Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== NGUYỄN THỊ HUYỀN TRANG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CURCUMIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MƠI TRƯỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học TS NGUYỄN XUÂN THÀNH HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Thành người tận tình theo sát hướng dẫn em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2; thầy, cô khoa Sinh kỹ thuật Nông nghiệp; thầy, cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng Trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Do bước đầu vào thực tế sáng tạo nghiên cứu khoa học, kiến thức em hạn chế nhiều bỡ ngỡ Do vậy, khơng tránh khỏi thiếu sót điều chắn, em mong nhận góp ý quý báu quý thầy cô bạn sinh viên để đề tài khóa luận tốt nghiệp em hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô! Hà Nội, Ngày 20 tháng 04 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Huyền Trang LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Xuân Thành Những số liệu kết khóa luận trung thực, khơng có trùng lặp chép đề tài khác Nếu sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, Ngày 20 tháng 04 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Huyền Trang MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan BC 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Acetobacter xylinum 1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng vi khuẩn A xylinum 1.1.3 Môi trường nuôi cấy A xylinum 1.1.4.Cấu trúc màng BC 1.1.6 Ứng dụng màng BC 1.2 Curcumin 1.2.1 Công thức cấu tạo 1.2.2 Tính chất lí hóa curcumin 1.2.3 Dược chất 1.2.4 Sinh khả dụng 11 1.2.5 Rủi ro tác dụng phụ 11 1.3 Tình hình nghiên cứu nước 12 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 14 Chương Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Vật liệu nghiên cứu 16 2.2.1 Hóa chất 16 2.2.2.Thiết bị, dụng cụ 16 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Tạo màng BC từ môi trường chuẩn 17 2.4.2 Phương pháp dựng đường chuẩn 18 2.4.3 Tạo màng BC nạp curcumin 20 2.4.4 Xác định lượng curcumin nạp vào màng BC 20 2.4.5 Chuẩn bị môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline) - PBS 1X 22 2.4.6 Xác định lượng thuốc giải phóng màng BC nạp thuốc curcumin 22 Chương Kết nghiên cứu thảo luận 25 3.1 Màng BC nuôi cấy từ môi trường chuẩn 25 3.2 Màng BC nạp thuốc curcumin 26 3.3 Lượng thuốc giải phóng từ màng BC vào môi trường pH khác nhau28 3.3.1 Mật độ quang curcumin tiến hành giải phóng thuốc thời điểm khác môi trường pH khác 28 3.3.2 Tỉ lệ giải phóng dược chất màng môi trường pH khác khoảng thời gian khác 30 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 BẢNG VIẾT TẮT Tên viết tắt A xylinum BC OD Tên latinh Tên tiếng Anh Acetobacter xylinum Bacterial cellulose Optical Density DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ảnh hưởng pH lên màu dạng tồn curcumin Bảng 2.1: Thành phần môi trường tạo màng BC 17 Bảng 2.2: Mật độ quang (OD) dung dịch curcumin nồng độ (mg/ml) khác (n = 3) 19 Bảng 2.3 Môi trường đệm PBS 22 Bảng 3.2: Mật độ quang tiến hành giải phóng thuốc thời điểm khác môi trường pH khác 29 Bảng 3.3: Tỉ lệ giải phóng dược chất màng mơi trường pH khác khoảng thời gian khác (n = 3) 31 Bảng 3.4: Hệ số tương quan R , tốc độ giải phóng thuốc (k) trị số số mũ giải phóng (n) môi trường pH khác 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.2: Cấu tạo curcumin Hình 1.3: Cấu tạo Demetoxy - curcumin Hình 1.4: Cấu tạo Bis - demetoxy - curcumin Hình 1.5: Cấu tạo xiclocurcumin Hình 2.1 Quy trình tinh chế màng BC 18 Hình 2.2: Phương trình đường chuẩn curcumin (n = 3) 20 Hình 3.1: Màng BC ni cấy mơi trường chuẩn 25 Hình 3.2: Màng BC tinh chế 26 Hình 3.4: Màng BC nạp thuốc sấy khơ 27 Hình 3.5: Màng BC cho vào môi trường pH 12 28 Hình 3.6: Biểu đồ so sánh mật độ quang lượng thuốc giải phóng màng 0,5cm 1cm môi trường pH khác (n = 3) 30 Hình 3.7: Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng pH = 32 Hình 3.8: Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng pH = 12 33 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Hiện nay, Acetobacter xylinum BC đối tượng nhiều nghiên cứu ứng dụng nhà khoa học nước nước Đây loại nguyên liệu mới, ứng dụng nhiều lĩnh vực thực phẩm, y học, mỹ phẩm, Theo kết nghiên cứu cho thấy màng BC tạo nên từ nguyên liệu dẻ tiền, dễ kiếm, sản xuất quy mô công nghiệp Về mặt tính chất BC có độ tinh lớn nhiều so với loại cellulose khác, phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn Ngồi BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định kích thước hướng BC mạng polymer sinh học có khả giữ nước lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, chịu thể tích đáng kể bề mặt (lực bền học cao) Curcumin đóng vai trò quan trọng hoạt tính sinh học củ nghệ sử dụng y học để chữa trị loạt bệnh tật [7] Dựa nghiên cứu ống nghiệm (in vitro) động vật, nhà khoa học đưa giả thuyết khả chữa bệnh ngăn ngừa bệnh curcumin Hiện tại, tác động chưa xác nhận người Tuy nhiên, năm 2008, nhiều thử nghiệm lâm sàng người thử nghiệm để nghiên cứu tác dụng curcumin việc điều trị bệnh như: viêm tủy, ung thư tụy, hội chứng loạn sản tủy, ung thư ruột kết, bệnh vẩy nến, bệnh Alzheimer [15] Theo nghiên cứu cho thấy curcumin có tính chất chống ung thư [12, 13], chống ơxi hóa, chống viêm khớp, chống thối hóa, chống thiếu máu cục kháng viêm Khả kháng viêm ngăn chặn tổng hợp sinh học eicosanoit Hình 3.5: Màng BC cho vào môi trường pH 12 3.3 Lượng thuốc giải phóng từ màng BC vào môi trường pH khác 3.3.1 Mật độ quang curcumin tiến hành giải phóng thuốc thời điểm khác môi trường pH khác Khi tiến hành giải phóng thuốc mơi trường pH, ta rút mẫu khoảng thời gian 0,5h; 1h; 2h; 4h; 6h; 8h… tiến hành đo mật độ quang mẫu thu kết bảng 3.2: Bảng 3.2: Mật độ quang tiến hành giải phóng thuốc thời điểm khác môi trường pH khác Giờ (h) pH pH 12 0,5 m 0,5 12 24 1cm 0,5cm 1cm 0,357± 0,349± 0,361± 0,352± 0,0001 0,000115 0,00016 0,000057 0,364± 0,355± 0,367± 0,360± 0,000152 0,000577 0,000104 0,002081 0,371± 0,362± 0,375± 0,368± 0,000115 0,000057 0,0001 0,000152 0,379± 0,369± 0,381± 0,371± 0,0001 0,000076 0,000763 0,000321 0,385± 0,386± 0,391± 0,386± 0,000208 0,0001 0,000115 0,000208 0,403± 0,398± 0,409± 0,397± 0,173291 0,000173 0,000763 0,000076 0,379± 0,377± 0,378± 0,380± 0,000217 0,000152 0,00005 0,001 0,371± 0,365± 0,372± 0,372± 0,001527 0,0001 0,000104 0,0005 Biểu đồ mật độ quang học lượng thuốc curcumin giải phóng khoảng thời gian khác độ dày màng khác mơi trường pH khác thể hình 3.6: Mật độ quang 0.42 0.41 0.4 0.39 0.38 0.37 0.36 0.35 0.34 0.33 0.32 0.31 pH (0,5cm) pH (1cm) pH 12 (0,5cm) pH 12 (1cm) 0,5 Thời gian (h) 12 24 Hình 3.6: Biểu đồ so sánh mật độ quang lượng thuốc giải phóng màng 0,5cm 1cm môi trường pH khác (n = 3) Nhận xét: Theo biểu đồ hình 3.6 thấy lượng thuốc giải phóng mơi trường pH = 12 lớn giải thích là mơi trường pH tối ưu curcumin Sử dụng hàm t – Test (Two Sample Assuming Unequal Variances) kết thu kết p < 0,05 giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê từ bảng 3.2 thấy màng BC có độ dày 0,5cm có tốc độ giải phóng dược chất lớn so với màng BC có độ dày 1cm Ở pH = 12 ta thấy dược chất giải phóng nhiều so với lượng dược chất giải phóng mơi trường pH = 3.3.2 Tỉ lệ giải phóng dược chất màng môi trường pH khác khoảng thời gian khác Phần trăm dược chất giải phóng mơi trường pH độ dày màng 0,5cm 1cm tính tốn (theo cơng thức số 4) trình bày bảng 3.3 đây: Bảng 3.3: Tỉ lệ giải phóng dược chất màng môi trường pH khác khoảng thời gian khác (n = 3) Giờ (h) 0,5 12 24 pH pH 12 0,5cm 1cm 0,5cm 1cm 3,474± 2,788± 3,978± 3,219± 0,0125 0,0161 0,0215 0,0081 4,557± 3,827± 4,946± 4,733± 0,0195 0,0779 0,0141 0,2827 5,677± 4,98± 6,227± 5,886± 0,0145 0,0065 0,0196 0,0101 6,944± 6,207± 7,263± 6,601± 0,0326 0,0443 0,0921 0,0584 8,083± 8,911± 8,955± 9,046± 0,0287 0,0338 0,0838 0,0145 10,697± 11,036± 11,587± 11,036± 0,0156 0,0258 0,0853 0,0234 8,346± 8,698± 8,36± 9,565± 0,0923 0,0176 0,0145 0,0172 7,628± 7,411± 7,985± 8,506± 0,2707 0,0261 0,0143 0,0699 Nhận xét: theo kết tỉ lệ giải phóng thuốc mơi trường pH thể bảng 3.3 thấy lượng thuốc giải phóng mơi trường pH = 12 cao khả giải phóng kéo dài lên tới 8h Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng theo pH độ dày màng 0,5cm 1cm thể hình 3.7, 3.8: Tỉ lệ dược chất giải phóng (%) 12 10 pH (0,5cm) pH (1cm) 0,5 Thời gian (h) 12 24 Hình 3.7: Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng pH = Tỉ lệ dược chất giải phóng (%) 14 12 10 pH 12 (0,5cm) pH 12 (1cm) 0,5 Thời gian (h) 12 24 Hình 3.8: Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng pH = 12 Nhận xét: Từ biểu đồ hình 3.7, 3.8 thấy mơi trường pH màng có độ dày 0,5cm có khả giải phóng nhanh màng có độ dày 1cm Sử dụng phần mềm DDSolver để tính hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng (K) màng BC từ số liệu tỉ lệ giải phóng thuốc curcumin thể bảng 3.4: Bảng 3.4: Hệ số tương quan R , tốc độ giải phóng thuốc (k) trị số số mũ giải phóng (n) môi trường pH khác pH Màng First - order R k1 Higuchi R kH Hixson - Crowwel R kHC Korsmeyer - Peppas R kKP n 12 0,5cm 1cm 0,5cm 1cm 3,2742± 1,6049± 3,9617± 2,342± 0,1034 0,37 0,1029 0,1505 0,006± 0,006± 0,006± 0,007± 0,0002 0,0001 0,0002 0,0002 0,4498± 0,0301± 0,6876± 0,0522± 0,0719 0,0116 0,0317 0,0112 2,5263± 2,5173± 2,6743± 2,7257± 0,0255 0,0025 0,0051 0,0106 3,3409± 1,8526± 3,7652± 2,4051± 0,1028 0,0028 0,1043 0,1527 0,002± 0,0021± 0,0021± 0,002± 0,0002 0,0002 0,0001 0,0017 0,6044± 0,5739± 0,5399± 0,6787± 0,0308 0,0032 0,0056 0,0087 5,2097± 4,765± 5,716± 5,242± 0,0111 0,0181 0,0147 0,075 0,192± 0,23± 0,176± 0,223± 0,005 0,0015 0,0012 0,005 Theo nghiên cứu trước đây, mơ hình First - order đại diện cho tỉ lệ giải phóng thuốc phụ thuộc vào nồng độ thuốc Mơ hình Higuchi giả định việc giải phóng thuốc chế khuếch tán Mơ hình Krosmeyer Peppas đưa nhìn tồn diện tỉ lệ giải phóng thuốc tỉ lệ với trương nở vật liệu mang thuốc, độ trương nở vật liệu cao tốc độ giải phóng thuốc cao ngược lại [20] Các công thức giải phóng thuốc từ màng có độ dày khác cho thấy mơ hình Higuchi Korsmeyer - peppas (R > 70%) có phù hợp so với mơ hình khác Kết cho thấy khả ứng dụng mơ hình Korsmeyer - Peppas cho trương nở sợi cellulose màng BC Trong hệ thống khuếch tán Fickian [23, 24], n < 0,43 xảy giải phóng thuốc theo chế khuếch qua vật liệu, 0,43 < n < 0,85 khơng có giải phóng thuốc xảy ra, n > 0,85 thuốc giải phóng ăn mòn vật liệu Theo bảng 3.4 giá trị n thu < 0,43 chứng tỏ có giải phóng thuốc theo chế khuếch tán, khơng có ăn mòn BC q trình giải phóng thuốc Việc giải phóng thuốc màng 0,5cm lớn màng 1cm giải thích trương nở màng BC môi trường pH khác Ở mơi trường pH = 12 có trương nở nhiều dẫn đến tạo khe hở nhiều hơn, liên kết màng trở nên lỏng lẻo hơn, lượng curcumin giải phóng qua sợi cellulose nhiều nhanh Màng BC cấu tạo polime cao phân tử bền nên khơng có ăn mòn xảy q trình giải phóng thuốc Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận Tạo màng BC từ A xylinum môi trường chuẩn Dựa bảng số liệu tính được, nhận thấy khả hấp thụ giải phóng thuốc màng BC có độ dày 0,5cm tốt màng BC có độ dày 1cm môi trường pH 12 màng BC giải phóng thuốc tốt mơi trường pH 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu khả giải phóng thuốc curcumin màng BC tạo chủng A xylinum từ loại môi trường khác Tiếp tục nghiên cứu khả giải phóng loại thuốc khác màng BC nhằm tăng tác dụng loại thuốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Dương Thị Hồng Ánh, Phạm Văn Giang, Nguyễn Trần Linh (2014), “Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano curcumin phương pháp nghiền bi kết hợp với đồng hóa tốc độ cao”, Nghiên cứu Dược thông tin thuốc, 1, - 11 Dương Thị Hồng Ánh, Thân Thị Liên, Nguyễn Trần Linh (2012), “Nghiên cứu bào chế hệ phân tán rắn chứa curcumin”, Nghiên cứu Dược thông tin thuốc, 4, 142 - 145 Trịnh Hoàng Dương, Hà Diệu Ly (2011), “Chiết xuất curcumin từ củ nghệ vàng xây dựng liệu chuẩn curcumin để thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu”, Tạp chí Dược học, Viện Dược liệu, 424, 26 - 29 Trần Thị Liên, Nguyễn Trần Linh, Dương Thị Hồng Ánh Nghiên cứu bào chế hệ phân tán rắn chứa Curcumin Nghiên cứu dược 4/2012 Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013) Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn A xylinum tạo màng Bacteril Cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 50 (4), 453 - 462 Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylium, đề tài cấp bộ, Bộ Y tế Tài liệu tiếng Anh Aggarwal B B., Sundaram C., Malani N., Ichikawa H (2007) “Curcumin: the Indian solid gold” Adv Exp Med Biol 595: - 75 Armando JD et al (2014),”Do bacterial cellulose membranes have potential in drug-delivery systems”, Expert Opin 10 Bharat B Aggarwal Anusheree Kurar, Manoj S Agagarwal, and ShishirShishodia, “chapter 23 Curcumin Drived from Turmeric (Curcuma longa): a Spice for All Seasons, Phytopharmaceuticals in CancerChemoprevetion”, pages 350 - 387, 2005 11 Blanchard C et al (2015), “Neomycin Sulfate Improves the Antimicrobial Activity of Mupirocin-based Antibacterial Ointments”, Antimicrob Agents Chemother, pii: AAC, 02083 - 15 12 Choi Y et al (2004), “Preparation and characterization of acrylic acid-treated bacterial cellulose cation-exchange membrane”, J Chem Technol Biotechnol, 79, 79 - 84 13 Choi, Hyunsung ctv (2006) “Curcumin Inhibits HypoxiaInducible Factor-1 by Degrading Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator: A Mechanism of Tumor Growth Inhibition” Molecular Pharmacology (American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics) 70: 1664 - 1671 14 Czaja W et al (2006), “Microbial cellulose – the natural power to heal wounds”, Biomaterials, 27, 145 - 151 15 Hatcher H., Planalp R., Cho J., Torti F M., Torti S V (tháng 2008) “Curcumin: from ancient medicine to current clinical trials” Cell Mol Life Sci 65 (11): 1631 - 52 16 Huang L et al (2013), “Nano-cellulose 3D-networks as controlledrelease drug carriers”, J Mater Chem B, (23), 2976 - 2984 17 Klemm D et al (2001), “Bacterial synthesized cellulose - artificial bloodvessels for microsurgery”, Prog Polym Sci, 26, 1561 - 1603 18 Kolev, Tsonko M.; ctv (2005) “DFT and Experimental Studies of the Structure and Vibrational Spectra of Curcumin” International Journal of Quantum Chemistry (Wiley Periodicals) 102 (6): 1069 - 1079 19 Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang and Guang Yang Nano - cellulose 3D - networks as controlled releasedrug carriers năm 2013 20 Nguyen TX et al (2014), “Chitosan-coated nano-liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 7149 - 7159 21 Pinto RJB et al (2009), “Antibacterial activity of nanocomposites of silver and bacterial or vegetable cellulosic fibers”, Acta Biomater, 5, 2279 2289 22 Pubmed.org - Influence of piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers – 1998 May; 64 (4): 353 - 23 Ritger P L, Peppas N A (1987) “A simple equation for description of solute release, Fickian and non- Fickian from release from non-swellable devices in the from of slabs, spheres, cylinders or dics”, Journal of Controlled Release, (1), 23 - 26 24 Shaker D S, EL-Leithy E S, Ghorab M K, et al (2010), “Optimization and characterization of diclofenac sodium microsphes prepared by a modified coacervation method” , Drug discoveries & therapeutics, (3), 208 - 216 25 Wei B et al (2011), “Preparation and evaluation of a kind of bacterial cellulose dry films with antibacterial properties”, Carbohydr Polym , 84, 533 - 538 26 Wippermann, J., Schumann, D., Klemm, D., Kosmehl, H., Salehi Gelani, S., & Wahlers, T 2009 Preliminary Results of Small Arterial Substitute Performed with a New Cylindrical Biomaterial Composed of Bacterial Cellulose European Journal of Vascular and Endovascular Surgery 37(5): 592 - 596 ... tài: Nghiên cứu khả giải phóng thuốc curcumin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn nhằm tạo hệ thống làm chậm q trình giải phóng thuốc Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu khả giải phóng. .. phóng thuốc curcumin màng cellulose vi khuẩn (BC) lên men từ môi trường chuẩn nhằm tạo hệ thống giải phóng thuốc kéo dài Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Khả giải phóng thuốc curcumin. .. Trường ĐHSP Hà Nội 2; Vi n Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng Trường ĐHSP Hà Nội Nội dung nghiên cứu - Tạo thu màng BC lên men từ môi trường chuẩn - Nạp curcumin vào màng BC - Thử nghiệm khả giải phóng