Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc captopril của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN =====o0o===== NGUYỄN THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CAPTOPRIL CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MƠI TRƯỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật HÀ NỘI, 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN =====o0o===== NGUYỄN THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CAPTOPRIL CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MƠI TRƯỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Ngừời hướng dẫn khoa học ThS Hà Thị Minh Tâm HÀ NỘI, 2018 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Hà Thị Minh Tâm tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu thực hiện, hồn thành khóa luận Sự hiểu biết sâu sắc khoa học kinh nghiệm quý báu cô tiền đề giúp em đạt kết Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN, thầy cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tận tình giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi thời gian em học tập nghiên cứu Trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln bên cạnh, động viên, khích lệ em hồn thành khóa luận Mặc dù có nhiều cố gắng để hồn thành khóa luận cách tốt Tuy nhiên lần đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận nhận xét, góp ý q thầy, giáo để khóa luận em hồn chỉnh Một lần nữa, em xin chân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Nguyệt LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan viết khóa luận “Nghiên cứu khả giải phóng thuốc Captopril màng cellulose vi khuẩn lên men từ mơi trường chuẩn” cá nhân em, em thực Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực, khách quan chưa tác giả công bố cơng trình Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Thị Nguyệt BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT A A ylince Ba c CM -à Can ogC Đ h C ụ c Mậ t N x MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Phương pháp nghiên cứu NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan CVK 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn A xylinum 1.1.3 Đặc tính màng CVK 1.1.4 Sinh tổng hợp CVK 1.1.5 Môi trường nuôi cấy A xylinum 1.1.6 Tổng quan Captopril 1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Đối tượng nghiên cứu 11 2.2 Vật liệu nghiên cứu 11 2.2.1 Giống vi khuẩn 11 2.2.2 Nguyên liệu hóa chất 11 2.2.3 Thiết bị nghiên cứu 11 2.3 Nội dung nghiên cứu 12 2.4 Phương pháp nghiên cứu 12 2.4.1 Phương pháp tạo màng CVK 12 2.4.2 Quét phổ thuốc Captopril 13 2.4.3 Phương pháp dựng đường chuẩn 13 2.4.4 Chuẩn bị màng CVK 13 2.4.5 Chuẩn bị môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline) -PBS 1X 14 2.4.6 Chế tạo màng CVK nạp captopril 15 2.4.8 Phương pháp thống kê xử lý kết 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 17 3.1 Quét phổ thuốc Captopril 17 3.2 Đồ thị phương trình đường chuẩn nồng độ pH khác 18 3.3 Màng CVK nuôi cấy từ môi trường chuẩn 21 3.4 Tinh chế màng CVK .22 3.5 Thu màng CVK nạp Captopril 24 3.6 Giải phóng thuốc từ màng CVK 25 3.7 Phân tích độc học giải phóng Captopril 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Nồng độ thuốc để xây dựng đường chuẩn 13 Bảng 2.2: Nồng độ chất pha môi trường đệm PBS 14 Bảng 3.1: Lượng thuốc để lập phương trình đường chuẩn pH = 18 Bảng 3.2: Lượng thuốc để lập phương trình đường chuẩn pH = 4,5 19 Bảng 3.3: Lượng thuốc để lập phương trình đường chuẩn pH = 6,8 20 Bảng 3.4: Kết thu màng CVK tươi 21 Bảng 3.5: Giá trị OD hấp thụ thuốc Captopril màng CVK lên men từ môi trường chuẩn 24 Bảng 3.6: Kết lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK lên men từ môi trường chuẩn 25 Bảng 3.7: Giá trị đo quang phổ UV- Vis giải phóng thuốc (n=3) 26 Bảng 3.8: Khả giải phóng thuốc Captopril màng 0.5cm 1cm môi trường pH khác 28 Bảng 3.9: Hệ số tương quan R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) trị số mũ giải phóng (n) mơi trường pH khác 31 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Qt phổ thuốc Captopril pH = 17 Hình 3.2: Quét phổ thuốc Captopril pH = 4.5 17 Hình 3.3: Quét phổ thuốc Captopril pH = 6.8 18 Hình 3.4: Đồ thị đường chuẩn thuốc Captopril bước sóng 214nm 19 Hình 3.5: Đồ thị đường chuẩn thuốc Captopril bước sóng 216nm 20 Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn thuốc Captopril bước sóng 217nm 21 Hinh 3.7: Màng CVK nuôi cấy môi trường chuẩn 22 Hình 3.8: Màng CVK ngâm NaOH 3% 23 Hình 3.9: Màng CVK ngâm HCl 3% 24 Hình 3.10: Khả giải phóng thuốc Captopril màng 0.5cm 1cm môi trường pHkhác 27 Hình 3.11: Đồ thị tỉ lệ giải phóng màng CVK 29 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Quy trình tạo màng CVK 12 Sơ đồ 2.2: Quy trình tinh chế màng CVK 14 Sơ đồ 3.1: Quy trình tinh chế màng CVK 23 Màng CVK tươi Ngâm NaOH 3% có tác dụng làm vỡ tế bào vi khuẩn, giải phóng độc tố Màng CVK có màu vàng Trung hòa HCl 3% Ngâm nước, để trung hòa acid Rửa lại nước Màng CVK tinh khiết, màu trắng Sơ đồ 3.1: Quy trình tinh chế màng CVK Hình 3.8: Màng CVK ngâm NaOH 3% Hình 3.9: Màng CVK sau tinh chế 3.5 Thu màng CVK nạp Captopril Sau cho màng CVK vào dung dịch thuốc Captopril sau thời gian 120 phút rút dịch đo quang phổ máy đo quang phổ UV - Vis 2450 để xác định lượng thuốc nạp vào màng Kết đo quang phổ trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5: Giá trị OD hấp thụ thuốc Captopril màng CVK (Kích thước d1,5cm) lên men từ mơi trường chuẩn Đ 0 , , Sau khoảng thời gian xác định tiến hành rút mẫu từ dung dịch captopril chứa vật liệu CVK nêu Sau đo quang phổ máy UV - Vis 2450 để xác định lượng thuốc lại dung dịch thời điểm rút mẫu Từ xác định lượng thuốc hấp thu vào màng CVK theo công thức: mht (mg) = m1 - m2 Trong đó: mht: Khối lượng thuốc Captopril hấp thu vào vật liệu m1: Khối lượng Captopril ban đầu dungdịch m2: Khối lượng Captopril lại dung dịch sau thời gian vật liệu CVK hấp thu thuốc Captopril Hiệu suất nạp Captopril vào vật liệu CVK tính theo cơng thức: EE (%) = mht/m1×100% Kết lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK lên men từ mơi trường chuẩn trình bày bảng 3.6 sau: Bảng 3.6: Kết lượng thuốc Captopril hấp thụ vào màng CVK (kích thước d1,5cm) lên men từ môi trường chuẩn Đ ộ d O D s a0 , , m ( g 2 H i ệ u , 3.6 Giải phóng thuốc từ màng CVK - Màng CVK sau nạp thuốc sấy khô 50%, sau màng CVK cho vào bình bình dung dịch đệm pH = 2, pH = 4.5 pH = 6.8 - Thể tích bình 900ml - Sau cho vào máy khuấy từ với tốc độ 100 vòng/ phút, điều kiện 37oC - Sau khoảng thời gian 0.5h; 1h; 1.5h; 2h; 2.5h; 3h; 4h; 6h; 8h; 12h; 24h lấy 5ml mẫu đo quang phổ Dùng máy UV- Vis đo quang phổ mẫu thu để đo lượng thuốc giải phóng - Lặp lại nghiệm lần, lấy kết trung bình để tính tốn - Kết thu được thể bảng 3.7 sau: Bảng 3.7: Giá trị đo quang phổ UV- Vis giải phóng thuốc (n = 3) G i 1 2 2 , 0 , , , , , 0 , 0 , 0 , , , , , 0 , 0 , , pH =2 c 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , 0 , , p H c , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 0 , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , p H c , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 26 Từ bảng 3.7 ta dựng đồ thị giải phóng thuốc Captopril màng CVK hình 3.11 Hình 3.10: Khả giải phóng thuốc Captopril màng 0.5cm 1cm môi trường pH khác Từ hình 3.11 bảng 3.7 ta thấy môi trường đệm pH khả giải phóng thuốc tăng dần đến thời điểm định dừng lại khơng tăng với độ dày màng Ở môi trường pH khác khả giải phóng thuốc đạt cực đại thời điểm khác Ở môi trường pH = 2, pH = 4.5, pH = 6.8 khả giải phóng thuốc đạt cực đại thời điểm 8h Khả giải phóng thuốc mơi trường pH = 4.5 cao  Từ giá trị OD thu bảng 3.7, tính tỉ lệ giải phóng thuốc Captopril màng CVK thể bảng 3.8 27 Bảng 3.8: Tỉ lệ giải phóng thuốc (n=3) G pH = iờ c 3 4, 1, 0, 0, 0 3 8, 1, 0, 0, 0 1, 4, 0, 0, 0 4, 7, 0, 0, 0 4 5, 0, 0, 0, 0 4 4, 0, 0, 0, 0 4 7, 4, 0, 0, 0 0, 6, 0, 0, 0 1, 9, 0, 0, 0 4 5, 8, 0, 0, 0 4 4, 7, 0, 0, 0 pH = Ph = 4.5 6.8 1c c5 m 3 3, 2, 2, 3, 0, 0, 0, 0, 0 0 4 8, 0, 0, 9, 0, 0, 0, 0, 0 0 4 2, 1, 2, 2, 0, 0, 0, 0, 0 0 4 5, 5, 5, 0, 0, 0, 0, 0 0 4 9, 9, 6, 7, 0, 0, 0, 0, 0 0 4 1, 0, 6, 7, 0, 0, 0, 0, 0 0 5 2, 3, 0, 2, 0, 0, 0, 0, 0 0 5 5, 4, 1, 5, 0, 0, 0, 0, 0 0 5 6, 5, 3, 6, 0, 0, 0, 0, 0 0 4 7, 9, 7, 2, 0, 0, 0, 0 0 ,0 4 6, 8, 6, 1, 0, 0, 0, 0, 0 0 28 Từ tỉ lệ giải phóng thuốc Captopril màng CVK bảng 3.8, dựng đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc hình 3.12 sau: Hình 3.11: Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc màng CVK Nhận xét: Từ bảng 3.8 hình 3.12 số liệu bảng lượng thuốc Captopril giải phóng mơi trường pH = 4.5 cao Tại pH = 4.5: - Tỉ lệ thuốc Captopril màng 0.5cm giải phóng cực đại 8h 66.73± 0.0014 - Tỉ lệ thuốc Captopril màng 1cm giải phóng cực đại 8h 55.65± 0.0026 So sánh tỉ lệ giải phóng thuốc Caotopril trung bình độ dày màng 0.5cm 1cm môi trường pH = 4.5 hàm t- Test: Two Sample Assuming Unequal Variances, kết có khác biệt khả giải phóng thuốc Captopril từ độ dày màng P < 0.05 nên giá trị trung bình tỉ lệ giải phóng độ dày màng có ý nghĩa Tóm lại: Màng CVK nạp thuốc Captopril có độ dày 0.5cm có khả giải phóng thuốc Captopril tốt màng CVK nạp thuốc Captopril có độ dày 1cm mơi trường pH = 4.5 29 Khi sử dụng màng CVK mơi trường pH khác thấy tỉ lệ lgiải phóng thuốc mơi trường pH = 4.5 lớn Điều dễ dàng giải thích Captopril tan tốt môi trường axit (dịch dày) Khi khơng có màng CVK làm tăng khả giải phóng thuốc sinh khả dụng thuốc Captopril 52%- 59% Tuy nhiên sử dụng màng CVK để làm tăng khả giải phóng thuốc, sinh khả dụng thuốc Captopril lên đến 66.73± 0.0014 thời gian giải phóng thuốc kéo dài tới Như vậy, dùng màng CVK để làm tăng khả giải phóng thuốc Captopril, giúp thuốc Captopril giải phóng kéo dài, tăng sinh khả dụng 3.7 Phân tích độc học giải phóng Captopril Từ tỉ lệ thuốc Captopril giải phóng màng CVK - Captopril (bảng 3.4), sử dụng phần mềm DDSlover với mơ hình First order, Higuchi, Hixson - Crowel, Korsmeyer - Peppas làm mơ hình động học để phân tích dược động học giải phóng CM ta thu kết bảng 3.9 30 Bảng 3.9 Hệ số tương quan R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) trị số mũ giải phóng (n) mơi trường pH khác M p ẫ H u 4.5 6.8 15 16 19 F i r K 43 23 Hi 2 H i x k k 7 K r m 31 Như thể nghiên cứu trước Jayswal cs [18], mơhình First order đại diện cho tỉ lệ giải phóng thuốc phụ thuộc vào nồng độ thuốc Mơ hình Higuchi giả định việc giải phóng thuốc chế khuếch tán Mơ hình Hixson - Crowel đại diện cho tỉ lệ giải phóng thuốc phụ thuộc vào mơi trường đệm Mơ hình Krosmeyer - Peppas đưa nhìn tồn diện tỉ lệ giải phóng thuốc trương nở vật liệu vận tải phân phối thuốc, độ trương nở vật liệu cao tốc độ giải phóng thuốc mạnh ngược lại Khi thuốc Captoprl giải phóng dung dịch đệm pH = 2, pH = 4.5 pH = 6.8 tn theo mơ hình Korsmeyer - Peppas (R2 > 50%) Kết cho thấy khả ứng dụng mơ hình Korsmeyer - Peppas cho trương nở sợi cellulose màng CVK, sợi cellulose trương nở nhiều, tạo nhiều khoảng không gian rộng thuốc Captopril khuếch tán nhanh Trong hệ thống khuếch tán Fickian [20], n < 0,43 giải phóng thuốc xảy theo chế khuếch tán, 0,43 < n < 0,85 khơng có giải phóng thuốc xảy ra, n > 0,85 có ăn mòn vật liệu (màng CVK) Các giá trị n thu từ bảng 3.5 n < 0,43 giải thích giải phóng thuốc chế khuếch tán thuốc Captopril từ màng CVK - Captopril mơi trường đệm Tóm lại: Sự trương nở sợi cellulose màng CVK có ảnh hưởng phần đến khuếch tán thuốc Captopril ngược lại Như vậy, chế giải phóng thuốc Captopril bị ảnh hưởng mơi trường đệm, tính chất màng CVK nồng độ thuốc Captopril 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN: 35 Q trình nghiên cứu đề tài khóa luận, thu số kết sau: Tạo màng CVK độ dày 0,5cm 1cm, cảm quan thấy màng có độ tinh khiết cao, chất dẻo dai, khả thấm hút tốt Dựa bảng số liệu tính được, nhận thấy khả giải phóng thuốc màng CVK có độ dày 0,5cm cao màng CVK có độ dày 1cm Đệm pH = 4.5 môi trường tốt để giải phóng thuốc tốt giúp kéo dài thời gian giải phóng thuốc, tăng sinh khả dụng thuốc 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 37 Đặng Thị Hồng Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính Sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạp màng sinh học (CV) Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh.Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí Dược học số 361/2006, trang 18 - 20 Nguyễn Bình Nguyên Bước đầu nghiên cứu tổng hợp thiết lập tạp chuẩn Captopril Disulfid Phó Giáo sư Tiến sĩ Phạm Thị Minh Huệ Nghiên cứu bào chế viên nén Captopril giải phóng theo nhịp” Tạp chí dược học, tập 397,số 5, 2009 Dược điển Việt Nam, xuất lần thứ 4, 2009 Trịnh Hữu Bằng, Đỗ Công Quỳnh (2001), sinh lý học người động vật, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, trang 173, 184 – 187 Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylium, đề tài cấp bộ, Bộ Y tế GS.TS.Nguyễn Lân Việt (2017) “Thực trạng đáng báo động bệnh Tăng huyết áp Việt Nam” Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng” Tạp trí khoa học công nghệ 50 (4),453 - 462 Đinh Thị Kim Nhung (1998), “Tối ưu hóa thành phần môi trường dinh dưỡng cho Acetobacter xylinum phương pháp quy hoạch thực nghiệm” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 36(1), 10 – 12 38 Tài liệu tiếng anh 10 Almeida, I.F., et al (2013), “Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin conpatibility study” Eur J PharmBiopharm, 24(3), 445 – 449 11 Amin MCIM, Ahmad N, et al (2012), “Bacterial cellulose film coating as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties”, Sain Malaysiana, 41(5), pp 561 - 12 Klemm D et al (2009), “Nanocellulose materials - different cellulose, different functionality”, Macromol Symp, 280, 60- 71 13 Hai - Peng Cheng, Pie - Ming Wang, Jech - Wei Chen and Wen – Teng Wu, (2002) “Cultivation of Acetobacter xylinum for Bacterial cellulose production in a modiýied airlift reactor”, Biotechnol, Appl, Biochem, 35,125 – 132 14 Brown E (2007), Bacterial cellulose Themoplastic polymer nanocomposites, Master of sience in chemical engineering, Washington state university 15 Czaja, W K., Young, D J., Kawecki, M & Brown Jr, R M 2007 “ The future prospects of microbial cellulose in biomedical applications ” Biomacromolecules 8(1): - 12 16 Patel, U.D & Suresh, S (2008), “Complete dechlorination of pentachlorophenol using palladized bacterial cellulose in a rotating” 18 Klemm D et al (2001), “Bacterial synthesized cellulose – artificial blood vessels for microsurgery”, Prog Polym Sci, 26, pp 1561 – 1603 19 Lina Fu, Yue Zhang, Chao Li, Zhihong Wu, Qi Zhuo, Xia Huang,Guixing Qiu, Ping Zhou and Guang Yang (2012), skin tissue repairmaterials from bacterial cellulose by a multilayer fermantation method 20 Scheinfeld (2003), “Cimetidine: a review of the recent developments and reports in cutaneous medicine”, Dermatol Online J (2), – 80 39 ... cứu khả giải phóng thuốc captopril màng Cellulose vi khuẩn (CVK) lên men từ môi trường chuẩn nhằm tạo hệ thống giải phóng thuốc kéo dài Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: khả giải. .. phụ, khả dụng sinh học CVK vi c điều trị bệnh[19] Đây lý chọn đề tài: Nghiên cứu khả giải phóng thuốc captopril màng cellulose vi khuẩn lên men từ mơi trường chuẩn Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu. .. nghiên cứu: khả giải phóng thuốc captopril màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn - Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu thực quy mơ phòng thí nghiệm - Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm