Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen HLA của các đơn vị máu dây rốn tại ngân hàng máu dây rốn cộng đồng viện HH TM trung ương

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trên giới nói chung Việt Nam nói riêng, ghép tế bào gốc phương pháp điều trị đại, triệt để bệnh lý quan tạo máu số bệnh lý khác đặc biệt nhóm bệnh ác tính Theo báo cáo Tổ chức y tế giới (WHO), trung bình năm có khoảng 50.000 ca ghép TBG thực toàn giới số tăng lên nhanh chóng [1] Nguồn tế bào gốc sử dụng cho ghép chủ yếu lấy từ máu ngoại vi, tủy xương máu dây rốn Trong đó, nguồn TBG từ máu dây rốn ngày sử dụng phổ biến Ở Nhật Bản, 50% trường hợp ghép không huyết thống ghép MDR Kết nghiên cứu có so sánh rằng: ghép TBG máu dây rốn thực bệnh nhân người lớn đơn vị máu dây rốn có đủ số lượng TBG [2] TBG máu dây rốn có nhiều ưu điểm như: sẵn có, thu thập dễ dàng mà không ảnh hưởng tới sức khỏe người mẹ thai nhi, u cầu hòa hợp HLA khơng q cao tỷ lệ nhiễm Cytomegalo virus thấp Bên cạnh đó, tỷ lệ tìm thấy hòa hợp HLA mẫu máu dây rốn người cho huyết thồng 25 - 30%, vậy, 75% lại phụ thuộc vào việc tìm kiếm mẫu máu dây rốn phù hợp từ ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Trong tiêu chuẩn lựa chọn đơn vị máu dây rốn phù hợp, tiêu chuẩn hòa hợp HLA bệnh nhân người cho điều kiện quan trọng nhất, định tới thành công ca ghép Điều dẫn đến đời phát triển kỹ thuật xét nghiệm định type HLA Từ kỹ thuật đơn giản kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể đời từ năm 1980 [3] với độ nhạy độ đặc hiệu chưa cao, đến có thêm nhiều kỹ thuật sử dụng tới công nghệ di truyền phân tử Đặc biệt kỹ thuật PCR sử dụng đầu dò đặc hiệu - SSO, giúp cải thiện đáng kể tính xác cho kết định nhóm HLA độ phân giải cao so với kỹ thuật PCR - sử dụng đoạn mồi đặc hiệu SSP [4] hay gọi HLA độ phân giải thấp Các đơn vị máu dây rốn lưu trữ Ngân hàng máu dây rốn Viện HH - TM TW có ưu điểm vượt trội so với ngân hàng khác xét nghiệm HLA độ phân giải cao, nhờ bước đầu mang lại hiệu đáng khích lệ thể khả tìm kiếm cao (97,8%) [5] Để tìm hiểu vai trò xét nghiệm HLA việc tìm kiếm nguồn TBG, tiến hành nghiên cứu: “Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen HLA đơn vị máu dây rốn ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Viện HH - TM Trung ương” với hai mục tiêu: Mô tả đặc điểm kiểu gen HLA đơn vị máu dây rốn Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Viện Huyết học - Truyền máu TW Bước đầu đánh giá khả tìm kiếm đơn vị máu dây rốn cho bệnh nhân có nhu cầu ghép máu dây rốn Viện Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TẾ BÀO GỐC TRONG QUÁ TRÌNH SINH MÁU 1.1.1 Khái niệm tế bào gốc Danh từ tế bào gốc (Stem cells) có từ 60 năm nay, kể từ nghiên cứu thành công tạo colony tế bào lách (CFU - S) nghiên cứu sinh máu chuột (1950) Từ đến nay, dựa tiến khoa học kỹ thuật, người ta phân lập biết trình phát triển thể người động vật tế bào gốc “trùm” (gangleader - stem cells) hay gọi tế bào gốc nguyên thủy (primitive stem cells), hay tế bào gốc toàn (Totipotent stem cells = TSC) Tế bào gốc tế bào có khả sinh sản, tự tái sinh biệt hóa thành tế bào gốc kế cận, phát triển thành TBG có chức riêng, cuối trở thành tế bào trưởng thành toàn thể người động vật [6], [7] 1.1.2 Tế bào gốc sinh máu Các tế bào gốc sinh máu định nghĩa dựa ba đặc trưng bản, khả tự tái tạo, khả biệt hóa đa dòng khả phục hồi hệ tạo máu Ngồi số đặc điểm khác khả di chuyển từ tủy máu, tính mềm dẻo biệt hóa chết theo chương trình [8]  Khả tự tái tạo Bằng chứng rõ ràng khả tự tái tạo TBG việc cung cấp liên tục tế bào máu suốt đời cá thể Khả liên quan chặt chẽ với hoạt tính enzym tổng hợp chuỗi có khả tổng hợp chuỗi DNA Ở người, thời gian tổng hợp chuỗi DNA ngắn trình phân bào TBG, đặc biệt tác động mạnh trình ghép  Khả biệt hóa đa dòng Tế bào gốc sinh máu có khả biệt hóa thành tất tế bào máu, tạo tế bào định hướng dòng tủy dòng lympho Sau đó, tế bào định hướng dòng lympho tiếp tục phân chia biệt hóa thành dòng lympho T, B NK Các tế bào gốc định hướng dòng tủy phân chia biệt hóa thành tế bào đầu dòng bạch cầu hạt, dòng mono, dòng mẫu tiểu cầu, dòng hồng cầu  Khả hồi phục hệ sinh máu Các tài liệu sớm công bố khả phục hồi hệ sinh máu TBG dựa thực nghiệm ghép chuột sau chiếu xạ liều chí tử Tương tự vậy, tế bào gốc người đặc trưng đặc tính quay trở lại tủy xương, tái tạo mô sinh máu Sau trở lại, cư trú tủy xương, tế bào gốc sinh máu tăng sinh, biệt hóa, đáp ứng với tín hiệu kích thích từ mơi trường đệm gian bào 1.1.3 Vị trí sinh máu Sinh máu người đỉnh cao tiến hóa, q trình sinh sản tế bào máu đạt tới mức hoàn thiện với chế điều hòa tinh tế Có thể chia sinh máu người thành thời kỳ là: sinh máu thời kỳ phôi thai, sinh máu thời kỳ sơ sinh trẻ em, cuối sinh máu người trưởng thành Ngay từ tuần thứ phơi, sinh máu bắt đầu hình thành tiểu đảo Woll - Pander, gọi sinh máu trung bì phơi Từ tuần thứ trở đi, sinh máu thực trung mô phôi mà rõ gan lách Đến tháng thứ tủy xương, hạch, tuyến ức bắt đầu trình sinh máu Sinh máu thời kỳ phơi thai q trình biệt hóa khơng ngừng mạnh mẽ Lúc đầu đâu có mảnh trung mơ có sinh máu dần khu trú hẳn tủy xương, lách hạch lympho Các dòng tế bào máu dần hoàn thiện số lượng, hình thái, chức tính kháng ngun bề mặt Sau trẻ em đời, sinh máu khu trú dần quan chính, tủy xương giữ vai trò chủ yếu [9] 1.1.4 Tạo nguồn tế bào gốc sinh máu  Các nguồn tế bào gốc sinh máu  Nguồn tế bào gốc từ tủy xương Nguồn cung cấp tế bào định hướng sinh máu sử dụng cho ghép từ tủy xương người cho Trong 20 năm qua, nguồn cung cấp tế bào gốc cho ghép tủy xương Tế bào CD34+ tủy xương chiếm khoảng 1/100 đến 1/1000 tế bào có nhân tủy [10] Nguồn tế bào gốc từ tủy xương sử dụng cho ghép đồng lồi trường hợp khơng thể huy động TBG máu; thu thập từ tủy người cho hòa hợp tồn phần, có khơng có liên hệ huyết thống Q trình thu nhận tế bào gốc từ tủy xương trường hợp ghép tự thân hay ghép đồng loại tương tự thực phòng mổ vô khuẩn Chọc hút dịch tủy xương xương chậu (gai chậu sau trên), hút nhiều lần, lần - ml với tỷ lệ 10 - 15 ml/kg cân nặng người cho Liều thông thường x 108 tế bào có nhân/kg cân nặng người nhận Thể tích tủy tối đa thu 1500 ml  Nguồn tế bào gốc từ máu ngoại vi Đây nguồn TBG định hướng sinh máu từ tủy xương, huy động máu ngoại vi cách sử dụng yếu tố kích thích tăng trưởng, thường sử dụng G - CSF có kèm khơng kèm hóa trị liệu [11], [12] Số lượng CD34+ tăng lên từ ngày thứ ba đạt cao vào ngày thứ năm thứ sáu [12] Khi số lượng CD34+ lớn 10 tế bào/microlit máu thu khoảng x 106 tế bào CD34/kg cân nặng người cho Một số nghiên cứu cho thấy, có liên quan số lượng TBG thu nhận với thể tích máu lấy Với thể tích máu lớn, nhận tỷ lệ tế bào CD34+ nhiều từ 2,5 đến lần so với tỷ lệ máu thời điểm bắt đầu xử lý [10], [11] Thời gian mọc mảnh ghép có liên quan chặt chẽ với số lượng tế bào CD34+ TBCN thu nhận được, thường phải đảm bảo từ 1x106 đến 5x106 TBCN/kg trọng lượng người nhận Các tế bào gốc máu thu thập máy gạn tách tế bào Hiện nguồn sử dụng cho ghép đồng lồi Các nghiên cứu lâm sàng so sánh sử dụng TBG máu ngoại vi với sử dụng TBG từ tủy cho thấy: kết mọc ghép sớm hơn, khả hồi phục miễn dịch nhanh hơn, tỷ lệ tử vong liên quan đến biến chứng ghép thấp hơn, nguy xuất bệnh ghép chống chủ cấp tương đương hai nhóm bệnh ghép chống chủ mạn lại gặp nhiều bệnh nhân ghép TBG máu ngoại vi huy động [13] Bên cạnh đó, nước phát triển Việt Nam, khó khăn đặt với bệnh nhân khơng có người cho huyết thống, mà ngân hàng TBG từ người cho không huyết thống chưa thành lập, hội ghép TBG gần đóng lại Vì vậy, nhu cầu đặt cần phải có nguồn TBG mới, đảm bảo hiệu mà lại phù hợp với điều kiện đất nước  Nguồn tế bào gốc từ máu dây rốn Năm 1989, lần Gluckman Broxmeyer tiến hành ghép thành công tế bào gốc MDR cho bệnh nhi Fanconi, đến hàng nghìn trường hợp bệnh nhân bị bệnh máu ác tính khơng ác tính điều trị ghép MDR [14], [15] Trong khoảng 15 năm trở lại đây, MDR trở thành nguồn quan trọng cung cấp TBG cho ghép đồng loài Một số ưu điểm vượt trội so với nguồn TBG từ người trưởng thành như: yêu cầu hòa hợp HLA thấp (tối thiểu 4/6 allele HLA - A, - B, - DR độ phân giải cao), trình thu thập không ảnh hưởng đến sức khỏe người hiến, đồng thời lưu giữ sẵn sàng ngân hàng nên thời gian cung cấp rút ngắn, biến chứng liên quan đến ghép chống chủ giảm so với TBG từ người hiến trưởng thành [80] Trong MDR giàu tế bào định hướng sinh máu giai đoạn sớm giai đoạn đa dòng (early and committed progenitor - cell), số lượng tế bào CD34+ từ 1/100 đến 1/10000 TBCN, khả sinh sản gấp lần TBG tủy máu ngoại vi người trưởng thành [16] Cho đến nay, có 4,3 triệu đơn vị máu dây rốn lưu trữ dịch vụ 600.000 đơn vị TBG máu dây rốn lưu trữ cộng đồng tồn giới, qua 30.000 ca ghép TBG nguồn thực thành cơng [81] Tuy vậy, có nhược điểm lượng TBG thu nhỏ, liều TBG đủ ghép cho trẻ em 30kg Giải nhược điểm này, gần số tác giả dùng liều tế bào gốc “pool” mẫu máu cuống rốn có gen HLA tương đồng [17], dùng cho người trưởng thành Tuy nhiên phương pháp có ưu điểm nhược điểm Sử dụng đơn vị khơng phù hợp khơng hồn tồn HLA có nguy bệnh ghép chống chủ độ II cao hơn, tử vong ghép hay GVHD mạn không cao hiệu ứng mảnh ghép chống leucemi trội [99] Muốn làm điều cần có lượng lớn máu dây rốn để lựa chọn Đây mục tiêu việc xây dựng ngân hàng máu dây rốn Xu hướng nghiên cứu tế bào gốc máu dây rốn tập trung vào vấn đề: Tính an tồn hiệu ghép tế bào từ máu dây rốn Khả sử dụng TBG máu dây rốn ghép cho người lớn Mở rộng phạm vi ghép khơng hòa hợp HLA trì an tồn hiệu mọc mảnh ghép Các nghiên cứu lâm sàng trẻ nhận tế bào gốc MDR từ người cho khơng có liên quan huyết thống cho thấy nguy xuất GVHD thấp so với ghép TBG từ tủy xương [18], [19] Điều phù hợp với số lượng thấp T lympho trưởng thành máu dây rốn Thời gian phục hồi dòng tế bào sinh máu có khác nhau, ghép TBG từ máu dây rốn, dòng bạch cầu hạt hồi phục sau 26 đến 27 ngày, dòng tiểu cầu sau 60 ngày, ghép TBG tủy xương thời gian phục hồi bạch cầu hạt tiểu cầu 18 đến 19 ngày 29 ngày [20] Ngồi việc nguồn tế bào gốc quan trọng thay tế bào gốc tủy xương máu ngoại vi, TBG máu dây rốn thực nghiệm lâm sàng chứng minh có khả phục hồi mô bị tổn thương nguồn dồi cho kỹ thuật Tế bào trị liệu, tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem cell: MSC) hay tế bào gốc đa cảm ứng (induced pluripotential stem cell: iPS) tế bào Muse (Multilineage differentiating stress enduring) tách từ đơn vị máu dây rốn Các loại tế bào có khả biệt hóa thành nhiều loại mô tạo cải thiện lâm sàng nhiều bệnh mà ngày y học chưa có phương pháp điều trị Ngồi TBG trung mơ có chức điều hòa miễn dịch cho phép tái tạo mô bị hư hại, chế tượng chưa biết rõ rang [96], [97], [98] 1.1.5 Xử lí bảo quản khối tế bào gốc  Sau mẫu TBG thu thập, chuyển ngân hàng TBG, tiến hành trình xử lý TBG nhằm mục đích có khối TBG tinh nhất, loại bỏ thành phần không cần thiết huyết tương, hồng cầu [21], [22]  Sau trải qua quy trình xử lý, đơn vị TBG tiếp tục trộn với dung dịch bảo quản để bảo vệ tế bào mơi trường đơng lạnh Loại chất bảo quản hiệu dung dịch Dimethyl sulfoxide (DMSO) pha để đạt nồng độ 10% túi sản phẩm cuối Chất bảo quản có tác dụng làm ổn định màng tế bào, tránh tổn thương tế bào tinh thể hình thành trình hạ nhiệt độ lưu trữ dài hạn hệ thống nitơ lỏng nhiệt độ - 1500C đến - 1960C Sau thêm dung dịch bảo quản, đơn vị TBG làm lạnh theo chương trình hạ nhiệt độ máy tự động 1.1.6 Đánh giá kiểm tra chất lượng khối TBG sau bảo quản  Đếm số lượng tế bào có nhân Mọi chế phẩm tế bào gốc cần xác định số lượng tế bào, số lượng tế bào đơn nhân Số lượng kết hợp với xét nghiệm khác, xác định số lần thu hoạch cần thiết để có đủ lượng tế bào đảm bảo cho mọc mảnh ghép Ngồi ra, thơng số giúp tính tốn tỷ lệ tế bào lại sau xử lý cung cấp liệu cho trình kiểm soát chất lượng bước xử lý bảo quản sản phẩm  Đếm tỷ lệ tế bào sống chết phương pháp nhuộm Xanh Trypan Nguyên lý kỹ thuật tổn thương màng tế bào tế bào bị chết dẫn đến chất nhuộm qua màng nhuộm màu tế bào Ngược lại, tế bào sống với toàn vẹn màng tế bào khơng cho chất nhuộm qua, tế bào sống không bắt màu [23] Xét nghiệm đơn giản, tốn cho kết nhanh vòng vài phút xác định dược tỷ lệ sống chết chung, riêng tế bào gốc  Nuôi cấy tạo cụm tế bào tạo máu 10 Các tế bào gốc ni cấy điều kiện có đủ chất dinh dưỡng chất kích thích, chúng tăng sinh biệt hóa thành đơn vị tế bào trưởng thành [23] Phương pháp không xác định tế bào sống mà đánh giá hiệu lực tế bào gốc, đánh giá khả tăng sinh biệt hóa tế bào gốc Tuy nhiên có số nhược điểm tốn kém, nhiều thời gian để đánh giá (7 - 14 ngày), khơng cung cấp kịp thời cho nhà lâm sàng, phụ thuộc nhiều vào chủ quan người đọc, không đánh giá khả tái định cư tế bào gốc Phương pháp chủ yếu sử dụng nghiên cứu TBG  Kỹ thuật xác định tế bào CD34+ sống kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy (Flowcytometry) Nguyên lý kỹ thuật xác định số lượng tế bào CD34+ sống dựa vào 7AAD (7 amino actinnomycin) hay chất nhuộm màu nhân kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang CD45 - FITC/CD34 - PE.7AAD nhuộm nhân trường hợp màng tế bào khơng ngun vẹn hay tế bào chết [24] Xét nghiệm có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, cho kết xác tốn đòi hỏi trang thiết bị đại [25] 1.2 KHÁNG NGUYÊN HỆ BẠCH CẦU 1.2.1 Nguồn gốc, danh pháp  Nguồn gốc HLA (Human Leucocyte Antigen) tên gọi tắt quốc tế kháng nguyên bạch cầu người Nó protein đa dạng bạch cầu sản xuất dạng peptid bào tương, lắp ráp, đưa gắn vào bên màng Thoạt đầu, việc tìm hiểu HLA nhằm mục đích khắc phục tượng bong mảnh ghép Ghép mô hay quan người cho người khác thất bại khơng phù hợp nhóm hồng cầu ABO, dù phù hợp ABO tỷ lệ thất bại 77 Zhou Y.C Cecka J.M (1993) Effect of HLA matching on renal transplant survival Clin Transpl, 499 - 510 78 Larijani B., Esfahani E.N., Amini P cộng (2012) Stem cell therapyin treatment of different diseases Acta Med Iran, 50(2), 79 - 96 79 Nguyễn Trọng Phúc et al (2015) " Bước đầu đánh giá chất lượng thu thập, xử lý máu cuống rốn Bệnh Viện Đa Khoa Quốc Tế VINMEC" Tạp chí y học tập 446 - Hội nghị khoa học Huyết học - Truyền máu toàn quốc 2016 p 591 - 598 80 William Tse and Mary J Laughlin (2005) " Umbilical Cord Blood Transplantation: A New Alternative Option Hematology Am Soc Hematol Educ Program " 377 - 83 81 Karen K Ballen, Eliane Gluckman, and Hal E Broxmeyer (2013) "Umbilical cord blood transplantion: the first 25 years and beyond " Blood 122(4), p 491 - 82 Schrier S.L (1994) Thalassemia: pathophysiology of red cell changes Annu Rev Med, 45, 211- 218 83 La Nasa G., Argiolu F., Giardini C et al (2005) Unrelated bone marrow transplantation for beta - thalassemia patients: The experience of the Italian Bone Marrow Transplant Group Ann N Y Acad Sci, 1054, 186 -195 84 Lê Minh Triết (2015) Tình hình bệnh nhân Thalassemia Việt Nam Tạp Chí Học Việt Nam, 145 - 148 84 Toby Hamblin (2009) " Stem Cell Banking - The Growth of Public and Private Cord Blood Banks " Stem cells, regenerative medicine and society, WORLD STEM CELL REPORT 2009 168 - 71 85 Yoshihisa Kodera, Shigeru Chiba, Shunichi Kato, et al (2012) "Consequences of earthquake on unrelated transplants in Japan" The 38th Annual meeting of EBMT Joint Session 86 Hal E Broxmeyer et al (2011) " Cord Blood: Biology, Transplantation, Banking, and Regulation Bethesda" MD:AABB Press 647 - 662 87 Karen A Sullivan (2006) " Human leukocyt antigens " Ed by Lichtman M.A Pub by Mc Graw - Hill Medical 2137 - 2150 88 Delordson Kallon (2011) Clinical Solid Organ Transplantation Histocompability & Immunogenetics Chapter 8, p 121 - 61 89 David Ansari, Dragan Bucin, and Johan Nilsson (2014) Human leukocyte antigen matching in heart transplantation: systematic review and meta - analysis Transplant International 27(8), p 793 - 804 90 Meerim Park and Jong Jin Seo (2012) "Role of HLA in Hematopoietic Stem Cell Transplantation" Bone Marrow Research 2012, p - 91 I Yakoub - Agha, F Mesnil and M Kuentz et al (2006)."Allogeneic marrow stem - cell transplantationfrom human leukocyteantigenidentical siblings versus human leukocyte antigen - allelicmatched unrelated donors (10/10) in patients with standardrisk hematologic malignancy: a prospective study from the French society of bone marrow transplantation and cell therapy Journal of Clinical Oncology 24(36), p 5695 - 702 92 United Kingdom Paediatric Bone Marrow Transplant Group, British Society for Histocompatibility and Immunogenetics, The British Transplantation Society, et al (2013) " Guidelines for selection and HLA matching of related, adult unrelated donors and umbilical cord units for haematopoietic progenitor cell transplantation" 93 T Sasazuki, T Juji and Y Morishima et al "Effect of matching of class I HLA alleles on clinical outcome after transplantation of hematopoietic stem cells from an unrelated donor" New England Journal of Medicine 339(17), p 1177 - 85 94 E W Petersdorf, C Kollman and C.K Hurley et al (2001)."Effect of HLA class II gene disparity on clinical outcome in unrelated donor hematopoietic cell transplantation for chronic myeloid leukemia: the US National Marrow Donor Program experience" Blood 98(10), p 2922 - 95 G Kogler, J Enezmann, V Rocha et al (2005)."High - resolution HLA typing by sequencing for HLA - A, - B, - C, - DR, - DQ in 122 unrelated cord blood/patient pair transplants hardly improves long - term clinical outcome" Bone Marrow Transplantation 36, p 1033 - 41 96 Laura de Girolamo et al (2013).”Mesenchymal stem/stromal cells: A new cell as drug paradigm Efficacity and critical aspects in cell therapy” Current pharmaceutical design 19 2457 - 73 97 Masaaki kitada, Shohei Wakao, Mari Dezawa (2012).”Muse cell and induced pluripotent stem cell: implication of the elite model” Cell Mol, Life Sci 69: 3739 - 50 98 Shohei Wakao et al (2014).”Multilineage differentiating stress enduring (Muse) cells are the primary source of induced pluripotent stem cell in human fibroblasts” PNAS 108: 9875 - 80 99 Brustein CG, Baker JN, Weisdorf DJ, Defor TE, Miller JS, Blazar BR et al (2007).”Umbilical cord blood transplantation after non myeloablative conditioning: impact on transplantation outcome in 110 adults with hematologic disease”, Blood 110, 3064 - 70 PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU ĐỀ TÀI Sản phụ thai nhi Mã số:………… 1.1 Sản phụ Họ tên mẹ …………………… Hình thức sinh: Tuổi…… Lần sinh con:…… Giới: Nam Thường Mổ Tiền sử sản khoa: Có Không 1.2 Thai nhi phần phụ Tuổi thai:………………… Nữ Cân nặng thai:………gram Chiều dài dây rốn :……cm Cân nặng bánh rau:… gram Mẫu MDR thu thập Ngày thu nhận:…………… Mã số:……………… Nhóm máu ABO/ Rh :… Liều TBCN: ………x 10^ 7/ kg Liều CD 34+:…… x 10^ 6/ kg Thể tích MDR thu thập:…….ml Kết định nhóm HLA:… Dân tộc: ……………………… Bệnh nhân Họ tên:………………… Mã số:…………… Tuổi:…… Cân nặng:……………… kg Nhóm máu ABO/ Rh:… Giới: Nam Nữ Dân tộc:…………………… Chẩn đốn:………………… Kết định nhóm HLA:… Kết tìm kiếm Mức độ hòa hợp HLA Hòa hợp 4/6 Hòa hợp 5/6 Hòa hợp 6/6 Số đơn vị MDR phù hợp BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THU CHANG Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen HLA đơn vị máu dây rốn ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Viện HUYếT HọC - TRUYềN MáU Trung Ương Chuyờn ngnh : Huyt hc - Truyn mỏu Mã số : 60720151 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS NGUYỄN ANH TRÍ TS.BS TRẦN NGỌC QUẾ HÀ NỘI - 2017 LỜI CÁM ƠN Trong q trình học tập hồn thành luận văn, em nhận nhiều bảo tận tình, giúp đỡ to lớn đầy trách nhiệm tình cảm từ Thầy, Cơ, anh chị bác sĩ, kỹ thuật viên, điều dưỡng viên, bạn bè gia đình, đặc biệt bệnh nhân, sản phụ hiến tế bào gốc máu dây rốn cho em số liệu quý giá Với tình cảm biết ơn sâu sắc, em xin kính gửi lời cám ơn chân thành đến: GS.TS.AHLĐ Nguyễn Anh Trí, Viện trưởng Viện Huyết học - Truyền máu TW, Phó chủ nhiệm môn Huyết học - Truyền máu Trường Đại học Y Hà Nội, Thầy dạy bảo, động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập Viện Thầy tận tình hướng dẫn, sửa chữa thiếu sót để hồn thiện luận văn cho em TS Trần Ngọc Quế, Giám đốc Ngân hàng Tế bào gốc Viện Huyết học Truyền máu TW, người thầy hướng dẫn thứ hai em, Thầy hết lòng giúp đỡ, bảo cho em em học tập Ngân hàng Tế bào gốc Thầy trực tiếp truyền lại cho em kiến thức quý báu, điều vô giá trị giúp cho em hồn thiện luận văn GS.TS Phạm Quang Vinh, Chủ nhiệm môn Huyết học - Truyền máu Trường Đại học Y Hà Nội tồn thể Thầy, Cơ mơn, người Thầy nhiệt huyết dành cho em tình cảm tốt đẹp, kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt trình học tập làm luận văn TS Bạch Quốc Khánh, Viện phó Viện Huyết học - Truyền máu TW, BSCKII Võ Thị Thanh Bình, Trưởng khoa Ghép tế bào gốc, có đóng góp quý báu cho luận văn em Tập thể Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Thầy, Cô, anh chị Trung tâm Tế bào gốc, khoa Ghép tế bào gốc tạo máu nhiều khoa phòng khác ln tạo điều kiện cho em trình học tập trình thu thập số liệu cho nghiên cứu Phòng Quản lý đào tạo sau đại học trường Đại học Y Hà Nội dành quan tâm đặc biệt, tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn cụ thể giúp em hồn thành khóa học nội trú Em xin cám ơn Thầy, Cô dành cho em góp ý chân thành cho luận văn em Cám ơn gia đình, bố mẹ, anh chị em thân yêu động viên, hỗ trợ để tập trung học tập hoàn thành tốt luận văn Cám ơn người bạn yêu quý giúp đỡ, động viên, chia sẻ kiến thức cho suốt thời gian học Lời cuối cùng, em xin cám ơn bệnh nhân, người hiến tế bào gốc cho em số liệu quý giá, nhờ mà luận văn em hoàn thành Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 25 tháng 08 năm 2017 Học viên Nguyễn Thu Chang LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nghiên cứu riêng Những số liệu nghiên cứu có thật, tơi thu thập cách tỷ mỉ xác Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Kết nghiên cứu nhằm phục vụ mục đích khoa học, khơng nhằm mục đích riêng khác Các tài liệu trích dẫn công nhận Hà Nội, ngày 25 tháng 08 năm 2017 Học viên Nguyễn Thu Chang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN CD Acid Deoxyribonucleic Cụm kháng nguyên biệt hóa (Cluster of differreciation) CDC (Complement Dependent CytotoxicityTest) DMSO G - CSF (Granulocyte colony - stimulating factor) GVHD (Graft - versus - host disease) HH - TM HLA (Totipotent stem cells) WHO (World Health Organization) Yếu tố phát triển dòng bạch cầu hạt Bệnh ghép chống chủ Kháng nguyên bạch cầu người Máu dây rốn (Major Histocompatibility Complex) NK (Polemerase Chain Reaction) SC (Stem cells) TBCN TBG TSC Dimethyl Sulfoxide Huyết học - Truyền máu (Human Leucocyte Antigen) MDR MHC (Natural killer cell) PCR Kỹ thuật vi độc tế bào phụ thuộc bổ thể Phức hệ hòa hợp mô chủ yếu Tế bào diệt tự nhiên Phản ứng chuỗi trùng hợp Tế bào gốc Tế bào có nhân Tế bào gốc Tế bào gốc toàn Tổ chức y tế giới MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TẾ BÀO GỐC TRONG QUÁ TRÌNH SINH MÁU 1.1.1 Khái niệm tế bào gốc .3 1.1.2 Tế bào gốc sinh máu 1.1.3 Vị trí sinh máu .4 1.1.4 Tạo nguồn tế bào gốc sinh máu .5 1.1.5 Xử lí bảo quản khối tế bào gốc 1.1.6 Đánh giá kiểm tra chất lượng khối TBG sau bảo quản 1.2 KHÁNG NGUYÊN HỆ BẠCH CẦU 10 1.2.1 Nguồn gốc, danh pháp 10 1.2.2 Cấu trúc hệ kháng nguyên bạch cầu 12 1.2.3 Phân bố gen HLA thể 16 1.2.4 Chức HLA 17 1.2.5 Kỹ thuật định danh HLA kháng thể kháng HLA 17 1.2.6 Kỹ thuật định danh kháng thể kháng HLA 20 1.2.7 Ứng dụng HLA lĩnh vực ghép .20 1.2.8 Một số ứng dụng lâm sàng khác HLA 24 1.2.9 Các nghiên cứu tần suất HLA 25 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 29 2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 30 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu .30 2.3.2 Các bước tiến hành nghiên cứu 30 2.3.3 Nội dung nghiên cứu 31 2.3.4 Các số nghiên cứu 31 2.3.5 Vật liệu nghiên cứu, hóa chất, trang thiết bị .32 2.3.6 Các tiêu chuẩn .33 2.3.7 Các quy trình áp dụng 33 2.3.8 Xử lí phân tích số liệu 34 2.4 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 34 Chương 3: KẾT QUẢ 36 3.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .36 3.1.1 Đặc điểm sản phụ thai nhi 36 3.1.2 Đặc điểm đơn vị máu dây rốn thu thập 37 3.1.3 Đặc điểm bệnh nhân có nhu cầu tìm kiếm đơn vị MDR phù hợp 39 3.2 ĐẶC ĐIỂM KIỂU GEN HLA CỦA CÁC ĐƠN VỊ MÁU DÂY RỐN .40 3.2.1 Đặc điểm tần suất allele HLA locus .40 3.2.2 Đặc điểm tổ hợp haplotype locus HLA 46 3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TÌM KIẾM ĐƠN VỊ MDR PHÙ HỢP HLA 50 Chương 4: BÀN LUẬN .54 4.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 54 4.1.1 Đặc điểm sản phụ thai nhi 54 4.1.2 Đặc điểm đơn vị máu dây rốn thu thập 56 4.1.3 Đặc điểm bệnh nhân tìm kiếm TBG máu dây rốn 58 4.2 ĐẶC ĐIỂM KIỂU GEN HLA CỦA CÁC ĐƠN VỊ MÁU DÂY RỐN 60 4.2.1 Đặc điểm tần suất allele HLA locus .60 4.2.2 Đặc điểm tổ hợp haplotype allele HLA thường gặp .70 4.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TÌM KIẾM ĐƠN VỊ MÁU DÂY RỐN HỊA HỢP HLA 75 4.3.1 Tỷ lệ bệnh nhân tìm đơn vị MDR hòa hợp HLA .75 4.3.2 Tỷ lệ bệnh nhân tìm đơn vị MDR đủ liều tế bào gốc 76 4.3.3 Tỷ lệ bệnh nhân tìm thấy đơn vị MDR phù hợp theo cân nặng 77 4.3.4 Xác suất tìm kiếm đơn vị máu dây rốn hòa hợp HLA 78 KẾT LUẬN 81 KIẾN NGHỊ 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Số gen HLA phát .13 Bảng 1.2 Một số đặc điểm phân bố gen HLA thể .16 Bảng 3.1 Đặc điểm chung sản phụ hiến máu dây rốn 36 Bảng 3.2 Một số đặc điểm thai nhi 36 Bảng 3.3 Đặc điểm chung đơn vị MDR 37 Bảng 3.4 Đặc điểm thể tích tế bào đơn vị MDR 38 Bảng 3.5 Đặc điểm bệnh nhân có nhu cầu tìm kiếm MDR 39 Bảng 3.6 Tỷ lệ gặp allele HLA - A 41 Bảng 3.7 Tỷ lệ gặp allele HLA - B 42 Bảng 3.8 Tỷ lệ gặp allele HLA - C 43 Bảng 3.9 Tỷ lệ gặp allele HLA - DRB1 44 Bảng 3.10 Tỷ lệ gặp allele HLA - DQB1 45 Bảng 3.11 Tỷ lệ gặp số hai tổ hợp allele HLA phổ biến 46 Bảng 3.12 Tỷ lệ gặp số tổ hợp allele HLA phổ biến 48 Bảng 3.13 Tỷ lệ gặp số tổ hợp allele HLA phổ biến 49 Bảng 3.14 Tỷ lệ gặp số tổ hợp allele HLA phổ biến 50 Bảng 3.15 Tỷ lệ tìm thấy đơn vị MDR hòa hợp HLA 50 Bảng 3.16 Tỷ lệ tìm đơn vị MDR hòa hợp HLA đủ liều tế bào tối thiểu 51 Bảng 3.17 Tỷ lệ tìm đơn vị MDR hòa hợp HLA phù hợp theo cân nặng bệnh nhân 51 Bảng 3.18 Tỷ lệ tìm đơn vị MDR hòa hợp HLA có liều TBCN tối ưu 52 Bảng 4.1 Số lượng họ allele HLA số nghiên cứu 60 Bảng 4.2 Tỷ lệ % số allele HLA - A số quần thể 62 Bảng 4.3 Tỷ lệ % số allele HLA - B số quần thể 64 Bảng 4.4 Tỷ lệ % số allele HLA - C số quần thể 66 Bảng 4.5 Tỷ lệ % số allele HLA - DRB1 số quần thể 67 Bảng 4.6 Tỷ lệ % số allele HLA - DQB1 hay gặp số quần thể 69 Bảng 4.7 Tỷ lệ % số tổ hợp allele HLA - A* - B* hay gặp số quần thể 70 Bảng 4.8 Các tổ hợp allele hay gặp số quần thể nghiên cứu .71 Bảng 4.9 Các tổ hợp allele hay gặp số quần thể nghiên cứu .72 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố số lượng đơn vị TBG theo liều TBCN tối thiểu 39 Biểu đồ 3.2 Số lượng họ allele HLA phân tích .40 Biểu đồ 3.3 Xác suất tìm kiếm đơn vị máu dây rốn hòa hợp HLA 53 Biểu đồ 4.1 Xác suất tìm kiếm đơn vị MDR hòa hợp ngân hàng MDR cộng đồng Nhật Bản 80 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc tên HLA 12 Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc gen hệ HLA .13 Hình 1.3 Cấu trúc MHC lớp I lớp II 15 Hình 1.4 Rãnh gắn peptid kháng nguyên 16 Hình 1.5 Mối liên quan mức độ bất đồng HLA hiệu ghép 24 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 35 ... hành nghiên cứu: Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen HLA đơn vị máu dây rốn ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Viện HH - TM Trung ương với hai mục tiêu: Mô tả đặc điểm kiểu gen HLA đơn vị máu dây rốn Ngân. .. bào gốc ngân hàng để tìm kiếm nguồn TBG đồng loài phù hợp HLA Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU  3000 đơn vị máu dây rốn ngân hàng máu dây rốn cộng đồng xét... máu dây rốn Ngân hàng máu dây rốn cộng đồng Viện Huyết học - Truyền máu TW Bước đầu đánh giá khả tìm kiếm đơn vị máu dây rốn cho bệnh nhân có nhu cầu ghép máu dây rốn Viện 3 Chương TỔNG QUAN TÀI