Trong đó tế bào gốc với khả năng tự làm mới thông qua quátrình phân chia và khả năng biệt hóa thành các loại tế bào trong mô và cơquan cụ thể là một phần không thể thiếu trong liệu pháp
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
=======
ĐẶNG THỊ HUYỀN NHUNG
CHUYÊN ĐỀ 3
TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG CẢM ỨNG
(INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL – iPSC)
Chuyên ngành: Mô – Phôi Thai Học
Mã số: 62720102
HÀ NỘI – 2019
Trang 3iPSC : Induced pluripotent stem cell – Tế bào gốc vạn năng cảm ứng
ES : Embryonic stem cells – Tế bào gốc phôi
RT – PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction – Phản ứng
tổng hợp chuỗi phiên mã ngượcRPE : Retinal pigment epithelium – Biểu mô sắc tố võng mạc
Trang 4ĐẶT VẤN ĐỀ 1 ĐẠI CƯƠNG 2
1 Tổng quan về tế bào gốc 21.1 Định nghĩa và đặc tính cơ bản của tế bào gốc 2
1.2 Phân loại tế bào gốc 2
1.3 Các nguồn cung cấp tế bào gốc trưởng thành 3
1.4 Ứng dụng tế bào gốc 4
1.5 Những khó khăn trong ứng dụng tế bào gốc 7
2 Tế bào gốc vạn năng cảm ứng 82.1 Nghiên cứu lần đầu tiên tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng 8
2.2 Lịch sử nghiên cứu và phát triển tế bào gốc vạn năng cảm ứng
11
2.3 Nghiên cứu lần đầu tiên ứng dụng tế bào gốc vạn năng cảm ứng trên người.15
KẾT LUẬN 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 5ĐẶT VẤN ĐỀ
Liệu pháp tế bào là một lĩnh vực mới nổi trong điều trị nhiều chuyênkhoa khác nhau như tim mạch, hô hấp, gan mật, thần kinh… Nhiều nghiêncứu đã chứng minh rằng một loạt các loại tế bào bao gồm tế bào gốc, tế bào
NK, tế bào lympho T có thể được áp dụng một cách phù hợp để điều trị cácbệnh khác nhau Trong đó tế bào gốc với khả năng tự làm mới thông qua quátrình phân chia và khả năng biệt hóa thành các loại tế bào trong mô và cơquan cụ thể là một phần không thể thiếu trong liệu pháp tế bào Nhiều thửnghiệm đã chứng minh hiệu quả của sử dụng tế bào gốc trong điều trị một sốlượng lớn các bệnh [1] Tuy nhiên việc thu thập tế bào gốc với số lượng lớncũng còn nhiều hạn chế đặc biệt là đối với các tế bào gốc có tiềm năng biệthóa lớn như tế bào gốc phôi thì việc thu thập các tế bào gốc còn gặp phảinhiều khó khăn liên quan đến vấn đề đạo đức
Năm 2006, Yamanaka và Takahashi lần đầu tiên giới thiệu về một loại
tế bào gốc được tạo ra từ việc nuôi cấy nguyên bào sợi có bổ sung thêm mộtvài yếu tố và được gọi là tế bào gốc vạn năng cảm ứng (Induced pluripotentstem cell – iPSC) [2] Việc ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng đã mangđến hứa hẹn tuyệt vời cho liệu pháp tế bào đặc biệt là trong y học tái tạo Bởi
vì, các tế bào gốc vạn năng cảm ứng cũng có các đặc điểm của tế bào gốc nhưkhả năng tăng sinh vô hạn, khả năng biệt hóa thành các loại tế bào cụ thể phục
vụ cho mục đích điều trị Bên cạnh đó, các tế bào gốc vạn năng cảm ứng đượctạo ra từ các tế bào trưởng thành của cơ thể nên có nguồn cung cấp không giớihạn và chúng là các tế bào tự thân có thể sử dụng trong cấy ghép mà ít gây longại về khả năng gây đáp ứng miễn dịch Tuy vậy, tính an toàn của các tế bàogốc vạn năng cảm ứng vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng, do đó việc ứngdụng chúng trên lâm sàng còn nhiều hạn chế Chuyên đề này sẽ đề cập đếnlịch sử phát triển nghiên cứu về tế bào gốc vạn năng cảm ứng từ nhữngnghiên cứu đầu tiên của Yamanaka đến ứng dụng lâm sàng đầu tiên của iPS
Trang 6ĐẠI CƯƠNG
1 Tổng quan về tế bào gốc.
1.1 Định nghĩa và đặc tính cơ bản của tế bào gốc.
Tế bào gốc là các tế bào chưa trưởng thành, chưa biệt hóa, có khả năngphân chia và biệt hóa thành các tế bào và mô cụ thể [3]
Tế bào gốc có ba đặc tính cơ bản [4]:
- Bản chất của tế bào gốc là các tế bào chưa biệt hóa
- Tự làm mới: các tế bào gốc có khả năng phân chia để tạo ra các tế bàogốc mới, giữ nguyên được các đặc điểm của tế bào gốc ban đầu
- Biệt hóa: các tế bào gốc có khả năng biệt hóa để tạo thành các dòng tếbào hoặc mô cụ thể
1.2 Phân loại tế bào gốc.
Có nhiều cách phân loại tế bào gốc nhưng chủ yếu sử dụng 2 cách phânloại chính là theo nguồn gốc tế bào và theo tiềm năng biệt hóa của tế bào
Phân loại theo nguồn gốc tế bào, tế bào gốc được chia làm hai loại là tếbào gốc phôi và tế bào gốc trưởng thành Tế bào gốc phôi (Embryonic stemcells – ES) là các tế bào có nguồn gốc từ khối tế bào bên trong của phôi nang.Các tế bào gốc phôi có khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào của cơ thể.Tuy nhiên, các tế bào gốc phôi chỉ có thể thu được bằng cách phá hủy phôi ở giaiđoạn phôi nang do đó việc sử dụng các tế bào gốc phôi gặp phải các vấn đề liênquan đến đạo đức Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cells) là các tế bào gốc
có thể thu được trong cơ thể từ giai đoạn thai nhi đến cơ thể trưởng thành.Nguồn cung cấp các tế bào gốc trưởng thành rất đa dạng như: dây rốn, dịch ối,tủy xương, mô mỡ, não, răng, da…và việc thu nhận các tế bào gốc trưởng thànhkhông gặp phải các vấn đề đạo đức như tế bào gốc phôi [3]
Phân loại theo tiềm năng biệt hóa của tế bào, tế bào gốc được chiathành bốn loại chính [4], [5]
Trang 7- Tế bào gốc toàn năng (Totipotent) là các tế bào gốc có khả năng biệthóa thành tất cả các loại tế bào trong cơ thể, và có thể phát triển thành một cơthể hoàn chỉnh Tế bào gốc toàn năng là các tế bào ban đầu trong quá trìnhphân chia của hợp tử, từ giai đoạn tiền nhân đến giai đoạn phôi ngày 3.
- Tế bào gốc vạn năng (Pluripotent) là các tế bào gốc có khả năng biệthóa thành hầu hết các loại tế bào trong cơ thể (trên 200 loại tế bào) nhưngkhông thể tạo ra được một cơ thể hoàn chỉnh Ví dụ về tế bào gốc vạn năng là
tế bào gốc phôi – tế bào lấy từ khối tế bào bên trong của phôi nang
- Tế bào gốc đa năng (Multipotent) là các tế bào gốc có khả năng biệthóa thành nhiều loại tế bào nhưng giới hạn trong tiềm năng biệt hóa củachúng Ví dụ: các tế bào gốc tạo máu có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bàomáu khác nhau
- Tế bào gốc đơn tiềm năng (Unipotent) là loại tế bào gốc mà chỉ có thểbiệt hóa thành một loại tế bào đặc hiệu
1.3 Các nguồn cung cấp tế bào gốc trưởng thành.
Mặc dù có thể thu được từ rất nhiều nguồn khác nhau như dịch ối, máucuống rốn, tủy xương, da, não, mỡ, tủy răng…nhưng các tế bào gốc trưởngthành được sử dụng trong nghiên cứu được thu thập chủ yếu từ một số nguồnnhư: dịch ối, máu cuống rốn, tủy xương, mỡ và răng [3]
Dịch ối: các tế bào gốc có nguồn gốc từ dịch ối (Amniotic fluid –derived stem cells–AFSCs) có thể thu được từ trong dịch ối thông qua các kỹthuật chọc hút dịch ối để làm các xét nghiệm di truyền Ngày càng có thêmnhiều nghiên cứu chứng minh rằng các tế bào gốc trong dịch ối có khả năngtăng sinh vượt trội và tiềm năng biệt hóa cao, có thể biệt hóa thành nhiềudòng tế bào như tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào xương, tế bào cơ, tế bào nội mô,
tế bào thần kinh [6], [7] Tuy nhiên tế bào gốc từ dịch ối chỉ có thể được thuthập từ dịch ối nên bị hạn chế về thời gian thu thập
Trang 8Máu cuống rốn: tế bào gốc máu cuống rốn (Umbilical cord blood stemcells – UCBSCs) có tiềm năng biệt hóa lớn, có khả năng phân chia và biệt hóathành nhiều dòng tế bào như tế bào gan, cơ, xương, mô thần kinh, tế bàotuyến tụy, tế bào của hệ miễn dịch và các tế bào trung mô Tuy nhiên nhượcđiểm của tế bào gốc máu cuống rốn là chỉ có thể thu thập được vào một thờiđiểm duy nhất là khi sinh [8], [9], [10].
Tủy xương: tế bào gốc từ tủy xương (Bone marrow – derived stem cell– BMSCs) bao gồm cả tế bào gốc tạo máu (có khả năng biệt hóa thành tất cả cácloại tế bào máu trong cơ thể) và tế bào gốc trung mô (có khả năng biệt hóa thànhcác loại tế bào của mô liên kết chính thức, mô sụn, mô xương) Tế bào gốc tủyxương có thể được phân lập từ tủy xương hoặc từ máu ngoại vi sau khi kíchthích tủy xương để giải phóng các tế bào gốc vào máu ngoại vi [11]
Mô mỡ: tế bào gốc có nguồn gốc từ mô mỡ (Adipose – derived stemcells – ASCs) thường được phân lập từ mỡ thu được sau khi làm các thủ thuậthút mỡ Tế bào gốc mỡ mang nhiều đặc điểm của tế bào gốc trung mô nhưngkhông phải tất cả Vì vậy ưu điểm của tế bào gốc mỡ là có ở nhiều nơi trong
cơ thể, dễ dàng trong việc thu nhận nhưng lại có nhược điểm là tiềm năng biệthóa kém hơn các loại tế bào gốc đã kể trên [12], [13]
Răng và các cấu trúc của răng: tế bào gốc của răng (Dental stem cells –DSC) có thể lấy từ tủy của răng sữa hoặc răng vĩnh viễn, từ các dây chằngquanh răng và từ các cấu trúc khác của răng Các nguồn để lấy tế bào gốc từrăng là sau nhổ răng sữa, sau nhổ răng hàm số ba, sau nhổ răng trong chỉnhnha, trong chấn thương hay trong các bệnh lý về răng Tuy nhiên nhược điểmcủa tế bào gốc răng là số lượng tế bào gốc ít [14]
1.4 Ứng dụng tế bào gốc.
Ứng dụng tế bào gốc trong y học hứa hẹn sẽ đem lại hiệu quả điều trịcao nhờ một số lý do sau đây Thứ nhất, không giống với những tế bào đãđược biệt hóa, tế bào gốc có thể được nhân lên và biệt hóa bên ngoài cơ thể
Trang 9Do đó, với một số lượng nhỏ tế bào gốc có thể sử dụng để chữa lành một tổnthương lớn hoặc sử dụng trong điều trị bệnh Ngược lại, để sửa chữa một tổnthương lớn bằng các tế bào cuối dòng đã biệt hóa cần một lượng lớn tế bào từnguồn hiến tặng Thứ hai, các tế bào gốc có thể biệt hóa và tổ chức các môtrong cơ thể, đặc biệt là với sự hiện diện của mạch máu Thứ ba, tế bào gốc cókhả năng sản xuất ra một số chất có thể tác động đến các phản ứng miễn dịchtại chỗ và toàn thân của người bệnh theo những cách có lợi cho quá trình táitạo mô [3]
Ứng dụng tế bào gốc trong tái tạo mô: nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằngmột quần thể tế bào gốc trung mô có thể biệt hóa thành tế bào sụn, tế bào cơ,
tế bào xương, tế bào mỡ Các tế bào sụn có nguồn gốc từ tế bào gốc có thểđược sử dụng để tái tạo các cấu trúc sụn nhân tạo như sụn mũi và khớp tháidương hàm Các tế bào xương có nguồn gốc từ tế bào gốc có thể được sửdụng để tái tạo xương hàm, xương sọ… Các tế bào cơ được biệt hóa từ tế bàogốc có thể được sử dụng trong điều trị hội chứng loạn dưỡng cơ, teo cơ Các
tế bào mỡ tạo ra từ tế bào gốc có thể được sử dụng để tái tạo mô mềm trênkhuôn mặt hoặc tái tạo vú Vậy tại sao lại cần sử dụng các tế bào cuối dòngđược tạo ra từ tế bào gốc mà không sử dụng luôn các tế bào cuối dòng có sẵn?Câu trả lời là do các tế bào cuối dòng có tuổi thọ hạn chế và không có khảnăng tự làm mới trong khi các tế bào gốc với các đặc tính đặc trưng có thể bổsung việc cung cấp các tế bào cuối dòng [3]
Ứng dụng tế bào gốc trong tái tạo xương và cấu trúc sọ não: hàng năm,ước tính tại Hoa kỳ có khoảng 1,6 triệu ca ghép xương được thực hiện Trong
số đó, ghép xương tự thân vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong ghép xương.Tuy nhiên việc sử dụng xương tự thân trong ghép xương làm cho bệnh nhânphải chịu thêm một chấn thương thứ hai để lấy mảnh xương ghép và gia tăng
tỷ lệ nhiễm trùng và các biến chứng của phẫu thuật trên bệnh nhân [15].Trong khi đó, việc sử dụng tế bào gốc trong cấy ghép xương giúp khắc phục
Trang 10nhược điểm này của ghép xương tự thân Các nghiên cứu lâm sàng đang đượctiến hành bằng cách sử dụng tế bào gốc để điều trị các khiếm khuyết xương,đặc biệt là khiếm khuyết xương dài.
Ứng dụng trong điều trị bệnh: Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các tếbào gốc từ vùng sọ não có nguồn gốc từ các tế bào mào thần kinh và tế bàotrung mô trong quá trình phát triển Do đó, chúng có khả năng biệt hóa thànhcác dòng tế bào thần kinh Từ đó, chúng đưa đến tiềm năng trong tái tạo thầnkinh ví dụ như điều trị bệnh Parkinson, điều trị chấn thương tủy sống và cácbệnh lý thần kinh khác Bên cạnh đó, chúng cũng có thể sử dụng để hỗ trợ sựthoái hóa của các tế bào thần kinh [16] Ngoài điều trị bệnh lý thần kinh, các
tế bào gốc còn được nghiên cứu để điều trị tổn thương cơ tim sau nhồi máu cơtim, điều trị suy tim [17], [18] Tế bào gốc được cho là có thể điều chỉnh hệthống miễn dịch nên hiện đang được nghiên cứu để điều trị một số bệnh lý tựmiễn như bệnh Crohn, bệnh lupus ban đỏ hệ thống [19], [20] Một số ứngdụng khác trong điều trị của tế bào gốc được trình bày trong bảng 1.1
Bảng 1.1 Các ứng dụng của tế bào gốc trong y tế đang
được nghiên cứu [3]
Trang 11thể thất bại và có tuổi thọ điều trị hạn chế [15] Sử dụng tế bào gốc trongtrường hợp này cơ ưu thế hơn titan do tế bào gốc không chỉ có vai trò làm đầynhững tổn thương khuyết mà còn có khả năng tái tạo chân răng, với dâychằng nha chu có thể phục hồi lại xương gốc Đó là ưu điểm vượt trội của tếbào gốc so với titan hay các vật liệu cấy ghép khác Một số ứng dụng tế bàogốc trong nha khoa hiện đang được nghiên cứu bao gồm phục hồi sứt môi hởhàm ếch, tái tạo khuyết răng, tái sinh tủy răng, tái tạo dây chằng nha chu, sảnxuất men và ngà răng [21], [22]
Bên cạnh những ứng dụng trong tái tạo mô và điều trị các bệnh lý liênquan đến tổn thương thoái hóa tế bào và mô, tế bào gốc còn được sử dụngtrong nghiên cứu cơ chế phát sinh bệnh Đồng thời, tế bào gốc còn được sửdụng trong đánh giá tính hiệu quả và an toàn của thuốc điều trị trước khi đưavào thử nghiệm lâm sàng trên người bệnh
1.5 Những khó khăn trong ứng dụng tế bào gốc.
Tế bào gốc đem lại rất nhiều hứa hẹn về một phương pháp điều trị mớihiệu quả cao trong y học nhưng bên cạnh đó để có thể đưa vào ứng dụng rộngrãi tế bào gốc cũng gặp rất nhiều khó khăn Khó khăn đầu tiên là đối với các
tế bào gốc phôi, việc thu thập gặp phải rất nhiều rào cản liên quan đến vấn đềđạo đức Đối với các tế bào gốc trưởng thành, khi việc thu thập không còngặp phải các vấn đề về đạo đức thì lại gặp khó khăn trong việc nhận diện, xácđịnh chính xác tế bào gốc nằm trong mô trưởng thành với rất nhiều loại tế bàokhác Sau khi đã được nhận diện và tách khỏi khối mô, để có thể đưa vào ứngdụng tế bào gốc cần được biệt hóa thành từng dòng tế bào cụ thể Tuy nhiên
để biệt hóa thành mỗi loại tế bào lại cần những điều kiện cụ thể khác nhau và
để đưa ra được quy trình biệt hóa tế bào gốc cần rất nhiều nghiên cứu đượctiến hành Các tế bào gốc đặc biệt là các tế bào gốc phôi có tiềm năng biệt hóarất lớn, nếu trong quá trình biệt hóa và đưa vào điều trị, bất kỳ tế bào gốc nàocòn sót lại đều có thể phát triển ngoài tầm kiểm soát và gây ra sự hình thành
Trang 12khối u Và tất cả các tế bào, mô khi cấy ghép vào cơ thể đều có thể gây raphản ứng miễn dịch và hiện tượng thải ghép nên đây cũng là một thách thứcđối với liệu pháp tế bào gốc [3] Mặc dù còn rất nhiều khó khăn nhưng nhữngứng dụng bước đầu của tế bào gốc trong y học đem lại kết quả rất triển vọng
và mở ra một hướng đi mới trong điều trị
2 Tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC – induced pluripotent stem cell).
Tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC) là các tế bào gốc trưởng thànhhoặc tế bào soma của cơ thể được tái lập trình để có các đặc tính và tiềm năngbiệt hóa giống như tế bào gốc phôi [23] Đây là một nguồn cung cấp tế bàogốc vô hạn hứa hẹn đem lại nhiều thành công mới trong liệu pháp điều trị tếbào gốc
2.1 Nghiên cứu lần đầu tiên tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng.
Năm 2006, lần đầu tiên các tế bào gốc vạn năng cảm ứng đượcYamanaka và Takahashi tạo ra từ việc nuôi cấy nguyên bào sợi đồng thờinhóm tác giả cũng lần đầu tiên giới thiệu bốn yếu tố tham gia vào quá trìnhcảm ứng để tạo ra tế bào iPS [2]
Xuất phát từ việc nhận thấy tế bào gốc phôi là loại tế bào gốc có tiềmnăng biệt hóa rất lớn, đang được tiến hành nghiên cứu và có tiềm năng trongviệc ứng dụng điều trị một loạt các bệnh lý như bệnh Parkinson, chấn thươngcột sống, tiểu đường… tuy nhiên việc sử dụng phôi người để cung cấp nguồn
tế bào gốc gặp phải rất nhiều tranh cãi liên quan đến đạo đức Đồng thời, sửdụng tế bào gốc phôi trong điều trị cũng gặp khó khăn trong vấn đề gây đápứng miễn dịch Một biện pháp để khắc phục được cả hai khó khăn của tế bàogốc phôi này tạo ra được tế bào có đặc tính tương tự tế bào gốc phôi từ chínhcác tế bào của người bệnh Nhiều nghiên cứu thử nghiệm trước đây đã chỉ rarằng các tế bào soma có thể được tái lập trình bằng cách chuyển nhân của tếbào soma vào tế bào chất của tế bào trứng Từ đó nhóm nghiên cứu củaYamanaka đã đưa ra giả thuyết rằng có những yếu tố đóng vai trò quan trọng
Trang 13trong việc duy trì các đặc điểm nhận dạng của tế bào gốc phôi cũng như đóngvai trò then chốt trong việc tạo ra tính đa năng của tế bào soma [2] Một sốyếu tố phiên mã bao gồm Oct3/4, Sox2, Nanog có vai trò trong việc duy trìtính đa năng của tế bào ES [24], [25], [26] Một số gen tham gia vào quá trìnhđiều hòa sự phát triển của khối u như Stat3, E-Ras, c-Myc, Klf4, cat-catenincũng đã được chứng minh là góp phần duy trì lâu dài các đặc tính của tế bào
ES và có vai trò trong quá trình phân chia nhanh chóng của các tế bào ES[27], [28], [29] Từ các kết quả đã có sẵn, nhóm nghiên cứu của Yamanaka đãlựa chọn ra 24 yếu tố để xác định xem yếu tố nào có vai trò trong quá trình tạo
ra tính đa năng của tế bào soma [2]
Nghiên cứu được thực hiện bằng cách đưa lần lượt từng gen tổng hợpnên 24 yếu tố được chọn vào trong nguyên bào sợi của chuột thông qua sự tảinạp của retrovirus Các tế bào sau đó được tiến hành nuôi cấy trong môitrường nuôi cấy tế bào gốc phôi Để phát hiện trạng thái đa năng của tế bào,nghiên cứu tiến hành bổ sung vào môi trường nuôi cấy G418 do đặc điểmkháng G418 của tế bào ở trạng thái đa năng Kết quả không thu được tế bàonào kháng G418 sau thời gian nuôi cấy Điều đó chứng minh rằng không cóyếu tố nào trong 24 yếu tố ban đầu nhóm nghiên cứu lựa chọn có khả năngkích hoạt tính đa năng của nguyên bào sợi chuột Ngược lại khi đưa cả 24 yếu
tố này vào trong nguyên bào sợi chuột thì lại thu được các tế bào kháng G418.Tiếp tục nuôi cấy các dòng tế bào kháng G418 thu được thì thấy có khoảngmột nửa trong số đó có biểu hiện hình dạng tương tự tế bào gốc phôi (tế bàotròn, nhân lớn) Tiếp tục lặp lại thử nghiệm trên thì thu được một số dòng tếbào không chỉ giống tế bào gốc phôi về hình dạng mà còn có đặc điểm tăngsinh giống tế bào gốc phôi Từ kết quả này nhóm nghiên cứu của Yamanaka
đã đưa ra kết luận rằng sự kết hợp của một số yếu tố trong 24 yếu tố đượcchọn đã kích hoạt sự biểu hiện của gen đánh dấu tế bào gốc phôi trong nguyênbào sợi của chuột Và câu hỏi được đặt ra là sự kết hợp của những yếu tố nào
Trang 14đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt tính đa năng của nguyên bào sợichuột? Nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành thử nghiệm bằng cách loại bỏ dầntừng yếu tố trong 24 yếu tố và kiểm tra xem tổ hợp các yếu tố nào tạo ra đượcdòng tế bào kháng G418 Từ đó đã tìm ra được 10 yếu tố mà khi loại bỏchúng ra khỏi tổ hợp 24 yếu tố thì không có hoặc có rất ít tế bào kháng G418được tạo thành và khi kết hợp 10 yếu tố này với nhau thì tạo thành nhiều dòng
tế bào giống với tế bào gốc phôi hơn cả khi kết hợp 24 yếu tố Nhóm nghiêncứu không chỉ dừng lại ở đó mà tiếp tục loại bỏ từng yếu tố trong 10 yếu tốvừa được xác định để tìm ra yếu tố nào có vai trò quyết định Kết quả chothấy rằng khi loại bỏ Oct3/4 và Klf4 thì không có dòng tế bào kháng G418được hình thành, rất ít tế bào kháng G418 được hình thành khi loại bỏ Sox2,
Và khi loại bỏ c-Myc thì các tế bào kháng G418 vẫn xuất hiện nhưng có hìnhdạng phẳng hơn các tế bào gốc phôi Loại bỏ các yếu tố còn lại có ảnh hưởngkhông đáng kể đến sự tạo ra dòng tế bào kháng G418 có các đặc điểm của tếbào gốc phôi Từ đó, Yamanaka và cộng sự đã đưa ra kết luận rằng bốn yếu tốOct3/4, Klf4, Sox2 và c-Myc đóng vai trò quan trọng trong việc tái kích hoạttính đa năng của nguyên bào sợi chuột Và các tế bào được tạo ra được gọi là
tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC) Các nhà nghiên cứu tiếp tục loại bỏ lầnlượt từng yếu tố để xem có tổ hợp hai hay ba yếu tố nào cũng tạo ra được các
tế bào iPS hay không Kết quả cho thấy, không có tổ hợp hai yếu tố nào có thểtạo ra dòng tế bào kháng G418 Các tổ hợp ba yếu tố có thể tạo ra các dòng tếbào kháng G418 nhưng có hình dạng không giống với hình dạng của tế bàogốc phôi cũng như không giống với hình dạng của các tế bào iPS tạo ra khikết hợp bốn hay mười yếu tố [2]
Để đánh giá xem các tế bào iPS có thật sự có các đặc điểm của tế bàogốc phôi hay không, nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR để kiểm tra cácgen đánh dấu trong tế bào gốc phôi có được biểu hiện ở các tế bào iPS haykhông Kết quả cho thấy các tế bào iPS tạo ra từ tổ hợp bốn hay mười yếu tố