GIÁ TRỊ của các PHƯƠNG PHÁP SÀNG lọc DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI TRONG THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN GIÁ TRỊ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI TRONG THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN GIÁ TRỊ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI TRONG THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lương Thị Lan Anh Cho đề tài: “Mối liên quan số yếu tố nguy tình trạng rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi” Chuyên ngành: Sản Phụ khoa Mã số: 62720131 CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2018 CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT a-CGH: Array Comparative Genomic Hybridization/ Lai so sánh/ Đối chiếu gen dùng chíp DNA ADO: Allele Drop-Out / Mất alen ART: Assisted Reproductive Technology/ Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản a-SNP: Array Single Nucleotide Polymorphism/ Phân tích đa hình đơn dùng chíp DNA BAC: Bacterial artificial chromosome DNA: DeoxyriboNucleic Acid FISH: Fluorescent In Situ Hybridization/ Lai huỳnh quang chỗ ICM: Inner Cell Mass/ Nguyên bào phôi-mầm phôi ICSI: Intra Cytoplasmic Sperm Injection/ Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn IUI: Intra-Uterine Insemination/ Bơm tinh trùng vào buồng tử cung IUI-D: Sử dụng tinh dịch hiến tặng IUI-H: Sử dụng tinh dịch chồng IVF: In-Vitro Fertiliztion/ Thụ tinh ống nghiệm IVM: In vitro maturation of oocytes/ Kỹ thuật nuôi trứng trưởng thành ống nghiệm KL-BoBs: BACs - on - Beads/ Phương pháp KaryoLite BoBs NGS: Next Generation Sequencing/ Giải trình tự gene hệ NST: Nhiễm sắc thể PB: Phôi bào PGD: Preimplantation genetic diagnosis/ Chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi PGS: Preimplantation genetic screening/ Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi PGT: Preimplantation genetic testing/ Test di truyền trước chuyển phôi PZD: Partial zona dissection qPCR: Quantitative Polymerase Chain Reaction/ Phản ứng chuỗi định lượng RNA: RiboNucleic Acid TE: Trophectoderm/ Nguyên bào nuôi WGA: Whole Genome Application / Khuếch đại gen WHO: Tổ chức Y tế Thế giới MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Thụ tinh ống nghiệm (In - Vitro - Infetilitzition /IVF) kỹ thuật cho trứng tinh trùng kết hợp với phòng thí nghiệm (thay vòi trứng người phụ nữ) Sau đó, phơi hình thành chuyển trở lại vào buồng tử cung Q trình phát triển phơi thai diễn bình thường tử cung người mẹ Tỷ lệ thành công IVF khoảng 30-35%, phôi chuyển phôi chọn lựa hình thái tốt Ngun nhân tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể (NST) cao trứng phôi Các nghiên cứu di truyền học tế bào rối loạn NST tương đối phổ biến phát triển trước sau chuyển phôi, ảnh hưởng tới 50% phôi thụ tinh ống nghiệm trước chuyển phôi; 10% tất thai tháng đầu [1] Vì vậy, để tăng tỷ lệ thành công IVF, sàng lọc di truyền trước chuyển phôi (preimplantation genetic testing-PGT) đề xuất làm phương pháp để đảm bảo phôi lưỡng bội chọn để chuyển Kỹ thuật FISH ( kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ) kỹ thuật thực hiện, số tác giả cho kỹ thuật làm giảm tỷ lệ sảy thai, tăng khả làm tổ phôi, nhiên FISH không làm tăng kết thành công IVF tác dụng làm tăng tỷ lệ thụ thai Đồng thời phương pháp khơng có tinh sđại diện , sử dụng Thay xét nghiệm mới: NGS (giải trình tự hệ mới); PCR định lượng (qPCR) với sinh thiết phôi giai đoạn phôi nang… Các xét nghiệm chứng minh vai trò cải thiện kết thành cơng IVF Các kỹ thuật đánh giá tất 23 cặp nhiễm sắc thể trước chọn cấy chuyển phôi Những trường hợp nên thực PGT gồm có phụ nữ lớn tuổi mang thai [2], có tiền sử sảy thai nhiều lần, thực chuyển phôi nhiều lần không thành công [3], nam giới vô sinh nghiêm trọng [4] Chưa có nhiều nghiên cứu độ xác xét nghiệm PGT có Do bác sĩ sản khoa chưa nhận thấy cần thiết ứng dụng xét nghiệm này, khó để tư vấn cho bệnh nhân thực các kỹ thuật Mục tiêu chuyên đề “Giá trị phương pháp sàng lọc di truyền trước chuyển phôi thụ tinh ống nghiệm” bao gồm: Trình bày kỹ thuật sàng lọc di truyền trước chuyển phơi Đánh giá vai trò kỹ thuật sàng lọc di truyền trước chuyển phôi thụ tinh ống nghiệm I CÁC KỸ THUẬT SINH THIẾT PHƠI TRONG PGT PGT thực loại tế bào khác q trình phát triển phơi trước chuyển: thể cực (PB) từ noãn bào hợp tử, phôi bào từ phôi giai đoạn phân cắt, tế bào nuôi giai đoạn phôi nang Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm độ xác chẩn đốn di truyền có khả ảnh hưởng đến trình IVF [5] Sinh thiết thể cực Đây giai đoạn sớm kiểm tra dựa giả thiết NST thể cực đặc trưng cho noãn bào [6] - Ưu điểm: Cung cấp mẫu sớm cho PGS, tối đa hóa thời gian dành cho phân tích di truyền trường hợp cần chuyển phôi tươi, khả xâm lấn hơn, PB khơng khơng phát triển thành phơi thai [7] ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh phát triển phôi [8] - Nhược điểm: Giả thiết kết lệch bội phôi thai không phân tách nguyên phân mẹ [9], thực tế nguyên nhân chiếm 66% [10], lại 1/3 thể lệch bội khơng phát Kỹ thuật khơng hiệu mặt chi phí: PB lấy từ nỗn bào, khơng phải tất phát triển thành phôi để chuyển Sinh thiết phôi bào Sinh thiết giai đoạn ngày sau thụ tinh, giai đoạn 6-10 tế bào [11], trình sinh thiết phôi bào dễ dàng ủ mơi trường khơng có Ca2+, Mg2+, để phá vỡ liên kết tế bào [12] - Ưu điểm: Kỹ thuật phản ánh bất thường di truyền phôi - sinh thiết thể cực Nhược điểm: Trong kỹ thuật này, cần phải lấy lượng lớn tế bào phôi việc phải phá vỡ liên kết tế bào nên gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả phát triển tỷ lệ chuyển phôi thành công Tế bào sinh thiết khơng đặc trưng cho tồn phơi thai , tỷ lệ thể khảm phôi trước chuyển lên tới 29% [13] Sinh thiết phôi nang Trong kỹ thuật này, tạo lỗ màng bao ngồi phơi ngày thứ 3, sau ni cấy đến giai đoạn phơi nang ( ngày 5-6) Một số tế bào ngồi phơi (sẽ phát triển thành thai) thoát qua lỗ màng bao ngồi phơi hút để chẩn đốn, khối phơi bào lại ngun vẹn - Ưu điểm: Khơng có ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả làm tổ phôi Nhiều tế bào sinh thiết phân tích Hiệu cao liên quan đến việc sinh thiết ngày 5-6, mà phôi bất thường - thiếu khả phát triển đến giai đoạn phôi nang [14] Nhược điểm: Sinh thiết giai đoạn muộn giới hạn thời gian thực phân tích di truyền trước chuyển phôi tươi,[14], nên phôi cần trữ đông lạnh sau sinh thiết Bộ NST tế bào phơi khơng đại diện cho NST phối khôi bào (lên tới 4%) Thể khảm phổ biến từ ngày thứ Khi tế bào sinh thiết để phân tích di truyền, số kỹ thuật sử dụng PGS phân tích một vài tế bào, yêu cầu cần thiết kỹ thuật phải nhanh, xác, độ tin cậy cao, có khả cung cấp tối đa thông tin di truyền mẫu sinh thiết Bên cạnh yêu cầu này, xét nghiệm sàng lọc nên hoàn thành khoảng thời gian tối thiểu, không câm lấn để chuyển phôi tươi cần thiết II CÁC KỸ THUẬT SÀNG LỌC DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI Kỹ thuật Fluorescence in situ hybridization (FISH) 1.1 Đặc điểm kỹ thuật Là kỹ thuật giúp phát bất thường NST phôi phương pháp di truyền tế bào - phân tử Các nhà di truyền học tế bào bước vào kỷ nguyên sinh học phân tử với việc khởi động với kỹ thuật lai chỗ (In Situ Hybridization), chúng cho phép nhà khoa học xác định vị trí trình tự DNA đặc biệt nhiễm sắc thể Bắt đầu từ thí nghiệm lai chỗ năm 1969 (Gall & Pardue), nhiều biến thể quy trình phát triển, nâng cao độ nhạy kỹ thuật Ngày nay, kỹ thuật lai chỗ phổ biến sử dụng đầu dò huỳnh quang để phát trình tự DNA, quy trình thực gọi tên Lai huỳnh quang chỗFISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Các biến thể kỹ thuật FISH nhà di truyền học tế bào sử dụng để phát bất thường nhiễm sắc thể bệnh nhân Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH) kỹ thuật sử dụng đầu dò DNA gắn huỳnh quang lai với trình tự DNA đặc hiệu đích nhiễm sắc thể tế bào gian kỳ nhiễm sắc thể kỳ giữa, qua phát có mặt hay vắng mặt đoạn gen kính hiển vi huỳnh quang [15] 1.2 Ứng dụng FISH sàng lọc phôi Kỹ thuật FISH sử dụng lần để xét nghiệm phôi người vào năm 1992 [16] Từ đó, hàng trăm ngàn bệnh nhân IVF sàng lọc phôi kỹ thuật Một vài nghiên cứu cho thấy FISH làm giảm tỷ lệ sẩy thai, tăng tỷ lệ thai làm tổ tỷ lệ sinh sống chuyển phôi sàng lọc kỹ thuật Tuy nhiên nhiều nghiên cứu sau lại khẳng định FISH khơng làm tăng hiệu cho IVF, hạn chế bật kỹ thuật FISH, kiểm tra lượng giới hạn NST (tối đa 12 cặp NST) từ tế bào phôi ngày nên tỷ lệ chẩn đốn âm tính giả cao (phơi bị lệch bội 10 nhiễm sắc thể mà đánh giá bình thường), FISH kết đại diện không cho kết toàn diện toàn 24 NST phôi thai (Harper Harton, 2010; Harper cộng sự, 2010; Gutierrez-Mateo cộng sự, 2011) Các nghiên cứu sử dụng công nghệ sàng lọc nhiễm sắc thể toàn diện (CCS) cho thấy rối loạn NST xảy NST số 24 nhiễm sắc thể phôi thai Điều cho thấy việc sàng lọc rối loạn tất nhiễm sắc thể cần thiết để xác định xem phơi có nhiễm sắc thể bình thường hay không (Wells cộng sự, 2008; Schoolcraft cộng sự, 2010; Treff cộng sự, 2010; Fiorentino cộng sự, 2011; Fiorentino, 2012 Gutierrez-Mateo cộng sự, 2011) Một điểm hạn chế kỹ thuật FISH kỹ thuật thực khó, đòi hỏi kinh nghiệm cố định dàn trải phơi bào phiến kính Kết phụ thuộc vào chất lượng số lượng DNA mẫu, chuẩn bị tiêu khả nhận biết màu sắc tín hiệu huỳnh quang người đọc kết quả, có tượng âm tính giả Mặt khác kỹ thuật FISH đòi hỏi thiết bị chun mơn cao nên khó triển khai rộng rãi quy mơ lớn [17], [18],[19] [20] Do đó, trọng tâm lĩnh vực PGS chuyển từ sinh thiết phôi ngày thứ (blastomere) sang lấy mẫu phôi ngày 5/6 (trophectoderm) sử dụng kỹ thuật sàng lọc toàn bộ nhiễm sắc thể, để cung cấp đánh giá xác chất lượng phơi thai Phương pháp KaryoLite BoBs ( KL ‐ BoBs) 2.1 Đặc điểm kỹ thuật Hiện nay, công nghệ gọi KaryoLiteTM Beads (KLBoBs) sửa đổi từ lai ghép gen so sánh phát triển để phát số lượng DNA Xét nghiệm chứa độ bao phủ độ phân giải thấp tất nhiễm sắc thể cung cấp thông tin liều lượng vùng gần vùng đầu cuối nhánh nhiễm sắc thể Ngoài ra, có đến 16 nhiên [35] PGT sử dụng để tối thiểu hóa phơi thai dị bội NST bệnh nhân thực IVF PGT bao gồm việc sinh thiết tế bào từ phôi nuôi cấy kiểm tra NST trước cấy chuyển vào tử cung Do vậy, PGS xác định phôi lưỡng bội để cấy truyển vào tử cung, tăng tỷ lệ làm tổ phơi giảm tỷ lệ sảy thai thực IVF Một tiến đáng kể việc sử dụng mẫu sinh thiết nuôi so với việc sinh thiết phôi bào giai đoạn phân cắt thể cực Dữ liệu báo cáo tỷ lệ thể khảm giai đoạn phân cắt lên tới 50% [36] Trong thể khảm tồn giai đoạn phôi nang, tỷ lệ thể khảm thấp đáng kể, khoảng 35% so với giai đoạn phát triển sớm [37] Vì sinh thiết tế bào kiểm tra PGS khơng đặc trưng cho NST tế bào khác, bao gồm phơi Do vậy, thể khảm dẫn tới chẩn đốn sai, dẫn đến khơng khớp với kết lâm sàng chí trường hợp chẩn đốn di truyền tế bào hồn tồn xác [38] CGH array dày đặc SNP array, aCGH chip sử dụng cho PGT có khoảng 4000 dấu chuẩn (chạy lặp lại) rải rác khắp hệ gen Trong aCGH, mẫu so sánh với mẫu DNA 46, XY 46, XX bình thường [28] CGH array có khả hoàn thành thời gian ngắn so sánh với SNP array (12-15 giờ) Đây ưu điểm lớn so với SNP array ( Mất 30-40 để hồn thành việc phân tích Khơng đưa kiểu gen mẫu , aCGH phân biệt 46 XX 69 XXX 46 XY 69 XXY Thêm vào đó, aCGH khơng thể xác định việc nhận toàn NST từ bố mẹ aCGH sử dụng tất phóng thí nghiệm thương mại xác dịnh lệch bội tất NST không thiết kế để xác định bất thường cấu trúc NST [39] aCGH có tỷ lệ lỗi khoảng 15-30% Trong nghiên cứu xác nhận tiến hành so sánh NGS aCGH 40 mẫu tế bào nuôi, 17 99% kết phù hợp, có trường hợp chẩn đoán thể ba nhiễm NST 19 aCGH, chẩn đốn bình thường NGS [40] Kỹ thuật giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing-NGS) 4.1 Đặc điểm kỹ thuật NGS Giống kỹ thuật trên, PGT sử dụng NGS cần thực WGA với tế bào sinh thiết để tạo đủ lượng DNA cho xét nghiệm Sau khuếch đại, DNA phôi phân mảnh gắn barcode đặc trưng để theo dõi Hàng trăm nghìn đoạn nhỏ DNA phơi gắn barcode (từ nhiều mẫu sinh thiết phôi) trộn giải trình tự song song Sau giải trình tự, phần mềm máy tính chuyên dụng sử dụng để phân biệt mã vạch theo dõi mẫu, có khả tách biệt kết theo mẫu sinh thiết Sau tách biệt, đoạn trình tự từ mẫu so sánh với hệ gen tham chiếu dóng với vùng NST tương ứng Số lượng trình tự dóng dọc theo chiều dài NST sau tính tốn Vì số lượng trình tự dóng nên tỷ lệ với số copy mẫu gốc, thể nhiễm thể nhiễm phân biệt rõ ràng dựa tăng giảm số lượng trình tự dóng dọc theo chiều dài NST 18 4.2 Ứng dụng kỹ thuật NGS sàng lọc di truyền trước chuyển phôi Kỹ thuật ứng dụng cho PGT NGS sử dụng cho xét nghiệm trước sinh, đặc biệt sử dụng nhiều sàng lọc lệch bội NST thông qua việc đánh giá DNA tự huyết mẹ Vai trò tiềm NGS PGT Yin cộng [41] đánh giá, qua việc phân tích 38 mẫu sinh thiết phơi nang dùng SNP array NGS Tất 26 phôi lưỡng bội phôi lệch bội đồng xác định xác SNP array NGS Hơn nữa, NGS phát tất phơi có chuyển vị NST khơng cân bằng, số khơng phát SNP array Fiorentino cộng [42] thực nghiên cứu “hồi cứu” để xác nhận việc sử dụng NGS cho PGS tế bào đơn.18 dòng tế bào đơn có bất thường NST biết NST đồ; 190 sản phẩm khuếch đại toàn hệ gen từ phơi bào (được phân tích trước aCGH) đánh giá NGS Nhìn chung NGS cho thấy phù hợp cao với phương pháp trước đó, với phù hợp đạt 207/208 mẫu (99,5 %) Đối với mẫu lại, NGS xác minh cho kết trisomy 18 dương tính giả (khơng phát sử dụng aCGH phân tích lại sử dụng kỹ thuật qPCR) Tuy nhiên, tượng dương tính giả xảy mẫu sinh thiết có nhiều lệch bội khác, nên tổng thể đồng lệch bội NST phôi kỹ thuật 100% Dựa thành công đánh giá tiền lâm sàng ban đầu này, Fioretino cs [43] thực nghiên cứu tiến cứu để đánh giá tiềm lâm sàng NGS thực song song với aCGH mẫu sinh thiết phôi nang Tổng số 192 phôi nang từ 55 chu kỳ PGS sinh thiết đánh giá sử dụng NGS aCGH Những kết phù hợp thu từ 191/192 phôi nang (99,5%) Một lần nữa, mẫu có khơng trùng khớp 19 vài lệch bội, NGS đạt tổng thể 100% độ nhạy độ đặc hiệu Tỷ lệ cấy ghép thành cơng sau đạt 62%, giúp 31 ca sinh đẻ thành công 31 đứa trẻ sức khỏe khỏe mạnh Yang cộng [44] thực nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên để đánh giá hiệu NGS dùng PGS so sánh với aCGH Trong nghiên cứu này, 172 bệnh nhân (độ tuổi trung bình mẹ 35.2 ± 3.5) chia ngẫu nhiên vào nhóm Nhóm thứ (n=86) sàng lọc phôi nang NGS, nhóm thứ hai (n=86) phơi nang sàng lọc aCGH Tất phôi nang đông phôi sau sinh thiết chờ kết PGS Sau đó, phơi nang lưỡng bội rã đông để chuyển chu kỳ chuyển phôi đông lạnh NGS aCGH cho kết tương đương tỷ lệ thụ thai (74,7 so với 69,2%, p>0.05) tỷ lệ làm tổ (70,5 so với 66,2%, p> 0.05) Dựa kết này, tác giả kết luận NGS kỹ thuật có độ xác, hiệu thông lượng cao để sử dụng PGT 4.3 Sử dụng NGS đánh giá phôi Giải trình tự hệ (NGS) yêu cầu tối ưu hóa việc khuếch đại DNA để giảm sản phẩm giả (artifact) suốt trình khuếch đại Sau khuếch đại DNA, sản phẩm giả xác định loại bỏ phần mềm tin sinh Có hai thiết bị sử dụng gần cho PGT Miseq Illumina PGM Thermo [43] Sau khuếch đại DNA, khoảng 50 ng mẫu DNA cắt enzyme thành hàng triệu đoạn tập hợp lại (pooled) cho việc chuẩn bị thư viện Chuẩn bị thư viện tất đoạn DNA gắn với adapter mã vạch Sau tạo thư viện, bước nhũ tương PCR thực với PGM, bước PCR cầu nối thực vớ Miseq 20 NGS cung cấp thông tin locus locus Kỹ thuật chuẩn hóa cho phát dị bội tồn bộ NST, dị bội khơng phân mảnh (>50 Mb), đoạn mất, lặp đáng kể mặt lâm sàng Kỹ thuật phát thể khảm khoảng 50% mẫu thể khảm, mẫu cho phôi bất thường bất thường thể khảm 4.4 So sánh kết sàng lọc di truyền trước chuyển phôi aCGH NGS Hiệu phương pháp hỗ trợ sinh sản phụ thuộc nhiều vào chất lượng phôi chuyển khả làm tổ chúng Các phương pháp di truyền phân tử đại có khả đưa cấu trúc di truyền phôi, để tránh việc chuyển phơi có NST bị khiếm khuyết tái xếp NST dẫn đến bệnh lý bẩm sinh chí ngăn ngừa số bệnh di truyền [45] Khoảng 25% số trứng thu từ phụ nữ có đội tuổi từ 30 đến 35 tuổi có bất thường NST (hầu hết dị bội), tần suất dị bội thường phụ thuộc trực tiếp vào độ tuổi lên đến 80% phụ nữ 40 tuổi [46] Nhu cầu chọn lọc phơi có NST bình thường dẫn đến phát triển phương pháp sàng lọc di truyền trước chuyển phôi (PGT) Chọn lọc phôi PGT cải thiện hiệu IVF thông qua việc tăng tỷ lệ làm tổ phôi giảm tần suất sảy thai [47] Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH) phương pháp áp dụng sàng lọc phôi dị bội FISH thường kiểm tra đến NST phôi bào lấy vào ngày thứ sau thụ tinh nhân tạo Thơng thường, đầu dò DNA đặc hiệu NST 13, 18, 21, X, Y Một số phương pháp kiểm tra đến 12 NST nhờ vào vòng lai lặp lặp lại Tuy nhiên, nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên quy mô lớn FISH có giới hạn số lượng NST kiểm tra, nên khơng làm tăng đáng kể hiệu IVF 21 [48] Điều xảy phơi thai có độ khảm cao việc kiểm tra phôi bào phản ánh thành NST cho tồn phơi hầu hết trường hợp [48] Hơn nữa, thể dị bội luôn phát sử dụng FISH chúng liên quan đến tồn bộ NST NST nghiên cứu Sàng lọc trước chuyển phôi sử dụng FISH chu kỳ làm IVF thực Trung tâm nghiên cứu Sản khoa, Phụ khoa Sinh học phôi từ phụ nữ 35 tuổi khơng có tần suất cao thể ba NST 13, 18, 21 bất thường số lượng NST giới tính, mà có tần suất cao gần 1.5 lần mang thể tam bội Những kỹ thuât sàng lọc rối loạn NST gần đưa vào để kiểm tra toàn bộ NST phôi Các kỹ thuật bao gồm lai so sánh hệ gen (a CGH) SNP array Những nghiên cứu aCGH hiệu việc sàng lọc 24 NST từ trứng phôi Một vài hệ thống aCGH công nhận xét nghiệm PGS đáng tin cậy sử dụng rộng rãi y học sinh sản [49] Từ năm 2010, giải trình tự hệ (NGS) trở thành kỹ thuật hỗ trợ sinh sản [50] Ưu điểm quan trọng NGS khả điều chỉnh phạm vi kiểm tra ( Ví dụ: độ phân giải thay đổi từ dị bội NST đến thêm, đoạn thông qua việc thay đổi số lượng đầu đọc cho mẫu), kiểm tra hàng chục mẫu lúc giảm chi phí xét nghiệm so với aCGH cách tối ưu hóa chế độ hoạt động máy [47] Hiện nay, aCGH dùng cho PGT sử dụng cho phần lớn trường hợp Ưu điểm aCGH khả phát rối loạn đoạn NST vi mô (thể dị bội bao gồm thể khảm, chuyển đoạn không cân bằng, NST thị) khiếm khuyết mức vi thể (hội chứng mất, lặp tái xếp telomere không cân) đồng thời hệ gen [51] 22 Nghiên cứu Trung tâm nghiên cứu Sản phụ khoa PGT sử dụng aCGH làm tăng tỷ lệ mang thai từ 35 lên 50% phụ nữ 30 tuổi tăng từ 31% lên 42% phụ nữ độ tuổi 30 đến 40 từ 14 lên 33% phụ nữ lớn 40 tuổi [52] Tuy nhiên, aCGH phát trường hợp chuyển đoạn cân ( chuyển vị tương hỗ, đảo đoạn, chuyển vị Robertson chèn đoạn tương hỗ) số tái xếp không cân (đột biến điểm, mất, lặp đoạn độ phân giải kỹ thuật) Sau đứa trẻ thuộc dự án sử dụng NGS để hỗ trợ công nghệ sinh sản sinh năm 2013 Philadelphia Một số phòng thí nghiệm di truyền lớn thực nghiên cứu lâm sàng NGS phương pháp xác đáng tin cậy cho sàng lọc trước chuyển phơi [53] Phương pháp có hiệu 100% việc phát thể dị bội kết thu phù hợp với xét nghiệm sử dụng aCGH 99,98% trường hợp Nghiên cứu thực với số lượng phôi đủ lớn (38 mẫu phôi sinh thiết) tương đồng kết aCGH NGS 94,8% trường hợp [47] 23 KẾT LUẬN Hiện nay, thụ tinh ống nghiệm (IVF) có tỷ lệ có thai thấp từ 35-40%, ngun nhân phơi bị rối loạn NST Các phương pháp sàng lọc trước chuyển phôi góp phát rối loạn nhiễm sắc thể phôi trước chuyển vào buồng tử cung Việc góp phần làm tăng tỷ lệ có thai cho IVF lên tới 60-70%, đồng thời giảm tỷ lệ rủi ro sảy thai, giảm thiểu rủi ro bệnh dị tật thai nhi, giảm tỷ lệ đa thai sau sàng lọc phôi thường chuyển phôi bảo đảm cho đời hệ khoẻ mạnh thể lực, sáng suốt tinh thần, góp phần nâng cao chất lượng dân số Kỹ thuật aCGH chứng minh phương pháp PGT xác coi tiêu chuẩn vàng Nhưng đến năm 2014, với đời cơng nghệ giải trình tự gen hệ (NGS) tạo cách mạng sàng lọc phơi Đã có nhiều nghiên cứu chứng tỏ NGS có nhiều ưu điểm aCGH, giúp cho thụ tinh ống nghiệm đạt kết cao hơn, tiết kiệm chi phí TÀI LIỆU THAM KHẢO Gardner R.M., Sutherland G.R., LG S (2004) Chromosome Abnormalities and Genetic Counseling Cambridge University Press, Schoolcraft W.B., G K.-J.M., J S., et al (2009) Preimplantation aneuploidy testing for infertile patients of advanced maternal age: a randomized prospective trial Fertily and Sterily, 92, 157-162 Shahine L.K., RB L (2014) Embryo selection with preimplantation chromosomal screening in patients with recurrent pregnancy loss Semin Reprod Med, 32, 93-99 Harper J.C., L W., J T.-S., et al (2012) The ESHRE PGD consortium: 10 years of data collection Hum Reprod Update, 18, 234-247 Cimadomo D., A C., FM U., et al (2016) The impact of biopsy on human embryo developmental potential during preimplantation genetic diagnosis Biomed Res Int, Fasouliotis S.J., JG S (1998) Preimplantation genetic diagnosis principles and ethics Hum Reprod, 13, 2238-2245 Vos A.D., A V.S (2001) Aspects of biopsy procedures prior to preimplantation genetic diagnosis Prenat Diagn, 21, 767-780 Verlinsky Y., S R., S E., et al (1992) Preconception and preimplantation diagnosis for cystic fibrosis Prenat Diagn, 12, 103- 110 Scott R.T.J., K F., J S., et al (2012) Comprehensive chromosome screening is highly predictive of the reproductive potential of human embryos: a prospective, blinded, nonselection study Fertily and Sterily, 10 97, 870-875 Treff N.R., J S., X T., et al (2008) Characterization of the source of human embryonic aneuploidy using microarray-based 24 chromosome preimplantation genetic diagnosis (mPGD) and aneuploid chromosome fingerprinting Fertily and Sterily, 90 11 Coonen E (1996) Pre-implantation diagnosis of genetic disease Eur J 12 Obstet Gynecol Reprod Biol, 67, 81-83 Dumoulin J.C., M B., E C., et al (1998) Effect of Ca2+/ Mg2+ free medium on the biopsy procedure for preimplantation genetic diagnosis and further development of human embryos Hum Reprod, 13, 2880- 13 2883 Schoolcraft W.B., Katz-Jaffe M.G (2013) Comprehensive chromosome screening of trophectoderm with vitrification facilitates elective singleembryo transfer for infertile women with advanced maternal age 14 Fertily and Sterily, 100, 615-619 Harton G.L., S M., M S., et al (2013) Diminished effect of maternal age on implantation after preimplantation genetic diagnosis with array 15 comparative genomic hybridization Fertily and Sterily, 100, 1695-1703 Jin, L; Lloyd, RV (1997) "In situ hybridization: methods and 16 applications" Journal of Clinical Laboratory Analysis, 11(1), 2-9 Griffin DK1, Wilton LJ, Handyside AH, Winston RM, Delhanty JD (1992) Dual fluorescent in situ hybridisation for simultaneous detection of X and Y chromosome-specific probes for the sexing of 17 human preimplantation embryonic nuclei Hum Genet, 89(1),18-22 Valdehi J., Kalol K.R., Kiran K (2002) “Prenatal detection of aneuploidies using fluorescence in situ hybridization for the most common reciprocal translocation t(11;22)” Mol Hum Reprod, 682- 18 690 Hoàng Thị Hương N V T v Đ T H (2014) Ứng dụng kỹ thuật FISH sàng lọc số lệch bội nhiễm sắc thể cho chẩn đoán di truyền 19 tiền làm tổ Tạp chí phụ sản, 12 Yan J., Guilbault E., Masse J.et al (2000) “Optimization of the flurescence in situ hybridization (FISH) tech for high detection efficiency of very small proportions target interphase nucleic” Clin Genet, 309-318 20 Verlinsky Y., Cieslak J., Ivakhnenko V et al (1996) Birth of healthy children after preimplantation diagnosis of common aneuploidies by polar body fluorescent in situ hybridization analysis Preimplantation 21 Genetics Group Fertil Steril, 66(1), 126-129 Wicker N., Carles A., Mills I.G., Wolf M., Veerakumarasivam A., Edgren H., Boileau F., Wasylyk B ,Schalkens J.A., Neal D., Kallioniemi O., Poch O (2007) A new look towards BAC-based array CGH through a comprehensive comparison with oligo-based array CGH BMC 22 Genomics, 8, 84-94 Christian N Paxton Arthur R Brothman Katherine B Geiersbach (2013) Rapid aneusomy detection in products of conception using the 23 KaryoLite™ BACs‐on‐Beads™ assay Wilton L., R W., J M., et al (2001) Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic 24 hybridization N Engl J Med, 345, 1537-1541 Keltz M.D., M V., I S., et al (2013) Preimplantation genetic screening (PGS) with comparative genomic hybridization (CGH) following day single cell blastomere biopsy markedly improves IVF outcomes while lowering multiple pregnancies and miscarriages J Assist Reprod Genet, 25 30, 1333-1339 Alfarawati S., Fragouli E., P C., et al (2011) First births after preimplantation genetic diagnosis of structural chromosome abnormalities using comparative genomic hybridization and microarray 26 analysis Hum Reprod, 26, 1560-1574 Gutiérrez-Mateo C., P C., J S.-G., et al (2011) Validation of microarray comparative genomic hybridization for comprehensive chromosome analysis of embryos Fertily and Sterily, 95, 953-958 27 Geraedts J., M M., MC M., et al (2011) Polar body array CGH for prediction of the status of the corresponding oocyte Part I: clinical 28 results Hum Reprod, 26 (3173-3180) Yang Z., J L., GS C., et al (2012) Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized 29 pilot study Mol Cytogenet Yang Z., SA S., X L., et al (2013) Selection of euploid blastocysts for cryopreservation with array comparative genomic hybridization (aCGH) results in increased implantation rates in subsequent frozen and 30 thawed embryo transfer cycles Mol Cytogenet, Hassold T., N C., J F., et al (1980) A cytogenetic study of 1000 31 spontaneous abortions Ann Hum Genet 44, 151-178 Rubio C., L R., A M., et al (2007) Impact of chromosomal abnormalities on preimplantation embryo development Prenat Diagn 32 27, 748-756 Alfarawati S., E F., P C (2011) The relationship between blastocyst, morphology, chromosomal abnormality, and embryo gender Fertily 33 and Sterily, 95, 520-524 Rubio C., Rodrigo L., Mir P., et al (2013) Use of array comparative genomic hybridization (array-CGH) for embryo assessment: clinical 34 results Fertility and Sterility, Dahdouh E.M., J B., F A., et al (2015) Technical update: preimplantation genetic diagnosis and screening J Obstet Gynaecol 35 Can, 37, 451-463 Kalousek D.K., T P., M T., et al (1993) Early spontaneous abortion: morphologic and karyotypic findings in 3,912 cases Birth Defects Orig 36 Artic Ser, 29, 53-61 Munne S., HU W., J G., et al (1994) Chromosome mosaicism in human embryos Biol Reprod, 51, 373-379 37 Capalbo A., G W., T E., et al (2013) FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage Hum Reprod (Oxford, 38 England), 28, 2298-2307 Brezina P.R., WH K., AP B., et al (2016) Preimplantation genetic screening (PGS) is an excellent tool, but not perfect: a guide to 39 counseling patients considering PGS Fertily and Sterily, 105, 49-50 Brezina P.R., Anchan R., Kearns W.G (2016) Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are 40 the differences? J Assist Reprod Genet 33 (2015) Validation report for next generation sequencing for 41 chromosomes (Ploidy) as compared to CGH microarrays Yin X., Tan K., G V., et al (2013) Massively parallel sequencing for chromosomal abnormality testing in trophectoderm cells of human 42 blastocysts Biol Reprod, 88 Fiorentino F., Biricik A., S B., et al (2014) Development and validation of a nextgeneration sequencing-based protocol for 24-chromosome 43 aneuploidy screening of embryos Fertily and Sterily, 101, 1375-1382 Fiorentino F., Bono S., A B., et al (2014) Application of nextgeneration sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening 44 cycles Hum Reprod, 29, 2802-283 Yang Z., Lin J., J Z., et al (2015) Randomized comparison of nextgeneration sequencing and array comparative genomic hybridization for preimplantation genetic screening: a pilot study BMC Med 45 Genomics, Munne S., D W., J C (2009) Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes Fertily and Sterily, 94, 408-430 46 Fragouli E., M K.-J., S A., et al (2010) Comprehensive chromosome screening of polar bodies and blastocysts from couples experiencing 47 repeated implantation failure Fertily and Sterily, 94, 875-887 Aleksandrova N.V., Shubina E.S., Ekimov A.N., et al (2017) Comparative Results of Preimplantation Genetic Screening by Array Comparative Genomic Hybridization and New Generation Sequencing 48 Molecular Biology, 51 (2), Vanneste E., T V., C M., et al (2009) What next for preimplantation genetic screening? High mitotic chromosome instability rate provides the biological basis for the low success rate Hum Reprod, 24, 2679- 49 2682 Rechitsky S., T P., G.S R., et al (2015) First systematic experience of preimplantation genetic diagnosis for singlegene disorders, and/or preimplantation human leukocyte antigen typing, combined with 24- 50 chromosome aneuploidy testing Fertily and Sterily, 103, 503-512 Wells D., K K., J G., et al (2014) Clinical utilisation of a rapid lowpass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation Med Genet, 51, 51 553-562 Schoolcraft W., D G., L S., et al (1999) Blastocyst culture and transfer: analysis of results and parameters affecting outcome in two in vitro 52 fertilisation programs Fertily and Sterily, 72, 604-609 Ekimov A.N., E.V E., A.N A., et al (2014) In: Abstr 13th Annual Meeting of the Preimplantation Genetic Diagnosis Int Soc (PGDIS), 53 Canterbury, UK Chromosome Res, 22 (4) Wells D., K K., J G., et al (2013) A novel embryo screening technique provides new insights into embryo biology and yields the first pregnancies following genome sequencing Hum Reprod, 28 ... trước chuyển phôi thụ tinh ống nghiệm bao gồm: Trình bày kỹ thuật sàng lọc di truyền trước chuyển phơi Đánh giá vai trò kỹ thuật sàng lọc di truyền trước chuyển phôi thụ tinh ống nghiệm 7 I CÁC...NGUYỄN THỊ BÍCH VÂN GIÁ TRỊ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC DI TRUYỀN TRƯỚC CHUYỂN PHÔI TRONG THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lương Thị Lan... triển trước sau chuyển phôi, ảnh hưởng tới 50% phôi thụ tinh ống nghiệm trước chuyển phôi; 10% tất thai tháng đầu [1] Vì vậy, để tăng tỷ lệ thành công IVF, sàng lọc di truyền trước chuyển phôi