Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc cimetidin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo (2017)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ===== = NGUYỄN THỊ MAI KHUYÊN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG THUỐC CIMETIDIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MƠI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học ThS Ngô Thị Hải Yến HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình hồn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài “Nghiên cứu khả giải phóng thuốc Cimetidin màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”, nhận hướng dẫn, giúp đỡ quý báu thầy cô, anh chị bạn Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng - trường Đại học Sư phạm Hà Nội Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: ThS Ngô Thị Hải Yến - người hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ suốt q trình thực khóa luận Tơi cảm ơn chân thành tới thầy cô làm việc Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, thầy cô bạn sinh viên học tập làm việc Bộ môn Sinh lý người động vật, trường Đại học Sư phạm Hà Nội giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi q trình hồn thành đề tài nghiên cứu Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè quan tâm, động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 04 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Mai Khuyên LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tính trung thực khóa luận, tơi xin cam đoan: Khóa luận “Nghiên cứu khả giải phóng thuốc Cimetidin màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo’’ cơng trình nghiên cứu cá nhân tôi, thực hướng dẫn ThS Ngô Thị Hải Yến Đề tài chưa cơng bố đâu hồn tồn khơng trùng với cơng trình nghiên cứu tác giả khác Hà Nội, tháng 04 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Mai Khuyên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A xylinum Acetobacter xylinum CVK CM CVK - CM ĐHSP FDA Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ Nxb Nhà xuất OD Mật độ quang phổ rpm Tốc độ quay 100 vòng/phút 10 ThS Thạc sĩ Cellulose vi khuẩn Cimetidin Màng cellulose vi khuẩn hấp thụ thuốc Cimetidin Đại học Sư phạm MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Vật liệu phạm vi nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một vài đặc điểm Cellulose vi khuẩn 1.1.1 Vi khuẩn sản sinh CVK 1.1.2 Môi trường nuôi cấy A xylinum thu màng CVK .4 1.1.3 Màng CVK vi khuẩn A xylinum 1.2 Tổng quan thuốc Cimetidin 1.2.1 Công thức .7 1.2.2 Tính chất lí hóa 1.2.3 Tác dụng CM 1.2.4 Đặc điểm dược động học .8 1.2.5 Dược lực học CM 1.2.6 Tác dụng phụ CM 10 1.3 Giới thiệu tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nước 11 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng CVK 11 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng thuốc CM 12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Vật liệu nghiên cứu 14 2.1.1 Giống vi khuẩn 14 2.1.2 Nguyên liệu - hóa chất .14 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 14 2.1.4 Môi trường lên men thu màng CVK 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo 15 2.2.2 Phương pháp xử lý màng CVK trước hấp thụ thuốc 17 2.2.3 Phương pháp xây dựng đường chuẩn CM 18 2.2.4 Phương pháp chế tạo màng CVK - CM 19 2.2.5 Phương pháp pha môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline) - PBS 1X 20 2.2.6 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng màng CVK CM 20 2.2.7 Phương pháp phân tích động học giải phóng CM 21 2.2.8 Phương pháp xử lý thống kê 22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Tạo màng CVK A xylinum môi trường nước vo gạo 23 3.2 Thu màng CVK thô từ môi trường 23 3.3 Tinh chế màng CVK 24 3.4 Thu màng CVK - CM 26 3.5 Lượng thuốc CM giải phóng khỏi màng CVK - CM 27 3.6 Phân tích động dược học giải phóng CM 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng nước vo gạo Bảng 1.2 Các ứng dụng CVK Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo màng CVK 15 Sơ đồ 2.1: Quy trình tạo màng CVK thơ 16 Sơ đồ 2.2: Quy trình ni cấy thu nhận CVK 17 Bảng 2.2 Giá trị OD dung dịch CM nồng độ (mg/ml) khác (n = 3) 18 Bảng 2.3 Môi trường đệm PBS 20 Bảng 3.1 Khối lượng CM hấp thụ vào màng CVK độ dày khác (n = 3) 26 Bảng 3.2 Giá trị OD (y) tương ứng với nồng độ CM độ dày màng, môi trường pH thời điểm khác giải phóng từ màng CVK - CM (n = 3) 27 Bảng 3.3 Tỉ lệ giải phóng thuốc CM từ màng CVK - CM độ dày, thời gian môi trường pH khác (n = 3) 29 Bảng 3.4 Hệ số tương quan (R2), tốc độ giải phóng thuốc (k) trị số mũ giải phóng (n) mơi trường pH khác 31 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn CM 19 Hình 3.1 Hình ảnh màng CVK nuôi cấy môi trường nước vo gạo 23 Hình 3.2 Thu màng CVK thơ khoảng thời gian khác 24 Hình 3.3 Quy trình xử lý màng CVK 25 Hình 3.4 Mật độ quang phổ màng CVK - CM độ dày, thời gian môi trường pH khác 28 Hình 3.5 Tỉ lệ giải phóng CM từ màng CVK - CM độ dày, thời gian môi trường pH khác 29 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Thuốc Cimetidin (viết tắt CM) chất đối kháng receptor histamin H2, thuốc khám phá cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu thuốc hợp lí Tác dụng chủ yếu thuốc ức chế tế bào thành dày tiết acid [9] Cimetidin sau trải qua hàng loạt nghiên cứu thử nghiệm báo cáo chất ức chế phát triển khối u tuyến nội tiết, ung thư đại trực tràng, điều trị tổn thương dày cấp tính [16],… thành công thị trường với tên Tagamet, sinh khả dụng thuốc thấp khoảng 35% làm ngăn cản ứng dụng điều trị khoảng thời gian dài [9] Tuy nhiên trình dùng thuốc, người bệnh gặp tác dụng phụ khơng mong muốn như: tiêu chảy, đau đầu, chóng mặt, ngủ gà, lú lẫn, trầm cảm, rối loạn chức gan, viêm tụy xảy ra,… Các phản ứng khỏi ngừng thuốc Trong tự nhiên có số vi khuẩn có khả sinh màng cellulose, đặc biệt chủng Acetobacter xylinum Khi nuôi cấy vi khuẩn môi trường chứa glucose, glycerol số nguồn cacbon hữu khác chúng có khả hình thành bề mặt lớp màng cellulose sinh học khiết gọi màng sinh học cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn (viết tắt CVK) có cấu trúc đặc tính giống với cellulose thực vật (gồm phân tử glucose liên kết với liên kết β-1,4 glucorit), khác với cellulose thực vật chỗ: không chứa hợp chất cao phân tử ligin, hemicellulose, peptin sáp nến chúng có đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền [3] Trên giới, màng CVK ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho q trình xử lí nước, dùng làm chất màng CVK - CM độ dày, thời gian môi trường pH khác bảng 3.3 Bảng 3.3 Tỉ lệ giải phóng thuốc CM từ màng CVK - CM độ dày, thời gian môi trường pH khác (n = 3) Thời pH gian Độ dày 0.3cm 0.5cm 12 0.3cm 0.5cm Tỉ lệ thuốc CM giải phóng từ màng CVK - CM (%) 0.5 giờ giờ 12 24 49.51 ± 54.07 ± 59.78 ± 64.59 ± 72.67 ± 72.04 ± 71.69 ± 0.53 48.57 ± 0.379 52.07 ± 0.328 56.78 ± 0.189 61.60 ± 0.475 70.04 ± 0.301 67.65 ± 0.311 66.08 ± 0.328 37.08 ± 0.189 40.21 ± 0.379 44.76 ± 0.311 51.25 ± 0.485 50.74 ± 0.311 49.58 ± 0.475 49.11 ± 0.532 0.323 0.440 0.211 0.326 0.323 0.532 36.69 ± 39.43 ± 42.73 ± 49.30 ± 44.38 ± 43.81 ± 43.09 ± 0.301 0.311 0.532 0.485 0.532 0.440 0.301 Tỉ lệ giải phóng thuốc CM (%) 80 70 60 50 pH=2 (0.3cm) 40 pH=2 (0.5cm) 30 pH=12 (0.3cm) 20 pH=12 (0.5cm) 10 0.5 12 24 Thời gian (h) Hình 3.5 Tỉ lệ giải phóng CM từ màng CVK - CM độ dày, thời gian môi trường pH khác Nhận xét: Qua bảng 3.3 hình 3.4 thấy: Tại pH = 2, tỉ lệ thuốc CM giải phóng từ màng CVK - CM cao Tại pH = 2, tỉ lệ thuốc CM màng đạt cực đại giờ, màng 0.3cm đạt tỉ lệ giải phóng 72.67% ± 0.475, màng 0.5cm đạt tỉ lệ 70.04% ± 0.485 So sánh tỉ lệ giải phóng thuốc CM trung bình độ dày màng 0.3cm 0.5cm môi trường pH = hàm t - Test: Two Sample Assuming Unequal Variances, thu kết P = 0.0084 (T 35%) so với mô hình khác Kết trùng hợp với nghiên cứu trước đây, cho thấy khả ứng dụng mơ hình Korsmeyer - Peppas cho nghiên cứu khuếch tán trương nở vật liệu mang thuốc (màng CVK) Trong hệ thống khuếch tán Fickian [22, 26], n < 0.43 giải phóng thuốc xảy theo chế khuếch tán qua vật liệu, 0.43 < n < 0.85 khơng có giải phóng thuốc xảy ra, n > 0.85 có ăn mòn vật liệu Các giá trị n thu từ bảng 3.5 n < 0.43 chứng tỏ có giải phóng thuốc chế khuếch tán thuốc từ màng CVK - CM môi trường đệm khơng có ăn mòn vật liệu Tóm lại: Việc giải phóng thuốc màng 0.3cm lớn màng 0.5cm giải thích trương nở màng CVK môi trường pH khác Ở mơi trường pH = có trương nở nhiều dẫn đến tạo khe hở nhiều hơn, liên kết màng trở nên lỏng lẻo hơn, lượng CM giải phóng qua sợi cellulose nhiều nhanh Màng CVK cấu tạo polime cao phân tử bền nên khơng có ăn mòn xảy q trình giải phóng thuốc Sự trương nở sợi cellulose màng CVK có ảnh hưởng phần đến khuếch tán thuốc CM ngược lại Như vậy, tỉ lệ giải phóng thuốc CM phụ thuộc vào môi trường đệm pH khác trương nở CVK 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 34 Từ kết thu từ khóa luận này, chúng tơi đưa số kết luận nhưsau: Tạo màng CVK độ dày 0.3cm 0.5cm, cảm quan thấy màng có độ tinh khiết cao, chất dẻo dai, khả thấm hút tốt Màng CVK hấp thụ thuốc độ dày khác giải phóng môi trường đệm pH = 2, pH = 12 thời điểm khác cho thấy màng 0.3cm có khả giải phóng cao màng 0.5cm Đệm pH = mơi trường tốt để giải phóng thuốc giúp kéo dài thời gian giải phóng, tăng sinh khả dụng thuốc Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu khả giải thuốc CM màng CVK tạo chủng A xylinum từ loại môi trường khác Tiếp tục nghiên cứu khả giải phóng loại thuốc khác màng CVK nhằm tăng sinh khả dụng kéo dài thời gian giải phóng loại thuốc 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 36 [1] Hà Nguyễn Phương Anh, Trần Hậu Khang, Nguyễn Duy Hưng (2014), “Đánh giá hiệu Cimetidine phòng tái phát bệnh sùi mào gà Bệnh viện Da liễu trung ương”, Tạp chí Da liễu học Việt Nam, số 16, trang - 10 [2] Trịnh Hữu Bằng, Đỗ Công Quỳnh (2001), sinh lý học người động vật, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội, trang 173, 184 - 187 [3] Đặng Thị Hồng (2007), Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học vi khuẩn Acetobacter xylinum chế tạp màng sinh học (CVK), Luận án thạc sỹ Sinh học ĐHSP Hà Nội [4] Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu đặc tính màng cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng, Tạp chí Dược học, số (361/2006), trang 18 - 20 [5] Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lí học thực vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội [6] Nguyễn Thị Nguyệt (2008), Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da, Luận án thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội [7] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng” Tạp trí khoa học công nghệ 50 (4), 453 - 462 [8] Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylium, đề tài cấp bộ, Bộ Y tế [9] Thuốc kháng thụ thể histamin H2 - y tế viện kiểm nghiệm trung ương 37 Tài liệu Tiếng anh [10] Almeida, I.F., et al (2013), “Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin conpatibility study” Eur J PharmBiopharm, 24(3), 445 - 449 [11] Amin MCIM, Ahmad N, et al (2012), “Bacterial cellulose film coating as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties”, Sain Malaysiana, 41(5), pp 561 - [12] Andrew S., Gugle R (1983), “Clinical pharmacokinetics of Cimetidine”, Clin Pharmakokinet, 8(6), 463 - 95 [13] Arisawa T, Shibata T, et at.(2006), “Effects of sucralfate, Cimetidine and rabeprazole on mucosalhydroxyproline content in healing of ethanol-hcl- induced gastric lesions”, Pharmacol Physion, 33(7), 628-32 [14] Brown E (2007), Bacterial cellulose Themoplastic polymer nanocomposites, Master of sience in chemical engineering, Washington state university [15] Franco I (2000), “Oral Cimetidine for the management of genital and perigenital warts in children”, J Urol., 164, 1074 - 1075 [16] Fukuda M1, et at (2008), “Cimetidine inhibits salivary gland tumor cell adhesion to neural cells and induces apoptosis by blocking NCAM expression” Cancer, 10(2407) 8-376 [17] Jayswal B.D., Yadav V.T., Patel K.N., Patel B.A (2012), “ Fomulation and evaluation of floating in situ gel based gastro rententive drug delivery of Cimetidine”, International journal for pharmaceutical research scholars, 38(1), 223-228 [18] Klemm D et al (2001), “Bacterial synthesized cellulose - artificial blood vessels for microsurgery”, Prog Polym Sci, 26, pp 1561 - 1603 38 [19] Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang and Guang Yang (2013), “Nano- cellulose 3D- networks as controlled- release drug carriers”, Journal of Materia1s Chemistry B, 1, 2976 - 2984 [20] Lina Fu, Yue Zhang, Chao Li, Zhihong Wu, Qi Zhuo, Xia Huang, Guixing Qiu, Ping Zhou and Guang Yang (2012), skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermantation method [21] Pedersen P U, Miller R (1980), “Pharmacokinetic and bioavailability of Cimetidine in humans”, J Pharm Sci., 69, 394 - 398 [22] Ritger P L., Peppas N A (1987), “A simple equation for description of solute release, Fickian and non - Fickian release from non - swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs”, Journal of Controlled Release, (1): 23 - 36 [23] Sabesin S M (1993), “Safety issues relating to long - term treatment with histamine H2 - receptor antagonists”, Aliment Pharmacol Ther 2, 35 - 40 [24] Saltissi A et al (1981), “The effects of chronic oral Cimetidine therapy on the cardiovascular system in man”, Br J Clin Pharmac, 11, 497 - 503 [25] Scheinfeld (2003), “Cimetidine: a review of the recent developments and reports in cutaneous medicine”, Dermatol Online J (2), - 80 [26] Shaker D S., El - Leithy E S., Ghorab M K., et al (2010), “Optimization and characterization of diclofenac sodium microspheres prepared by a modified coacervation method”, Drug discoveries & therapeutics, (3): 208 - 216 [27] Sivelle P.C., Underwood A, H, Jelly J A (1982), “The effects of histamine H2 receptor antagonists on androgen action in vivo 39 and dihydrotestosterone binding to the rat prostate androgen receptor in vitro”, Biochemical Pharmacology, 31(5), 677 - 684 40 [28] Srivastava A K et al (2005), “Floating microspheres of Cimetidine: Formulation, characterization and in vitro evaluation”, Actapharm, 55, 277- 285 [29] Stephen J Winters, Judy Lee, Philip Troen(1979), “Competition of the histamine H2 antagonist Cimetidine for androgen binding sites in men”, American Journal of Andrology, 1, 111 - 114 [30] Thanh Xuan Nguyen, et al (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of Berberin hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 7149 - 7159 [31] Thesis Homles, Bacterial cellulose, Department of Chemical and process Engineering University of Canterbury Christchurch, New Zealand, 2004, p - 65 [32] White, K K, et al (1989), “Changes in equine carpal joint synovial fluid in response to the injection of two local anesthetic agents”, The Cornell veterinarian, 79 1, pp 25 - 38 [33] Yong Zhang, Meirong Huo, Jianping Zhou, Aifeng Zou, Weize Li, Chengli Yao and Shaofei Xie (2010), “DDSolver: An add - in program for modeling and comparison of drug dissulution profiles”, The AAPS Journal (2010), 263 - 271 41 ... Nghiên cứu khả giải phóng thuốc Cimetidin màng Cellulose vi khuẩn lên men từ mơi trường nước vo gạo Mục đích nghiên cứu Thiết kế chế tạo hệ thống màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo nạp thuốc. .. nghiên cứu với đề tài Nghiên cứu khả giải phóng thuốc Cimetidin màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo , nhận hướng dẫn, giúp đỡ quý báu thầy cô, anh chị bạn Vi n Nghiên cứu. .. trị vi m loét dày người Vật liệu phạm vi nghiên cứu  Vật liệu nghiên cứu: - Màng CVK thu từ môi trường nước vo gạo - Thuốc CM dạng tinh khiết 99,6%  Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả giải phóng