đồng nhau, nhiều, to, màu xanh đậm, tượng vàng xuất so với đối chứng (Hình 2) Trong nghiệm thức có bổ sung nồng độ nano bạc 1, mg/l, sinh trưởng cụm chồi hoa hồng tăng đáng kể so với đối chứng Trong đó, số chồi (17,67; 17,33 18,67; tương ứng) gấp 2,65; 2,58; 2,80 lần so với đối chứng Đặc biệt, nghiệm thức bổ sung mg/l nano bạc, số chồi (27,33 chồi), chiều cao chồi (1,87 cm/chồi), số (8,33 lá/chồi), khối lượng tươi (9240 mg/cụm chồi), khối lượng khô (907 mg/cụm chồi) cao vượt trội so với đối chứng nghiệm thức bổ sung nano bạc với nồng độ khác (Bảng 2) Tại nồng độ này, số chồi hình thành cao gấp lần so với đối chứng Các chồi khỏe mạnh nguồn mẫu chất lượng, dùng cho thí nghiệm Tuy nhiên, môi trường tăng nồng độ nano bạc lên 11 mg/l tiêu giảm dần (Bảng 2) Như vậy, bổ sung nano bạc vào môi trường nhân chồi hoa hồng thúc đẩy hình thành chồi từ cụm chồi hoa hồng so sánh với đối chứng nồng độ tối ưu mg/l Vượt nồng độ này, số lượng chồi tạo giảm, chồi sinh trưởng điều kiện in vitro Nano bạc cho thấy tính kháng khuẩn cao (Abdi et al., 2008), ảnh hưởng tới sinh sản hô hấp sinh vật (Lok et al., 2007), kéo dài khả tồn (An et al., 2008) tăng cường khả trao đổi chất thực vật (Giraldo et al., 2014) Mặc dù ảnh hưởng nano bạc báo cáo nhiều đối tượng vi sinh vật tế bào động vật; nhiên, có vài nghiên cứu hoàn thành đối tượng thực vật (Krishnaraj et al., 2012; Monica, Cremonini, 2009) Hiệu nano bạc nói chung dung dịch nano nói riêng phụ thuộc vào kết hợp hóa học, kích cỡ, bề mặt bao phủ, tương tác hóa học (Khodakovskaya et al., 2012), nồng độ loài thực vật sử dụng (Ma et al., 2010) Bảng Ảnh hưởng nồng độ nano bạc lên khả nhân nhanh chồi hoa hồng in vitro Nano bạc (mg/l) Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) 6,67e 1,43c 6,33c 4400d 441,67d 17,67c 1,67ab 6,67bc 8320b 828,33b 17,33c 1,67ab 7,67ab 8530b 847,67b 18,67c 1,83a 8,00a 8360b 839,00b 27,33a 1,87a 8,33a 9240a 907,00a 23,67b 1,50bc 6,33c 7380c 732,00c 11 9,33d 1,43c 6,67c 3980d 388,33d Ghi : * Các kí tự khác (a,b,c,…) cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 theo Duncan’s test Hình Chồi hoa hồng sau 30 ngày ni cấy mơi trường có bổ sung nano bạc (0; ; ; ; ; ; 11 mg/l từ trái sang phải) 234 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(2): 231-239, 2015 Trong nghiên cứu chúng tôi, nano bạc cho hiệu gia tăng lượng chồi hình thành, giảm già hóa Điều giải thích ion Ag+ dung dịch nano ức chế hoạt động enzyme tổng hợp ethylen (Macnish et al., 2004) Con đường diễn sau Ag+ thay ion Cu2+ (có vai trò quan trọng việc gắn ethylen lên tế bào thực vật) diện thụ thể protein, ngăn chặn nhận biết ethylene (Khan, 2006) Ethylen hormone gây tượng già hóa vàng rụng nhiều loại thực vật (Cameron, Reid, 2001; Celikel et al., 2002) khơng hình thành Nồng độ nano bạc cao (9 11 mg/l) làm cho chồi hoa hồng giảm sinh trưởng giải thích tế bào bị ngộ độc kim loại nặng (bạc) dẫn đến tượng trùng hợp phenol hoạt động enzyme peroxidase (Backor, 2009) Ảnh hưởng IBA lên khả rễ, sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro Sau 30 ngày ni cấy mơi trường rễ có bổ sung IBA với nồng độ khác nhau, kết cho thấy nồng độ 0,5 mg/l IBA cho khả rễ, sinh trưởng phát triển chồi hoa hồng tốt số nồng độ khảo sát so với đối chứng Chiều cao đạt 2,33 cm; số 7,17 lá/cây; rộng (1,07 cm) dài (1,53 cm); khối lượng tươi 433,67 mg; khối lượng khô 41,33 mg; in vitro có nhiều rễ chiều dài rễ cao nhất, đạt 8,33 rễ 0,87 cm; tương ứng (Bảng 3, Hình 3) Bảng Ảnh hưởng IBA lên khả rễ, sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro IBA (mg/l) Chiều cao (cm) Số lá/cây Số rễ Chiều rễ Chiều rộng (cm) Chiều dài (cm) Khối tươi (mg) 1,16c* 2,67b 2,00b 0,5 1,76a 5,00a 8,33a 0,27bc 0,73b 0,87ab 189,67c 21,67c 0,87a 0,97a 1,5a 333,67a 41,33a 1,56b 3,33b 1,5 1,36c 3,00b 7,00a 0,60ab 1,07a 1,33ab 250,33b 30,33b 1,33b 0,37abc 0,63b 1,2b 201,33c 24,33c dài lượng Khối khô (mg) lượng Ghi chú: * Các kí tự khác (a, b, c…) cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 theo Duncan’s test Kí hiệu “-“: mẫu chết Hình Các hoa hồng sau 30 ngày nuôi cấy môi trường bổ sung IBA (0; 0,5; 1; 1,5; mg/l tương ứng từ trái qua phải) Trên môi trường đối chứng, có trung bình rễ/cây hình thành Trong đó, nồng độ 0,5 mg/l IBA 8,33 rễ hình thành Các rễ dài so với rễ nghiệm thức khác (0,83 cm) Tuy nhiên, nồng độ IBA môi trường nuôi cấy tăng lên, số rễ giảm dần Mức giảm thấp đột ngột (1,33 rễ/chồi) chồi ni cấy mơi trường có bổ sung 1,5 mg/l IBA mg/l khơng có rễ quan sát (mẫu chết) (Hình 3) Sự hình thành rễ từ chồi nuôi cấy giai đoạn quan trọng vi nhân giống trồng Trong giai đoạn rễ, auxin NAA, IAA, IBA chất điều hòa sinh trưởng sử dụng nhiều Auxin có tác dụng kích thích hình thành rễ, rút ngắn thời gian rễ làm tăng số lượng chiều dài rễ (Erwin et al., 1997) khơng phải loại có kết tương tự Auxin có tác dụng phản biệt hóa tế bào làm xuất mầm rễ giai đoạn đầu hình thành rễ, quan Ở 235 Dương Tấn Nhựt et al giai đoạn kéo dài rễ, auxin ngăn cản phát triển ức chế dài rễ ảnh hưởng tới sức sống sinh trưởng chồi cấy (Davies, 1987) Rễ hoa hồng dễ dàng cảm ứng môi trường MS bổ sung auxin (IAA, IBA NAA) nồng độ thấp từ 0,1-0,5 mg/l (Hasegawa, 1980) Nồng độ 0,5 mg/l IBA thu cho kết rễ hoa hồng tốt báo cáo Syamal Singh (1996); nhiên, tác giả có kết hợp thêm với 0,2 mg/l NAA Kết khác với báo cáo Rout đồng tác giả (1991) cho kết rễ hoa hồng tối ưu mg/l IBA Điều giải thích độ tuổi mẫu giống hoa hồng sử dụng thí nghiệm IBA loại auxin thường dùng cho nuôi cấy in vitro hoa hồng (Sahoo, Debata, 1997) IBA biết đến chất kích thích rễ hiệu số đối tượng thực vật khác Bixia orellana (De Paiva Neto et al., 2003) Đặc biệt, IBA có hiệu gấp lần so với IAA xử lý rễ Prunus (Mateja et al., 2005) rút ngắn thời gian rễ tới lần so với xử lý với IAA (Van der Krieken et al., 1993) Như vậy, nồng độ IBA tối ưu cho rễ, sinh trưởng hoa hồng nghiên cứu 0,5 mg/l Ảnh hưởng nồng độ nano bạc lên khả sinh trưởng, phát triển hoa hồng in vitro Sau 30 ngày nuôi cấy chồi hoa hồng mơi trường tối ưu thí nghiệm có bổ sung nano bạc với nồng độ khác (0; 1; 3; 5; 7; 9; 11 mg/l), kết thu cho thấy tất nồng độ nano bạc khảo sát cho tiêu sinh trưởng, phát triển cao so với đối chứng Nồng độ nano bạc tăng dần tiêu sinh trưởng, phát triển hoa hồng tăng dần (Bảng 4) Đặc biệt, nồng độ tối ưu thu mg/l nano bạc, in vitro đạt chiều cao (2,93 cm), số lá/cây (8 lá), chiều dài (1,9 cm), chiều rộng (1,6 cm), khối lượng tươi (517, 67 mg), khối lượng khô (52 mg), chlorophyll a (6,80 µg/g) b (3,49 µg/g) cao Quan sát thấy khỏe mạnh với chiều cao đồng đều, thân chắc, mập, có hệ rễ dày xanh, to khỏe, bị vàng lá, rụng so với đối chứng (Bảng 4, Hình 4) Trên môi trường bổ sung 11 mg/l nano bạc, tiêu theo dõi lại giảm, thấp hơn, tiêu theo dõi giảm so với nghiệm thức bổ sung mg/l nano bạc Bảng Ảnh hưởng nồng độ nano bạc lên khả sinh trưởng, phát triển hoa hồng in vitro Nano bạc Chiều cao (cm) Số lá/cây Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) Số rễ Chiều dài rễ (cm) Chlorophyl la (µg/g) Chlorophyl lb (µg/g) Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khô (mg) 1,67e* 5,00d 1,53c 0,97d 8,00e 0,87c 2,64e 1,72f 333,67f 32,67f 2,07d 5,33d 1,57c 1,07cd 8,67e 0,87c 3,73d 2,12d 378,00e 37,00e 2,43c 6,63bc 1,60c 1,17bc 10,00d 0,97c 3,85d 2,15cd 428,67d 41,67d 2,47c 6.67b 1,67bc 1,30b 11,00d 1,23b 4,04c 2,23c 463,00c 44,33c 1,57a 13,67b 1,40a 4,28b 2,46b 496,33b 48,67b 2,70b 7,00b 1,80a b 2,93a 8,00a 1,90a 1,60a 15,00a 1,50a 6,80a 3,49a 517,67a 52,00a 11 2,53c 5,67cd 1,63c 1,27b 12,33c 1,37a b 4,10c 2,02e 444,00cd 42,67cd Ghi chú: * Các kí tự khác (a, b, c…) cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa mức α = 0,05 theo Duncan’s test Hình Cây hoa hồng sau 30 ngày nuôi cấy môi bổ sung nano bạc với nồng độ khác (0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 mg/l) 236 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(2): 231-239, 2015 Hiệu tích cực lên tạo rễ, sinh trưởng phát triển chồi trường hợp hiệu cộng gộp IBA (0,5 mg/l) kết hợp với nano bạc Nano bạc có vai trò quan trọng ni cấy mơ thực vật Nano bạc khơng có vai trò làm tăng cường khả sinh trưởng, phát triển (chiều dài chồi rễ, diện tích lá), tăng cường trình biến dưỡng (tổng hợp chlorophyll, tăng hàm lượng carbohydrate protein tổng hợp enzyme oxi hóa) cải Brassica juncea, đậu ngơ (Salama, 2012) mà tăng cường khả hình thành rễ , ức chế hình thành ethylene Crocus sativus (Rezvani et al., 2012) Nồng độ nano bạc tối ưu cho trình sinh, trưởng phát triển cúc (10 mg/l), đồng tiền (5 mg/l) dâu tây (10 mg/l) khảo sát (Dương Tấn Nhựt et al., 2014) Với hoa hồng in vitro thí nghiệm chúng tơi mg/l nano bạc Các nồng độ tối ưu khác kiểu gene khác loại thực vật Quang hợp trình thực vật trái đất để chuyển hóa lượng ánh sáng thành lượng hóa học tích lũy hợp chất hữu Ngày nay, nhà khoa học nỗ lực cải thiện tính hiệu bó mạch thực vật nhiều kỹ thuật thao tác gene Nhằm làm tăng tốc độ quang hợp thực vật, Rubisco - enzyme quan trọng trình quang hợp xúc tác cho hợp CO2 vào hợp chất sinh học nghiên cứu Theo Lei đồng tác giả (2007), khoáng nano thúc đẩy tồn q trình vận chuyển electron, hoạt động quang khử quang hệ thống II, giải phóng oxi hoạt động quang phophoryll hóa chlorophyll ánh sáng khả kiến ánh sáng cực tím Các kim loại nano vai trò quan trọng hệ thống quang hợp Chlorophyll trung tâm phản ứng quang hợp gắn kết với tinh thể nano vàng nano bạc Do đó, hình thành nên hệ thống lai lạ sản xuất gấp 10 lần electron cộng hưởng gene nguyên sinh (plasmon resonance) phân ly lỗ electron nhanh, chế tăng cường giúp thiết kế hệ thống ánh sáng nhân tạo Đây lý nghiệm thức bổ sung nano bạc, hàm lượng chlorophyll a b cao so với nghiệm thức đối chứng khơng bổ sung nano bạc Trên giới có nhiều nghiên cứu nano nói chung nano bạc nói riêng ni cấy mơ tế bào thực vật Nano bạc có hiệu lên kéo dài rễ, thân tăng khối lượng khô Phaseolus vulgaris L., Zea mays L (Salama, 2012); Boswellia ovaliofoliolata (Savithramma et al., 2012) Ở Việt Nam gần có vài nghiên cứu in vitro nano bạc cho thấy nano bạc có hiệu cao việc thúc đẩy trình sinh trưởng phát triển đối tượng cúc, dâu tây, đồng tiền (Dương Tấn Nhựt et al., 2014) KẾT LUẬN Hiệu nano bạc nhân giống in vitro hoa hồng khẳng định nghiên cứu Bổ sung bạc nano kết hợp với BA IBA cho hiệu tốt việc sử dụng BA (2 mg/l) riêng lẻ nhân chồi IBA (0,5 mg/l) riêng lẻ tạo rễ, sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro Trong đó, nồng độ nano bạc tối ưu ảnh hưởng lên khả nhân nhanh chồi in vitro lên khả sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro mg/l Chồi quan sát mơi trường có đặc điểm bật xanh, khỏe, khơng bị vàng lá; chiều cao đồng cao so với đối chứng Bộ rễ khỏe mạnh, nhiều đồng nguồn in vitro chất lượng sau Với hiệu nhân giống hoa hồng nghiên cứu này, nano bạc chứng tỏ ưu việt hệ thống nuôi cấy in vitro hoa hồng quan tâm tương lai Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Chương trình “Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ nano nông nghiệp” (Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Abdi G, Salehi H, Khosh-khuri M (2008) Nano silver: Anovel nanomaterial for removal of bacterial contamination in Valerian (V officinalis) tissue culture Acta Physiol Plant 30: 709-714 An J, Zhang M, Wang SH, Tang J (2008) Physical, chemical and microbiological change in stored green asparagus spears as affected by coating of silver nanoparticle-pvp LWT - Food Sci Tech 41: 1100-1107 Backor M, Kovik J, Dzubaj A, Bakorova M (2009) Physiological comparison of copper toxicity in the lichens Peltigera rufescens (Weis) Humb and Cladina arbuscula subsp Mitis (Sandst.) Ruoss Plant Grow Reg 58: 279-286 Cameron, AC, Reid MS (2001) 1-MCP blocks ethyleneinduced petal abscission of Pelargonium peltatum but the effect is transient Postharvest Biol Tech 22: 169-177 237 Dương Tấn Nhựt et al Celikel FG, Dodge LL, Reid MS (2002) Efficacy of 1MCP (1-methylcyclopropene) and Promalin for extending the post-harvest life of Oriental lilies (Lilium × ‘Mona Lisa’ and ‘Stargazer’) Sci Hort 93: 149-155 Chau HN, Bang LA, Buu NQ, Dung TTN, Ha HT, Quang DV (2008) Some results in manufacturing of nanosilver and investigation of its application for disinfection Adv Nat Sci 9: 241-248 of nanoanatase TiO2 on photosynthesis of spinach chloroplasts under different light illumination Biol Trace Elem Res 119: 68-76 Lichtentaler HK, Wellburn AR (1985) Determination of total carotenoids, chlorophyll a b of leaf in different solvents Biolchem Soc Trans 11: 591-592 Dhawan V, Bhojwani SS (1986) Micropropagation in crop plants Glimpses Plant Res 7: 1-75 Lok CN, Ho CM, Chen R, He QY, Yu WY, Sun H, Tam PKH, Chiu JF, Che CM (2007) Silver nanoparticles: partial oxidation and antibacterial activities Biol Inorg Chem 12: 527-534 Davies PJ (1987) The plant hormones: their nature, occurrence and functions In Davies PJ, ed Plant hormones and their role in plant growth and development Martinus Nijhoff publishers, the Netherlands: 1-12 Ma X, Geiser-Lee J, Deng Y, Kolmakov A (2010) Interactions between engineered nanoparticles (ENPs) and plants: phytotoxicity, uptake and accumulation Sci Total Environ 408(16): 3053-3061 De Paiva Neto VB, Da Mota TR, Otoni WC (2003) Direct organogenesis from hypocotyl derived explants of annatto (Bixa orellana) Plant Cell Tiss Org Cult 7(5): 159-167 Macnish AJ, Irvig DE, Joyce DC, Vithanage V, Wearing AH (2004) Anatomy of ethyelen-induced floral organ abscission Chamelauciumuncinatum (Myrtaceae), Austr J Bot 53(2): 119-131 Duncan DB (1955) Multiple range and multiple F test Biometrics 11: 1-42 Dương Tấn Nhựt, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Lê Kim Cương,Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Nguyễn Hồng Hoàng, Nguyễn Xuân Tuấn, Nguyễn Thanh Sang, Nguyễn Việt Cường, Đỗ Mạnh Cường, Nguyễn Hồi Châu, Ngơ Quốc Bưu (2014) Khảo sát ảnh hưởng nano bạc lên sinh trưởng phát triển cúc, dâu tây, đồng tiền ni cấy in vitro Tạp chí Công nghệ Sinh học 12(1): 103-111 Erwin JE, Schwarze D, Donahue R (1997) Factors affecting propagation of Clematis by stem cuttings Hort Technol 7: 408-410 Giraldo JP, Landry MP, Faltermeier SM, McNicholas TP, Iverson NM, Boghossian AA, Reuel NF, Hilmer AJ, Sen F, Brew JA, Strano MS (2014) Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing Nat Mater 13(4): 400-408 Mateja S, Franci S, Gregor O (2005) Influence of IAA and IBA on root development and quality of Prunus ‘GselA5’ leafy cuttings Hortsci 40(7): 2052-2055 Monica RC, Cremonini R (2009) Nanoparticles and higher plants Caryologia 62(2): 161-165 Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15(3): 473-497 Nguyễn Xuân Linh (2000) Kỹ thuật trồng hoa Nxb Nông nghiệp Hà Nội Posada M, Ballesteros N, Obando W, Angarita A (1999) Micropropagation of Gerbera from floral buds Acta Hort 482: 329-332 Rezvani N, Sorooshzadeh A, Farhadi N (2012) Effect of nano-silver on growth of saffron in flooding stress World Acad Sci Eng Technol 1: 517-522 Hasegawa PM (1980) Factors affecting shoot and root initiation from cultured rose shoot tips J Am Soc Hortic Sci 105(2): 216-236 Rout GR, Debata BK, Das P (1991) Somatic embryogenesis in callus cultures of Rosa hybrida L cv Landora Plant Cell Tiss Org Cult 27: 65-69 Khan NA (2006) Ethylene action in plants SpringerVerlag Berlin Heidelberg, German Sahoo S, Debata BK (1997) A note on in vitro micropropagation and induction of flowering in the miniature rose-dThe FairyT Orissa J Hortic 25: 87-89 Khodakovskaya MV, de Silva K, Biris AS, Dervishi E, Villagarcia H (2012) Carbon nanotubes induce growth enhancement of tobacco cells ACS Nano 6(3): 2128-2135 Krishnaraj C, Jagan EG, Ramachandran R, Abirami SM, Mohan N, Kalaichelvan PT (2012) Effect of biologically synthesized silver nanoparticles on Bacopa monnieri (Linn.) Wettst plant growth metabolism Process Biochem 47(4): 51-658 Lei Z, Mingyu S, Chao L, Liang C, Hao H, Xiao W, Xiaoqing L, Fan Y, Fengqing G, Fashui H (2007) Effects 238 Salama HMH (2012) Effects of silver nanoparticles in some crop plants, common bean (Phaseolus vulgaris L.) and corn (Zea mays L.) Int Res J Biotech 3(10): 190-197 Savithramma N, Ankanna S, Bhumi G (2012) Effect of nanoparticles on seed germination and seedling growth of Boswellia ovalifoliolata an endemic and endangered medicinal tree taxon Nano Vision 2: 61-68 Shah V, Belozerova I (2008) Influence of metal nanoparticles on the soil microbial community and Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(2): 231-239, 2015 germination of lettuce seeds Water Air Soil Pollut 197: 143-148 Syamal MM, Singh SK (1996) In vitro propagation of rose Hortic J 9: 57- 62 Sharma P, Bhatt D, Zaidi MG, Saradhi PP, Khanna PK, Arora S (2012) Silver nanoparticlemediated enhancement in growth and antioxidant status of Brassica juncea Appl Biochem Biotechnol 167: 2225-2233 Van der Krieken WM, Breteler H, Visser MHM, Mavridou D (1993) The role of the conversion of IBA into IAA on root regeneration in apple: introduction of a test system Plant Cell Rep 12: 203-206 THE EFFECT OF NANO SILVER ON SHOOT MULTIPLICATION, GROWTH AND DEVELOPMENT OF IN VITRO ROSE (ROSA SP.) PLANTLETS Duong Tan Nhut1,* , Nguyen Xuan Tuan1, Nguyen Thi Thuy Anh1, Ho Viet Long1, Hoang Thanh Tung1, Nguyen Ba Nam1, Nguyen Phuc Huy1, Vu Quoc Luan1, Vu Thi Hien1, Le Thi Thu Hien2, Nguyen Hoai Chau3, Ngo Quoc Buu3 Tay Nguyen Institute for Scientific Research, VAST Institute of Genome Research, VAST Institute of Environmental Technology, VAST SUMMARY Rose is one of the most popular flowers which are planted all over the world, and this is due to their diversity of colors and types However, the success of micropropagation protocol is still limited due to some issues including yellow leaves, leaves senescence and brown or black roots In recent years, silver nano has been used in in vitro plant tissue culture for enhancing growth and development owing to its high ability of cell surface contacting In this research, different concentrations of nano silver (1, 3, 5, 7, and 11 mg/l) were used to investigate its effect on shoot multiplication, growth and development of rose plantlets After 30 days of culture, the best shoot multiplication were on MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, g/l agar, 2,5 mg/l BA and mg/l nano silver (the number of newly formed shoots was 4.09 times larger than control) In addition, MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, g/l agar, 0,5 mg/l IBA and mg/l nano silver was the optimal for rooting, growth and development of in vitro rose plantlets Compared to the control, the plantlet’s height, number of leaves per plantlet, leaf’s length, leaf’s width, fresh and dry weights, contents of chlorophyll a and b were remarkably increased (2,93 cm; leaves; 1,9 cm; 1,6 cm; 517, 67 mg; 52 mg; 6,80 µg/g and 3,49 µg/g; respectively) Simultaneously, both shoots and plantlets grew well, rarely or not observed yellow leaves or leaf senescence Most of the plantlets were uniform in height with green leaves and thick root system Keywords: Rose, silver nano, shoot multiplication, growth and development, micropropagation * Author for correspondence: Tel.: +84-63-3831056; Fax: +84-63-3831028; E-mail: duongtannhut@gmail.com 239 ... hưởng nồng độ nano bạc lên khả sinh trưởng, phát triển hoa hồng in vitro Các chồi hoa hồng khoảng cm được cấy vào vào môi trường tốt cho khả rễ, sinh trưởng phát triển chồi hoa hồng in vitro bổ sung... độ IBA tối ưu cho rễ, sinh trưởng hoa hồng nghiên cứu 0,5 mg/l Ảnh hưởng nồng độ nano bạc lên khả sinh trưởng, phát triển hoa hồng in vitro Sau 30 ngày nuôi cấy chồi hoa hồng mơi trường tối ưu... tạo rễ, sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro Trong đó, nồng độ nano bạc tối ưu ảnh hưởng lên khả nhân nhanh chồi in vitro lên khả sinh trưởng phát triển hoa hồng in vitro mg/l Chồi quan sát