Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc cimetidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ===== = PHẠM THỊ THỦY NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CIMETIDIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MƠI TRƯỜNG CHUẨN KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật học HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng trân trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn cô giáo ThS Ngô Thị Hải Yến, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn tới thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN thầy cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Một lần xin cảm ơn giúp đỡ thầy cơ, cảm ơn gia đình tồn thể bạn, người thân, ln bên động viên, giúp đỡ khích lệ tơi hồn thành luận văn Mặc dù tơi có nhiều cố gắng để hồn thành khóa luận cách hoàn chỉnh Tuy nhiên buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên tránh khỏi thiếu sót định mà thân chưa thấy Tơi mong góp ý q thầy để khóa luận hồn chỉnh Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Phạm Thị Thủy LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận tơi thực hướng dẫn ThS Ngô Thị Hải Yến Kết nghiên cứu không chép không trùng với khóa luận Những trích dẫn, kết nghiên cứu có khóa luận lấy từ cơng bố thức có ghi rõ ràng Nếu sai tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước hội đồng bảo vệ Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2017 Sinh viên Phạm Thị Thủy DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A xylinum Acetobacter xylinum CVK Cellulose vi khuẩn CVK – CM Màng Cellulose vi khuẩn hấp thụ thuốc Cimetidin CM Cimetidin cs cộng ĐHSP Đại học Sư phạm FDA Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ OD Mật độ quang phổ Nxb Nhà xuất 10 rpm Tốc độ quay 100 vòng/phút DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo màng CVK 14 Bảng 2.2 Giá trị mật độ quang (OD) dung dịch CM nồng độ (mg/ml) khác (n = 3) 17 Bảng 2.3 Môi trường đệm PBS với pH pH 12 19 Bảng 3.1 Kết thu màng CVK tươi 23 Bảng 3.2 Tỉ lệ hấp thụ thuốc CM vào màng CVK (n = 3) 27 Bảng 3.3 Giá trị OD (y) tương ứng với nồng độ CM độ dày màng, môi trường pH thời điểm khác giải phóng 28 từ màng CVK – CM (n = 3) 28 Bảng 3.4 Tỉ lệ giải phóng thuốc CM từ màng CVK – CM độ dày, thời gian môi trường pH khác (n = 3) 30 Bảng 3.5 Hệ số tương quan R , tốc độ giải phóng thuốc (k) trị số mũ giải phóng (n) mơi trường pH khác (n = 3) 32 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo Cimetidin Hình 2.2 Sơ đồ bước thực đề tài 13 Hình 2.3 Phương trình đường chuẩn CM 18 Hình 3.1 Màng CVK lên men từ môi trường cao nấm men 22 Hình 3.2 Màng CVK thơ thu sau ngày 23 Hình 3.3 Các quy trình xử lí màng CVK 25 Hình 3.4 Màng VC sau tinh chế 26 Hình 3.5 Khả giải phóng thuốc CM màng CVK- CM độ dày, thời gian môi trường pH khác 29 Hình 3.6 Tỉ lệ giải phóng thuốc CM màng CVK- CM độ dày, thời gian môi trường pH khác 30 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình thu nhận màng CVK 15 Sơ đồ 3.1: Quy trình tinh chế màng CVK 24 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 5.1 Ý nghĩa khoa học 5.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Cellulose vi khuẩn (CVK) 1.1.1 Đặc điểm A xylinum 1.1.2 Đặc điểm cấu trúc CVK 1.1.3 Đặc tính màng CVK 1.1.4 Chức sinh lý CVK tạo A xylinum 1.1.5 Môi trường nuôi cấy A xylinum nhằm thu màng CVK 1.2 Tổng quan thuốc Cimetidin 1.2.1 Công thức 1.2.2 Tính chất lí hóa 1.2.3 Tác dụng Cimetidin 1.2.4 Đặc điểm dược động học 1.2.5 Dược lực học Cimetidin 1.2.6 Tác dụng phụ Cimetidin 1.3 Tình hình nghiên cứu giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình nghiên cứu màng CVK 1.3.1.1 Tình hình nghiên cứu màng CVK Việt Nam 1.3.1.2 Tình hình nghiên màng CVK giới 10 1.3.2 Tình hình nghiên cứu thuốc CM 10 1.3.2.1 Tình hình nghiên cứu thuốc CM Việt Nam 10 1.3.2.2 Tình hình nghiên cứu thuốc CM giới 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Vật liệu nghiên cứu 12 2.1.1 Giống vi khuẩn 12 2.1.2 Nguyên liệu - hóa chất 12 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 12 2.1.3.1 Thiết bị 12 2.1.3.2 Dụng cụ 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Môi trường lên men thu màng CVK 14 2.3.2 Xây dựng đường chuẩn CM HCl 0.1N 17 2.3.3 Hấp thụ CM 18 2.3.4 Chuẩn bị đệm 19 2.3.5 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống thiết kế 19 2.3.6 Đánh giá động học giải phóng thuốc từ màng CVK 20 2.3.7 Phương pháp xử lý thống kê 21 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Tạo màng CVK A.xylinum môi trường cao nấm men 22 3.2 Thu màng CVK thô môi trường cao nấm nem 22 3.3 Tinh chế màng CVK 23 3.4 Khả hấp thụ CM màng CVK 26 3.5 Lượng thuốc CM giải phóng khỏi màng CVK – CM 27 3.6 Phân tích động dược học giải phóng CM 31 Kết luận: 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 1.1 Kết luận 34 1.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 Bảng 3.3 Giá trị OD (y) tương ứng với nồng độ CM độ dày màng, môi trường pH thời điểm khác giải phóng từ màng CVK – CM (n = 3) Thời gian Độ pH dày màng 0,3 cm pH 0,5 cm 0,3 cm pH 12 0,5 cm 0,5 giờ giờ 12 24 0,0166 0,0166 0,0167 0,0168 0,0171 0,017 0,0169 ±0,00002 ± 0,00012 ±0,00002 ± 0,00003 ± 0,00014 ± 0,00002 ± 0,00003 0,0165 0,0165 0.0166 0,0167 0,0169 0,0168 0,0166 ± 0,00015 ±0,0001 ± 0,00014 ± 0,0001 ± 0,0004 ± 0,0001 ± 0,00006 0,0163 0,0164 0,0164 0,0165 0,0166 0,0165 0,0164 ±0,00003 ±0,00002 ±0,00005 ±0,00002 ±0,00012 ±0,00002 ±0,00001 0,0162 0,0163 0,0163 0,0163 0,0164 0,0163 0,0162 ± 0,00001 ± 0,00003 ± 0,00007 ± 0,00017 ±0,00002 ± 0,00005 ± 0,00002 Dựa vào OD (y) trung bình bảng 3.3, sử dụng phần mềm Excel 2010 để vẽ đồ thị khả giải phóng thuốc CM màng VC – CM độ dày, thời gian môi trường pH khác thể hình 3.5 0.0172 Mật độ quang phổ (nm) 0.0170 0.0168 0.0166 pH 0,3 cm 0.0164 pH 0,5 cm 0.0162 pH 12 0,3 cm 0.0160 pH 12 0,5 cm 0.0158 0.0156 0.5 Thời gian (giờ) 12 24 Hình 3.5 Khả giải phóng thuốc CM màng CVK- CM độ dày, thời gian môi trường pH khác Nhận xét: Qua bảng 3.4 hình 3.5 thấy: Ở môi trường đệm pH giá trị OD (y) trung bình thuốc CM giải phóng từ màng CVK – CM tăng dần đến thời điểm định dừng lại không tăng với độ dày màng Ở mơi trường pH khác giá trị OD (y) trung bình đạt cực đại thời điểm Ở môi trường pH = môi trường pH = 12 giá trị OD (y) trung bình thuốc CM giải phóng từ màng CVK – CM đạt cực đại Giá trị OD (y) trung bình mơi trường pH = cao Từ giá trị OD (y) trung bình bảng 3.3 thuốc CM tiến hành giải phóng từ màng CVK – CM, thay vào phương trình (1) tính nồng độ CM tương ứng với khoảng thời gian Thay giá trị nồng độ CM vừa tnh vào công thức (4) ta xác định tỉ lệ giải phóng thuốc CM màng CVK – CM độ dày, thời gian môi trường pH khác bảng 3.4 Bảng 3.4 Tỉ lệ giải phóng thuốc CM từ màng CVK – CM độ dày, thời gian môi trường pH khác (n = 3) Thời gian pH Độ dày màng 0,3 cm 0,5 cm 0,3 cm 12 0,5 cm 0,5 giờ giờ 12 24 47,2 52,38 58,31 64,42 80,32 79,10 78,18 ±0,564 ±0,336 ±0,369 ±0,348 ±0,369 ±0,227 ±0,336 46,52 51,74 57,11 63,83 76,84 75,06 73,35 ±0,330 ±0,35 ±0,369 ±0,364 ±0,356 ±0,409 ±0,429 36,23 41,47 45,96 50,66 58,09 57,03 56,28 ±0,369 ±0,381 ±0,337 ±0,347 ±0,369 ±0,391 ±0,414 35,20 40,95 44,90 48,94 54,30 52,95 51,36 ±0,405 ±0,380 ±0,404 ±0,417 ±0,369 ±0,393 ±0,380 Dựa vào tỉ lệ giải phóng thuốc trung bình bảng 3.5, sử dụng phần mềm Excel 2010 để vẽ đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc CM màng VC – CM độ dày, thời gian môi trường pH khác thể hình 3.6 Tỉ lệ thuốc CM giải phóng (%) 90 80 70 60 50 pH 0,3 cm 40 pH 0,5 cm 30 pH 12 0,3 cm 20 pH 12 0,5 cm 10 0.5 12 Thời gian (giờ) 24 Hình 3.6 Tỉ lệ giải phóng thuốc CM màng CVK- CM độ dày, thời gian môi trường pH khác Nhận xét: Qua bảng 3.5 thấy: Tại pH = 2, tỉ lệ thuốc CM giải phóng từ màng CVK – CM cao Tóm lại: Màng CVK - CM có độ dày 0,3cm có khả giải phóng thuốc CM cao màng CVK - CM có độ dày 0,5cm mơi trường pH = Khi sử dụng màng CVK làm hệ thống hấp thụ giải phóng thuốc mơi trường pH khác thấy tỉ lệ giải phóng thuốc mơi trường pH = lớn mơi trường pH = 12 Điều dễ dàng giải thích CM tan tốt mơi trường axit (dịch dày) Khi khơng có màng CVK làm hệ thống vận chuyển phân phối thuốc sinh khả dụng thuốc CM 56 – 68% nửa đời thải trừ thuốc Tuy nhiên sử dụng màng CVK làm hệ thống vận chuyển phân phối thuốc, sinh khả dụng thuốc CM lên đến 80,32% ± 0,369 thời gian giải phóng kéo dài tới Như dùng màng CVK làm hệ thống giải phóng thuốc CM qua đường uống, giúp thuốc CM giải phóng kéo dài, tăng sinh khả dụng 3.6 Phân tích động dược học giải phóng CM Từ tỉ lệ thuốc CM giải phóng màng CVK – CM (bảng 3.5), sử dụng phần mềm DDSolver với mô hình First order, Higuchi, Hixson – Crowel, Korsmeyer – Peppas làm mơ hình động học để phân tch dược động học giải phóng CM ta thu kết bảng 3.5 Bảng 3.5 Hệ số tương quan R , tốc độ giải phóng thuốc (k) trị số mũ giải phóng (n) mơi trường pH khác (n = 3) pH Mẫu CVK First order Higuchi Hixson – Crowell Korsmeyer – Peppas R2 k1 R2 kH R2 kHC R2 kKP n 0,3 - 0,67 0,486 - 0,79 22,9 - 0,32 0,057 0,9 53,78 0,142 cm ±0,077 0,5 - 0,6 ± 0,005 ± 0,205 ±0,014 ±0,0031 ±0,0003 ±0,002 ±0,149 ± 0,001 cm 0,125 - 0,4 22,0 ± 0,067 ± 0,0032 ± 0,019 ±0,102 0,117 - 0,50 0,033 0,71 52,31 0,136 ± 0,073 ± 0,0003 ± 0,002 ± 0,25 ± 0,0002 16,98 - 0,58 0,032 cm ±0,363 ± 0,0017 ± 0,205 ±0,062 ±0,425 ±0,001 ±0,004 ±0,006 ±0,0017 0,5 - 0,61 15,83 - 0,81 0,021 cm ±0,360 ± 0,005 ±0,0002 ±0,009 ±0,402 0,3 -0,58 - 0,7 0,81 42,1 0,117 12 0,069 - 0,42 0,78 40,64 0,104 ±0,0015 ±0,009 ±0,064 ±0,0009 Như thể nghiên cứu trước Jayswal cs [16], mơ hình First order đại diện cho tỉ lệ giải phóng thuốc phụ thuộc vào nồng độ thuốc Mơ hình Higuchi giả định việc giải phóng thuốc chế khuếch tán Mơ hình Hixson – Crowel đại diện cho tỉ lệ giải phóng thuốc phụ thuộc vào mơi trường đệm Mơ hình Krosmeyer – Peppas đưa nhìn tồn diện tỉ lệ giải phóng thuốc trương nở vật liệu hấp thụ giải phóng thuốc, độ trương nở vật liệu cao tốc độ giải phóng thuốc mạnh ngược lại [25] Khi thuốc CM giải phóng dung dịch đệm pH = khơng tn theo mơ hình First order lại tn theo mơ hình Korsmeyer – Peppas (R > 71%) Mặt khác, thuốc CM giải phóng dung dịch đệm pH = 12, khơng phù hợp với mơ hình Higuchi lại phù hợp với mơ hình Korsmeyer – Peppas (R > 35%) Những kết cho thấy khả ứng dụng mơ hình Korsmeyer – Peppas cho trương nở sợi cellulose màng CVK, sợi cellulose trương nở nhiều, tạo nhiều khoảng không gian rộng thuốc CM khuếch tán nhanh từ màng CVK – CM môi trường đệm Trong hệ thống khuếch tán Fickian [40], n < 0,43 giải phóng thuốc xảy theo chế khuếch tán, 0,43 < n < 0,85 khơng có giải phóng thuốc xảy [24,26], n > 0,85 có ăn mòn vật liệu (màng CVK) Các giá trị n thu từ bảng 3.6 n < 0,43 giải thích giải phóng thuốc chế khuếch tán thuốc CM từ màng CVK – CM mơi trường đệm Tóm lại: Sự trương nở sợi cellulose màng CVK có ảnh hưởng phần đến khuếch tán thuốc CM ngược lại Như vậy, chế giải phóng thuốc CM bị ảnh hưởng môi trường đệm, tnh chất màng CVK nồng độ thuốc CM KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.1 Kết luận Từ kết thu từ khóa luận này, đưa số kết luận sau: Tạo màng CVK độ dày 0,3cm 0,5cm, cảm quan thấy màng có độ tinh khiết cao, chất dẻo dai, khả thấm hút tốt Màng CVK hấp thụ thuốc độ dày khác giải phóng mơi trường đệm pH =2, pH = 12 thời điểm khác cho thấy màng 0,3cm có khả giải phóng cao màng 0,5cm Đệm pH = mơi trường tốt để giải phóng thuốc tốt giúp kéo dài thời gian giải phóng thuốc, tăng sinh khả dụng thuốc 1.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu khả vận tải phân phối thuốc CM màng CVK tạo chủng A xylinum từ loại môi trường khác Tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ giải phóng loại thuốc khác màng CVK nhằm tăng sinh khả dụng kéo dài thời gian giải phóng loại thuốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Hà Nguyễn Phương Anh, Trần Hậu Khang, Nguyễn Duy Hưng (2014), “Đánh giá hiệu Cimetidin phòng tái phát bệnh sùi mào gà Bệnh viện Da liễu trung ương”, Tạp chí Da liễu học Việt Nam, 16, – 10 Đặng Thị Hồng Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính Sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạp màng sinh học (CVK) Luận án thạc sỹ Sinh học Đại học Sư phạm Hà Nội, 2007 Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí Dược học số 361/2006, trang 18 - 20 Nguyễn Thị Nguyệt Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial Cellulose làm mặt nạ dưỡng da Luận án thạc sỹ sinh học Đại học Sư phạm Hà Nội, 2008 Đinh Thị Kim Nhung Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men axetic theo phương pháp chìm Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, 1996 Đinh Thị Kim Nhung (1998), “Tối ưu hóa thành phần mơi trường dinh dưỡng cho Acetobacter xylinum phương pháp quy hoạch thực nghiệm” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 36(1), 10 – 12 Thuốc kháng thụ thể histamin H2 (2012) - Bộ y tế viện kiểm nghiệm trung ương Tài liệu tiếng Anh American Chemical Society (2001), “Tagamet: Discovery of histamine H2– receptor Antagonists”, National Historic Chemical Landmarks Andrew S., Gugle R (1983), “Clinical pharmacokinetics of Cimetidin”, Clin Pharmakokinet, 8(6), 463 – 95 10 Arisawa T., Shibata T et at (2006), “Effects of sucralfate, Cimetidin and rabeprazole on mucosalhydroxyproline content in healing of ethanolhclinduced gastric lesions”, Pharmacol Physion, 33(7), 628 – 32 ’ 11 Bergey H, John G Holt (1992) Bergey s manunal of dererminativa bacteriology Wolters Kluwer health, 6, 71 – 84 12 Brown E (2007), “Bacterial cellulose/Themoplastic polymer nanocomposites”, Master of sience in chemical engineerin, Washington state university 13 Fukuda M, et al (2008), “Cimetidin inhibits salivary gland tumor cell adhesion to neural cells and induces apoptosis by blocking NCAM expression”, Cancer, 10(2407), – 376 14 Franco I (2000), “Oral Cimetidin for the management of genital and perigenital warts in children”, J Urol., 164, 1074 – 1075 15 Huang L., Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang and Guang Yang (2013), “Nano- cellulose 3D- networks as controlledrelease drug carriers”, Journal of Materials Chemistry B, 1, 2976 – 2984 16 Jayswal B D., Yadav V T., Patel K N., Patel B A (2012), “ Fomulation and evaluation of floating in situ gel based gastro rententive drug delivery of Cimetidin”, International journal for pharmaceutical research scholars, 38(1), 223-228 17 Molinder HK (1994), “The development of Cimetidin: 1964 – 1976, A.human story”, Jclin Gastroenterol, 19 (3): 248 – 54 18 Nguyen T X et al (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 7149 – 7159 19 Pedersen P U, Miller R (1980), “Pharmacokinetic and bioavailability of Cimetidin in humans”, J Pharm Sci., 69, 394 – 398 20 Ritger P L., Peppas N A., (1987), “A simple equation for description of solute release Fickian and non – Fickian release from non – swellable devices in the from of slabs, spheres, cylinders or discs”, 5(1), 23 – 26 21 Sabesin S M (1993), “Safety issues relating to long – term treatment with histamine H2 – receptor antagonists”, Aliment Pharmacol Ther 2, 35 – 40 22 Saltissi A et al (1981), “The effects of chronic oral Cimetidin therapy on the cardiovascular system in man”, Br J Clin Pharmac, 11, 497 – 503 23 Scheinfeld (2003), “Cimetidin: a review of the recent developments and reports in cutaneous medicine”, Dermatol Online J (2), – 80 24 Sivelle P.C., Underwood A, H, Jelly J A (1982), “The effects of histamine H2 receptor antagonists on androgen action in vivo and dihydrotestosterone binding to the rat prostate androgen receptor in vitro”, Biochemical Pharmacology, 31(5), 677 – 684 25 Srivastava A K et al (2005), “Floating microspheres of Cimetidin: Formulation, characterization and in vitro evaluation”, Actapharm, 55, 277- 285 26 Stephen J Winters, Judy Lee, Philip Troen(1979), “Competition of the histamine H2 antagonist Cimetidin for androgen binding sites in men”, American Journal of Andrology, 1, 111 – 114 27 Trovatti E et al (2012), “Bacterial cellulose membranes applied in topical and transdermal delivery of lidocaine hydrochloride and ibuprofen: in vitro diffusion studies”, Int J Pharm, 435(1), 83-87 ... nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: khả giải phóng thuốc Cimetidin dựa màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn - Vật liệu nghiên cứu: màng CVK lên men từ môi trường chuẩn - Phạm vi nghiên. .. cứu khả giải phóng thuốc cimetidin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường chuẩn Mục đích nghiên cứu Thiết kế chế tạo hệ thống giải phóng thuốc CM dựa màng CVK nhằm kéo dài thời gian giải. .. Trong đó, màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường cao nấm men sử dụng phổ biến giới có đặc tính bền màng màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường khác 1.2 Tổng quan thuốc Cimetidin