Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá ruột thuộc họ heterophyidae ký sinh gây bệnh trên người và động vật tại việt nam TT

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ ĐƠN VỊ MÃ HÓA RIBOSOME CỦA MỘT SỚ LỒI SÁN LÁ RUỘT THUỘC HỌ HETEROPHYIDAE KÝ SINH GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021 Cơng trình hồn thành Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Lê Thanh Hòa Viện Công nghệ sinh học PGS.TS Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS.TS Kim Văn Vạn Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS Lê Trần Anh Học viện Quân Y Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Quang Huy Trường Đại học KHTN Hà Nội Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ Phiên thức Viện Cơng nghệ sinh học, 18 Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Viện Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Sán ruột nhỏ (SLRN) họ Heterophyidae lây nhiễm sang người thông qua cá (do ăn cá chưa nấu chín) co ít nhất 29 loài thuộc 13 chi (genus) phân bô khắp thế giới Khoảng triệu người bị nhiễm bệnh SLRN (heterophyidiasis), hầu hết sông nước Châu Á, bao gồm Hàn Quôc, Trung Quôc, Đài Loan, Việt Nam, Lào, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin Ấn Độ Thực tế báo cáo còn chưa đầy đủ về tình hình nhiễm phòng chông SLRN chẩn đốn phát còn thiếu sơ liệu từ nhiều quôc gia còn chưa chính xác Một sô dạng sinh trưởng của chúng (trứng), ấu trùng lông (redia), ấu trùng đuôi (cercariae) ấu trùng nang (metacercariae) co hình thái giơng lồi khác Mặc dù vậy, 100 năm qua, loài SLRN bản đã được xếp vào chi riêng biệt tương ứng sở phân loại hình thái học (HTH), co bổ sung kết hợp dữ liệu sinh học phân tư (SHPT) Chỉ thị phân tư (molecular genetic marker) công nghệ thao tác công cụ phân tích phân tư đã gop phần to lớn nghiên cứu ứng dụng Nguồn cung cấp chỉ thị phân tư trình tự DNA amino acid suy diễn (nếu co) của hệ gen ty thể (mitochondrial genome, mtDNA) hệ gen nhân (nuclear genome, nDNA), trước hết đơn vị mã hoa ribosome (rTU) Trình tự mtDNA cần thiết cho sư dụng bao gồm tồn hệ gen, sơ gen hay tồn sô gen mã hoa protein (protein coding gene, PCG) gen RNA ribosome ty thể (mitoribosomal gene, MRG) Dữ liệu trình tự DNA của đơn vị mã hoa ribosome (ribosomal transcription unit, rTU), cũng được khai thác sư dụng Nhu cầu ứng dụng SHPT làm sáng tỏ điều kiện vị trí phân loại, môi quan hệ về lồi/chi/họ/liên họ liên họ/phân rất lớn Đơi với SLRN, co thêm nghiên cứu phân loại học dựa phân tích chỉ thị phân tư của họ Heterophyidae liên họ Opisthorchioidea/phân Opisthorchiata cần thiết để cơng nhận chính xác danh pháp mỡi lồi/chi/họ Đo cũng dữ liệu khai thác tạo sở cho chương trình phòng chơng kiểm sốt sán ruột nhỏ qua thức ăn/cá truyền lây hoặc tái xuất thế giới Xuất phát từ nhu cầu yêu cầu thực tế, nhằm bổ sung dữ liệu mtDNA rTU của sơ lồi SLRN lưu hành Việt Nam, chúng tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể đơn vị mã hóa ribosome số lồi sán ruột thuộc họ Heterophyidae ký sinh gây bệnh người động vật Việt Nam” Tính cấp thiết luận án Cho đến dữ liệu mtDNA rTU hoàn chỉnh gần hoàn chỉnh của lớp Sán (class Trematoda) chưa bao phủ hết tất cả chi họ, kể cả họ Heterophyidae Do vậy, giải trình, phân tích khai thác dữ liệu mtDNA rTU của sán noi chung của SLRN noi riêng, đo co loài họ Heterophyidae được đẩy mạnh những năm gần Thực tế, cho đến đề tài tiến hành, họ Heterophyidae chỉ mới co mtDNA hoàn chỉnh được thu nhận phân tích Trong đề tài chúng tơi chọn SLRN lồi Haplorchis taichui Nishigori, 1924 (mẫu Việt Nam) để nghiên cứu gen học hệ gen ty thể đơn vị mã hoa ribosome Ngoài ra, loài Haplorchis pumilio Looss, 1899, cũng được chọn để nghiên cứu rTU sô SLRN khác họ Heterophyidae phục vụ sô chỉ tiêu nghiên cứu của đề tài Các chỉ thị toàn phần phần mtDNA rTU của loài SLRN họ Heterophyidae những dữ liệu gen học lần được công bô từ kết quả nghiên cứu của đề tài, vậy, dữ liệu rất co giá trị cho nghiên cứu ứng dụng tiếp theo Mục tiêu nghiên cứu “Thu được toàn hệ gen ty thể đơn vị mã hóa ribosome của sớ lồi sán ruột nhỏ họ Heterophyidae Việt Nam, phân tích đặc điểm của gen hệ gen nhằm phục vụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử ứng dụng chẩn đoán phân loại ” Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu tập trung giải quyết hai nội dung chính sau: Nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể loài sán ruột nhỏ Haplorchis taichui, phân tích đặc điểm gen xây dựng phả hệ Nghiên cứu giải trình tự đơn vị mã hóa ribosome của sớ lồi sán ruột nhỏ (Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio), phân tích đặc điểm gen xây dựng phả hệ Những đóng góp luận án + Đã giải trình tự toàn hệ gen ty thể của loài SLRN Haplorchis taichui, xác định cấu trúc sắp xếp gen/hệ gen ty thể của SLRN H taichui; đã phân tích đầy đủ đặc điểm gen cấu trúc bậc hai của MRG (12S 16S), gen tRNA vùng không mã hoa của mtDNA của H taichui + Đã phân tích phương thức sư dụng nucleotide, giá trị “độ lệch” (“skew”) mtDNA, đặc điểm gen sự “thiên vị” sư dụng mã của PCG khoảng cách di truyền giữa H taichui loài sán khác họ Heterophyidae họ Opisthorchiidae dựa cộng hợp amino acid của ba PCG (cob+nad1+cox1) 12 PCG; đã phân tích mơi quan hệ về lồi xây dựng thành công phả hệ SLRN dựa chuỗi amino acid cộng hợp của ba PCG (cob+nad1+cox1) của 12 PCG + Đã giải trình tự toàn phần mã hoa ribosome của loài SLRN Haplorchis taichui H pumilio, xác định cấu trúc rTU sắp xếp gen/vùng giao gen; đã phân tích đầy đủ đặc điểm gen cấu trúc bậc hai của gen 5.8S, 18S, 28S rRNA, vùng giao gen ITS-1 ITS-2 của rTU của Haplorchis taichui H pumilio + Đã phân tích phương thức sư dụng nucleotide, giá trị “độ lệch” (“skew”) rTU, khoảng cách di truyền mức độ tương đồng của gen 18S, 28S, 18S+28S rRNA phần mã hoa rTU giữa H taichui loài SLRN khác họ Heterophyidae dựa gen rRNA rTU; đã phân tích mơi quan hệ về lồi xây dựng thành công phả hệ H taichui H pumilio dựa gen 28S rRNA cộng hợp hai gen 18S+28S rRNA toàn phần Bên cạnh đo, sở dữ liệu mtDNA của SLRN H taichui thu thập Việt Nam (chủng QT3) được so sánh với H taichui (mẫu của Lào) lồi M yokogawai (mẫu Hàn Qc) về đặc điểm gen/hệ gen phả hệ Tương tự, sở dữ liệu rTU của H taichui H pumilio thu thập Việt Nam cũng được so sánh với loài cùng họ Heterophyidae, Cryptocotyle lingua (Nga) Euryhelmis costaricensis (Nhật Bản), về đặc điểm gen/vùng giao gen, cấu trúc bậc hai, tương đồng phả hệ Luận án đã giải quyết thành công nghiên cứu gen học mtDNA của H taichui rTU của H taichui H pumilio, gop phần cung cấp sở dữ liệu gen, đặc điểm gen/hệ gen cần thiết cho nghiên cứu tiến hoa, phả hệ, nguồn gôc làm sáng tỏ danh pháp, loài, họ để co sở đề xuất phương thức phòng chông bệnh KST Bố cục luận án Luận án gồm 149 trang, phần Mở đầu (2 trang), phần Kết luận Kiến nghị (2 trang), phần Danh sách công bô (1 trang), phần Tom tắt luận án tiếng Anh (8 trang) phần Tài liệu tham khảo (20 trang) Ngoài phần Lời cảm ơn; Lời cam kết; Mục lục; Danh mục chữ viết tắt; Danh mục bảng; Danh mục hình; Luận án bao gồm chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu (40 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (15 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (39 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả (22 trang) Luận án gồm 11 Bảng chính; 29 Hình chính; Bảng phụ lục; Hình phụ lục Luận án co 178 tài liệu tham khảo (14 tài liệu tiếng Việt 164 tài liệu tiếng Anh) CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu sán ruột nhỏ họ Heterophyidae Phân loại sán ruột nhỏ họ Heterophyidae Sán ruột nhỏ họ Heterophyidae lây nhiễm sang người thông qua thực phẩm (cá chưa nấu chín), ít nhất co 29 loài thuộc 13 chi (genus) phân bô khắp thế giới, khoảng triệu người bị nhiễm bệnh, đo cũng bệnh động vật lây sang người (ĐVLSN) loài họ gây Theo Chai, Jung (2017), SLRN họ Heterophyidae gồm loài thuộc chi Haplorchis (H taichui, H pumilio, H yokogawai, H vanissimus), chi Metagonimus (M yokogawai, M takahashii, M miyatai, M minutus M katsuradai), chi Stellantchasmus (S falcatus), chi Centrocestus (C formosanus, C armatus, C cuspidatus C kurokawai), chi Heterophyes (H heterophyes, H nocens, H dispar H aequalis), chi Pygidiopsis (P summa P genata), chi Heterophyopsis (H continua), Stictodora (S fuscata S lari), chi Procerovum (P varium P calderoni), chi Acanthotrema (A felis), chi Apophallus (A donicus), chi Ascocotyle (A longa) chi Cryptocotyle (C lingua) Theo Dòng phân loại (Lineage), sau: cellular organisms; Eukaryota; Opisthokonta; Metazoa; Eumetazoa; Bilateria; Protostomia; Spiralia; Lophotrochozoa; Opisthorchiata; Platyhelminthes; Heterophyidae; Trematoda; (Centrocestus; Digenea; Opisthorchiida; Haplorchis; Metagonimus; Procerovum; Stellantchasmus) Theo Hệ thông thông tin phân loại tích hợp (ITIS, Integrated Taxonomic Information System)/ https://www.itis.gov/), cấp bậc phân loại: + Thuộc Ngành (Phylum): Sán dẹt (Platyhelminthes Minot, 1876); Dưới Ngành (Subphylum): Neodermata + Thuộc Lớp (Class): Sán (Trematoda, Rudolphi, 1808); Dưới Lớp (Subclass): Digenea, Carus, 1863 + Thuộc Bộ (Order): Opisthorchiida/(Plagiochiida); Phân Bộ (Suborder): Opisthorchiata La Rue 1957 + Thuộc Liên Họ (Superfamily): Opisthorchioidea Looss, 1899 + Thuộc Họ (Family): Heterophyidae Leiper, 1909 - Thuộc Chi (Genus): Haplorchis Looss, 1899 Loài (Species): Haplorchis taichui Nishigori, 1924 Loài (Species): Haplorchis pumilio Looss, 1896 Loài (Species): Haplorchis yokogawai Katsuta, 1932 - Thuộc Chi (Genus): Stellantchasmus Looss, 1899 Loài (Species): Stellantchasmus falcatus Onji et Nishio, 1916 - Thuộc Chi (Genus): Metagonimus Katsurada, 1912 Loài (Species): Metagonimus yokogawai Katsurada, 1912 Các loài được chọn làm đôi tượng chủ yếu nghiên cứu của đề tài Haplorchis taichui Nishigori, 1924; Haplorchis pumilio Looss, 1896 Nghiên cứu phân bố sán ruột nhỏ Sán ruột nhỏ truyền qua cá rất phổ biến thế giới, tập trung nước châu Á Haplorchis taichui H pumilio phân bô xuyên suôt Đông Á, Đông Nam Á sang Tây Á Bắc Phi, bao gồm Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Nam Trung Quôc, Đài Loan, Philippin, Hawaii, Ai Cập, Palestine, Iraq, Ấn Độ, Sri Lanka, Bangladesh Malaysia Hai mươi tám lồi sán ruột nhỏ (15 lồi phở biến 14 lồi ít phở biến) gây nhiễm từ cá truyền sang người, nguồn nhiễm phân bô địa lý đã được ghi nhận (Hình 1.4) Ở Việt Nam, nhiều loài SLRN thuộc họ Heterophyidae ký sinh chủ yếu động vật người được điều tra xác định HTH SHPT 20 tỉnh/thành, đo co 16 tỉnh phía Bắc, tỉnh miền Trung tỉnh phía Nam Tuy nhiên điều tra SLRN còn chưa phủ khắp cả nước, tổng kết sô liệu còn chưa hợp lý, được thực thường xuyên phía Bắc so với miền Trung phía Nam Mặc dù vậy, những sô liệu thu thập được xác minh lồi đã giúp cho cơng tác phòng chơng hiệu quả thiết thực Mẫu SLRN họ Heterophyidae của nghiên cứu đã được thẩm định SHPT sư dụng chỉ thị ITS-2 18S, 28S ribosome; ty thể (cox1, nad1, cob…) so sánh thành phần chuỗi gen, khoảng cách di truyền, phả hệ, nguồn gôc lồi H pumilio, H taichui của Việt Nam qc tế Hình 1.4 Phân bơ tồn cầu của SLRN Haplorchis spp (H taichui, H pumilio H yokogawai) dựa sự diện của vòng đời của chúng được mô tả (Nguồn: Chai, 2019) 1.2 Đặc điểm hệ gen ty thể đơn vị mã hóa ribosome ứng dụng Đặc điểm hệ gen ty thể Hệ gen ty thể động vật, kể cả KST đa bào, vòng DNA khép kín, co độ dài khoảng 13–25 nghìn nucleotide, chứa 12–13 gen PCG, gồm phức hợp cytochrome oxidase subunit 1–3 (cox1; cox2; cox3); phức hợp enzyme nicotinamide dehydrogenase subunit 1–6 (nad1; nad2; nad3; nad4; nad4L, nad5; nad6); gen cytochrome b (cob hay cytB) gen adenosine triphosphate synthase Fo subunit (atp6) Ở KST không co gen atp8 Ngoài còn co gen RNA ribosome ty thể (MRG), 22 gen tRNA vận chuyển vùng không mã hoa (NCR), dài ngắn khác Ty thể tồn hàng trăm đến hàng nghìn bản tế bào, thể đơn bội, di truyền dòng mẹ, không tái tổ hợp, mtDNA co tỷ lệ biến đổi nucleotide cao bền với thời gian Các gen PCG sán dẹt (Ngành Platyhelminthes) sư dụng mã ATG, GTG TAA, TAG làm khởi đầu kết thúc gen; được dịch mã mã di truyền ty thể riêng của sán (bảng sô 9, GenBank), co tên gọi “Echinoderm Mitochondrial Genetic Code” Thành phần nucleotide sư dụng thiên về A+T mã thiên về nhiều nhất (Phe, Leu) ít nhất (Gln, Arg), tùy loài mtDNA co MRG rrnL (hay 16S rRNA) rrnS (hay 12S rRNA); 22 tRNA vận chuyển co cấu trúc bậc hai gấp khúc, dạng giông “lá sồi” (clover leaf), chia làm cánh tay (arm): AA arm (cánh tay tiếp nhận amino acid); DHU-arm (cánh tay dihydrouridine (DHU)); TC-arm (cánh tay TC); AC-arm (cánh tay “đôi mã”/anticodon) Ở sán dẹt, DHU-arm co bị khuyết tRNA Ser hoặc/và tRNALeu Vùng không mã hoa, NCR (hay D-loop; control region) không chứa gen, thường co chuỗi lặp (các cấu trúc) liền kề gọi TRU, từ vài đến chục đơn vị, dài ngắn khác (60 bp – 319 bp sán lá) Đặc điểm đơn vị mã hóa ribosome Đơn vị mã hoa ribosome (rTU) sắp xếp nôi tiếp thành dãy; mỗi đơn vị dài khoảng 7–10 kb, khung đặc trưng là: 5’-18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S-IGS(ETS)-3’, chứa gen rRNA mã hoa ribosome (18S, 5.8S 28S rRNA), vùng giao gen, lần lượt ITS-1 ITS-2 vùng bản lề (IGS) nôi rTU với Các gen rRNA ITS đều co cấu trúc bậc hai gồm nhiều nhánh “kẹp toc” (hairpin) “vòm” (loop) phức tạp Chuỗi gen 18S rRNA 28S rRNA bảo tồn cao giữa lồi, sơ vùng/miền (domain) 28S rRNA được ký hiệu D1–D12, co mức độ sai khác lớn, đo trước chuỗi D1–D3 (khoảng 1,1–1,2 kb), ngày xu hướng toàn (3,8–3,9 kb) cộng hợp 18S+28S rRNA (khoảng 5,8–5,9 kb) đôi tượng khai thác đa dạng so sánh phân tích phả hệ quan hệ về loài sán Ứng dụng mtDNA rTU Bất kỳ gen hay toàn mtDNA hay rTU đều được sư dụng nghiên cứu chẩn đoán, di truyền, dịch tễ, phân tích phân loại, quan hệ tiến hoa, phả hệ, truy xuất nguồn gơc lồi Các chỉ thị mtDNA sư dụng được trích xuất từ cob, cox1, nad1, nad3, atp6; 12S 16S rRNA Các chỉ thị rTU thường sư dụng phần hay toàn phần gen 18S 28S ribosome Vùng giao gen ITS-1 ITS-2 cũng được tận dụng cho phân loại, chẩn đoán di truyền quần thể, nhiên cần chú ý cấu trúc lặp ITS co thể cản trở độ chính xác so sánh loài Phân tích phả hệ quan hệ lồi tơt nhất toàn amino acid cộng hợp của nhiều gen ( 2–3 gen) hay toàn 12 PCG của mtDNA hoặc/và tồn ch̃i 18S, 28S hoặc cộng hợp 18S+28S rRNA của rTU đơi với lồi/họ/lớp sán dẹt sán 1.3 Ý nghĩa sự cần thiết nghiên cứu đặc điểm mtDNA rTU sán ruột nhỏ Hệ gen ty thể rTU gần hoàn chỉnh hoàn chỉnh của hàng chục loài sán đã được thu nhận phân tích đầy đủ, cung cấp nguồn dữ liệu đa dụng Tuy nhiên, sở dữ liệu mtDNA rTU vẫn còn thiếu rất nhiều nghiên cứu đặc điểm gen/hệ gen, quan hệ loài/họ phả hệ đơi với lồi SLRN họ Heterophyidae, đơi tượng trực tiếp của nghiên cứu Do đo, nghiên cứu tập trung giải quyết vấn đề chính: + Giải trình tự toàn mtDNA của loài SLRN Haplorchis taichui của Việt Nam; sư dụng phương pháp tin-sinh học phân tích đặc điểm gen/hệ gen, khẳng định vị trí phân loại, phả hệ di truyền quần thể của loài H taichui họ Heterophyidae nghiên cứu + Giải trình tự toàn rTU của loài SLRN H taichui H pumilio (Việt Nam), phân tích đặc điểm gen/vùng giao gen, ứng dụng chỉ thị gen 18S/28S rRNA ribosome để nghiên cứu phả hệ phân loại loài họ Heterophyidae lớp Sán thuộc ngành Sán dẹt CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Được phân chia liệt kê mục sau: 2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm nghiên cứu + Đôi tượng vật liệu nghiên cứu: SLRN H taichui H pumilio + Mẫu nghiên cứu của loài thuộc họ Heterophyidae: Xác định HTH SHPT sư dụng 2–5 chỉ thị phân tư co từ mtDNA rTU + Địa điểm thời gian nghiên cứu: Thực Viện Công nghệ sinh học (Viện HL KH CN Việt Nam) Thời gian: 2014–2019 11 của loài sán dẹt Độ dài của 22 tRNA từ 60 bp (ở tRNA Val) đến 73 bp (ở tRNAGlu), đa phần 62–64 bp, cấu trúc bậc hai co dạng hình “lá sồi” (clover leaf); chỉ co tRNASer1 bị khuyết thiếu cánh tay DHU 3.1.3 Đặc điểm vùng khơng mã hóa ở hệ gen ty thể Vùng NCR mtDNA của H taichui giới hạn giữa tRNAGlu tRNAGly (độ dài 1.692 bp); gồm tiểu vùng Tiểu vùng thứ nhất chứa cấu trúc lặp TRU1 TRU2 (182 bp/mỗi cấu trúc); Tiểu vùng thứ hai chứa cấu trúc lặp, TRU3–4–5 (183 bp/mỗi cấu trúc) Vùng NCR của H taichui (mẫu Lào) tương tự; mtDNA của loài M yokogawai (Hàn Quôc) co 3,4 đơn vị lặp liền kề ngắn STR1–3.4 (174 bp/một chuỗi) 2,9 đơn vị lặp liền kề dài LTR1–2.9 (311 bp/mỗi chuỗi) 3.1.4 Phương thức sử dụng nucleotide tính toán giá trị độ lệch (“skew”) hệ gen ty thể Bảng 3.2 Tỷ lệ sư dụng thành phần nucleotide A, T, G, C giá trị độ lệch (skew/skewness) sư dụng của gen mã hoa protein (PCG), gen riobosome ty thể (MRG) toàn hệ gen ty thể của loài SLRN ho Heterophyidae Độ dài (bp) A (%) T (%) G (%) C (%) A+T (%) ATskew G+C (%) GCskew mtDNA 15.120 19.56 39.71 28.35 12.38 59.27 –0.340 40.73 0.392 PCGs 10.164 17.02 43.06 27.99 11.92 60.08 –0.433 39.92 0.403 Loài HETEROPHYIDAE Haplorchis (VN) taichui (MG972809) Haplorchis (LA) taichui (KF214770) Metagonimus yokogawai (KR) (KC330755) MRGs 1.730 22.25 34.97 29.36 13.42 57.22 –0.222 42.78 0.373 mtDNA 15.131 19.56 39.67 28.34 12.42 59.23 –0.340 40.97 0.390 PCGs 10.164 17.02 43.08 27.96 11.93 60.11 –0.434 39.89 0.402 MRGs 1.728 22.34 35.01 29.28 13.37 57.35 –0.221 42.65 0.373 mtDNA 15.258 17.79 37.89 30.11 14.21 55.68 –0.361 44.32 0.359 PCGs 10.245 15.31 40.65 29.68 14.35 55.96 –0.453 44.04 0.348 MRGs 1.736 19.93 34.22 30.82 15.03 54.15 –0.264 45.85 0.344 Ghi chú: A: Adenine; T: Thymine; G: Guanine; C: Cytosine PCGs: protein-coding genes (các gen mã hoa protein); MRGs: mitoribosomal genes (các gen ribosome ty thể); mtDNA: toàn hệ gen ty thể VN: Việt Nam; LA: Lào; KR: Hàn Quôc Rõ ràng tỷ lệ sư dụng nucleotide mtDNA, PCG MRG của H taichui (Việt Nam) đều thông nhất theo mô hình (T > G > A > C), “thiên vị” về sư dụng 12 A+T G+C Ở mtDNA, tổng thể thành phần A+T 59,27% G+C 40,73%, giá trị độ lệch (skew/skewness) A+T lệch âm (–0.340) G+C dương (0,392) Để xây dựng 12 PCG tổng thành phần A+T được sư dụng 60,08% G+C 39,92%, giá trị skew = –0,433 cho (A+T) 0,403 cho (G+C) A+T được sư dụng ít (57,22%) hai gen MRG so với mtDNA (59,27%) PCG (60,08%); G+C nhiều (42,78%) so với mtDNA (40,43%) PCG (39,92%), vậy giá trị độ lệch skew cũng thấp Chủng của Lào cũng co tỷ lệ sư dụng nucleotide tương tự (Bảng 3.2) 3.1.5 Đặc điểm gen PCG “thiên vị” sử dụng mã Tất cả 64 mã đều được sư dụng; mã khởi đầu ATG (cho gen) GTG (4 gen); mã TAA TAG kết thúc; TGA cho Tryptophan (W) H taichui sư dụng 10.164 bp mã hoa cho 3.376 amino acid, kiến tạo 12 gen PCG Sư dụng mã “thiên vị” mtDNA của H taichui thể nhiều nhất 301 cho Phe-TTT, 224 cho Leu-TTG, 171 cho Val-GTT; ít nhất mã cho Gln-CAA ArgCGC 3.1.6 Khoảng cách di truyền giữa Haplorchis taichui loài sán khác ở họ Heterophyidae Opisthorchiidae dựa cộng hợp amino acid gen (cob+nad1+cox1) 12 PCG Bảng 3.5 Tính toán khoảng cách di truyền theo tỷ lệ sai khác (%) sư dụng độ dài chuỗi amino acid cộng hợp của 12 PCG giữa chủng nghiên cứu Htai-QT3-VN với chủng/loài họ Heterophyidae Opisthorchiidae Chủng/loài Htai-QT3-VN-MG972809 Htai-LA-KF214770 Myok-KR-KC330755 Csin-Amur-RU-FJ381664 Csin-GD-CN-JF729303 Csin-KR-JF729304 Mori-HLJ-CN-KT239342 Ofel-UstTula-RUEU921260 0.46 27.06 31.31 31.37 31.31 31.57 26.83 31.18 31.24 31.18 31.41 30.9 31.47 31.57 31.51 31.44 0.37 0.37 0.40 13.31 13.45 13.48 12.5 31.21 32.17 12.75 12.62 13.38 14.5 Oviv-LA-JF739555 31.64 31.47 32.57 14.77 14.64 13.41 15.14 Ghi chú: Htai-QT3-VN-MG972809: Haplorchis taichui (Việt Nam); Htai-LA-KF214770: H taichui (Lào); Myok-KR-KC330755: Metagonimus yokogawai (Hàn Quôc); Csin-Amur-RU- 13 FJ381664: Clonorchis sinensis (Nga); Csin-GD-CN-JF729303: C sinensis (Trung Quôc); CsinKR-JF729304: C sinensis (Hàn Quôc); Mori-HLJ-CN-KT239342: Metorchis orientalis (Trung Quôc); Ofel-UstTula-RU-EU921260: Opisthorchis felineus (Nga); Oviv-LA-JF739555: Opisthorchis viverrini (Lào) Sô đăng kí Ngân hàng gen ghi cuôi mỗi chuỗi Sô liệu KCDT giữa loài H taichui so với loài khác được bôi đậm chữ sô Phần bôi khung biểu thị KCDT nội loài của chủng cùng loài Haplorchis taichui (giữa chủng) hoặc Clonorchis sinensis (giữa chủng) + So sánh PCG: Khoảng cách di truyền cùng loài (nội loài) rất thấp (chỉ 0,3%) cùng họ Heterophyidae, giữa chủng khác loài (ngoại loài), khác họ Opisthorchiidae cao (17,2–26,6% 26,3–32,0%), giữa loài H taichui của Việt Nam với loài sán khác + So sánh 12 PCG: Sai khác nội loài giữa chủng cùng loài H taichui (Việt Nam Lào) chỉ 0,46%; đo, KCDT ngoại loài giữa H taichui với loài M yokogawai cùng họ Heterophyidae 26,83–27,06%; với loài Clonorchis sinensis, Metorchis orientalis, Opisthorchis felineus O viverrini khác họ (Opisthorchiidae) rất cao, 31,21–31,64% (Bảng 3.5) 3.1.7 Phân tích phả hệ sán ruột nhỏ dựa chuỗi amino acid cộng hợp PCG (cob+nad1+cox1) + Phả hệ dựa PCG: Cây phả hệ cho thấy 23 chủng/loài thuộc vào họ, đo chủng thuộc loài (H taichui, M yokogawai S falcatus) vào nhom của họ Heterophyidae, cùng với loài tham chiếu H taichui của Lào lồi M yokogawai của Hàn Qc Nhom họ Heterophyidae gồm H taichui M yokogawai vị trí “đồng vị”/(“chị em”), còn S falcatus lại vị trí “lệch vị” với nhom họ Opisthorchiidae 3.1.8 Phân tích phả hệ sán ruột nhỏ dựa chuỗi amino acid cộng hợp 12 PCG Cây phả hệ xác định mơi quan hệ lồi phả hệ so sánh 36 chủng/loài sán (Bảng PL2.3) thuộc họ Cyclocoelidae; Echinochasmidae; Echinostomatidae; Fasciolidae; Gastrodiscidae; Gastrothylacidae; Heterophyidae; Himasthlidae; Opisthorchiidae; Paramphistomatidae, cho thấy nhom liên họ Opisthorchioidea (co hai họ Heterophyidae Opisthorchiidae) thuộc Phân Opisthorchiata, luôn tập hợp cùng (Hình 3.6) Chỉ sô tin tưởng (bootstrap) co giá trị 100% cả nút chính (nút phân định liên họ) 98–100% nút phân định họ thuộc 14 đôi tượng so sánh Nhom họ Heterophyidae gồm H taichui (chủng của Việt Nam Lào) M yokogawai sắp xếp vị trí “đồng vị”/(“chị em”), với nhom họ Opisthorchiidae Hình 3.6 Cây phả hệ xác định mơi quan hệ lồi phả hệ dựa phân tích chuỗi amino acid suy diễn cộng hợp từ 12 gen PCG của ty thể Ghi chú: Môi quan hệ được xác định giữa chủng SLRN của Việt Nam (dấu hình thoi) loài sán khác đại diện họ (Cyclocoelidae; Echinochasmidae; Echinostomatidae; Fasciolidae; Gastrodiscidae; Gastrothylacidae; Heterophyidae; Himasthlidae; Opisthorchiidae; Paramphistomatidae) họ Schistosomatidae (ngoại hợp) Cây phả hệ được xây dựng chương trình MEGA X, phương pháp “tiếp cận cực đại” (Maximum likelihood, ML), với hệ sô tin tưởng bootstrap 1000 lần lặp lại (Kumar et al., 2018) Dấu hình thoi chỉ hai loài H taichui của Việt Nam SLRN thuộc đôi tượng nghiên cứu (đong khung trong) Nhom của Phân Opisthorchiata Liên họ Opisthorchioidea được đong khung Mũi tên chỉ nút chính phân định Liên họ Opisthorchioidea, Echinostomatoidea Paramphistomoidea Ở mỗi chuỗi, bắt đầu tên loài (toàn tên), tiếp theo ký hiệu chủng (trong ngoặc) lấy từ tên địa phương phân lập (nếu co) sô đăng ký Ngân hàng gen (nếu co), liệt kê Bảng PL2.3 Hệ sô tin tưởng (bootstrap) được ghi mỗi nhom phân nhánh Sô đăng ký Ngân hàng gen được đặt cuôi chuỗi Vạch ngang cuôi hình (0.1) biểu thị sai khác nucleotide (1/100 nucleotide) mỗi nhánh 15 3.2 Kết nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome lồi Haplorchis taichui loài H pumilio mẫu Việt Nam 3.2.1 Cấu trúc xếp gen/vùng giao gen đơn vị mã hóa ribosome Haplorchis taichui H pumilio Phần mã hoa ribosome (coding rDNA) của loài H taichui (Htai-QT3-VN) co độ dài 7.268 bp, của loài H pumilio (Hpum-HPU8-VN) co độ dài 7.416 bp, còn thiếu vùng IGS chưa thu được cả hai loài Năm gen/vùng giao gen (ITS) đã được xác định, lần lượt: gen 18S rRNA, ITS-1, gen 5.8S rRNA, ITS-2 gen 28S rRNA, so sánh với rTU của loài SLRN cùng họ Heterophyidae Cryptocotyle lingua (Nga) Euryhelmis costaricensis (Nhật Bản) (Hình 3.8) Hình 3.8 Trật tự sắp xếp gen của phần mã hoa của đơn vị mã hoa ribosome sán ruột nhỏ họ Heterophyidae gồm Haplorchis taichui (Việt Nam), H pumilio (Việt Nam), Cryptocotyle lingua (Nga) Euryhelmis costaricensis (Nhật Bản) TRU: tandem repeat unit: cấu trúc chuỗi lặp liền kề, H taichui co TRU (TRU1–3), H pumilio co TRU (TRU1–5) Eu costaricensis co 2,5 TRU (TRU1–2.5) Lồi Cryptocotyle lingua khơng chứa TRU ITS-1 ITS-2 3.2.2 Độ dài gen rRNA vùng giao gen ở đơn vị mã hóa ribosome loài Haplorchis taichui Haplorchis pumilio 16 Cả H taichui H pumilio co gen 18S rRNA cùng độ dài 1.992 bp 5.8S rRNA 160 bp, gen 28S rRNA 3.875 bp H taichui 3.870 bp H pumilio ITS-1 H taichui co độ dài 797 bp, không chứa cấu trúc lặp (TRU); ITS-1 H pumilio (1.106 bp) chứa TRU bao gồm TRU (TRU1–3/136 bp/mỗi cấu trúc) TRU (TRU4–5/116 bp/mỗi cấu trúc) ITS-2 lồi H pumilio (280 bp) khơng chứa bất kỳ TRU nào, ITS-2 H taichui (444 bp) chứa TRU (83–85 bp/mỗi cấu trúc) Vùng giao gen ITS co chứa cấu trúc lặp đặc điểm gen học đáng chú ý Haplorchis spp 3.2.3 Đặc điểm cấu trúc bậc hai gen rRNA (5.8S, 18S, 28S rRNA) vùng giao gen (ITS-1, ITS-2) Mô hình cấu trúc bậc hai xây dựng chương trình RNAfold RNAalifold co tại: http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/ Cấu trúc bậc hai gen rRNA: Gen 5.8S rRNA co “kẹp tóc” “vòm” nội gen, kích thước ngắn, không phức tạp Gen 18S rRNA 28S rRNA của Haplorchis spp chuỗi “đồng thuận” (consensus) đều co cấu trúc bậc hai phức tạp, chứa “kẹp tóc” gồm nhánh chính nhánh phụ cuôi mỗi nhánh đều co “vòm” gắn kết Cấu trúc bậc hai vùng giao gen ITS: ITS-1 của H taichui H pumilio co cấu trúc bậc hai phức tạp Ở H taichui, những chuỗi đôi ngược tạo nên “kẹp toc” (29–30), nhiều “kẹp tóc” không co “vòm” cuôi Ở H pumilio, chia phần rõ rệt, vùng chứa TRU1–5 co “kẹp tóc” rất cân đôi phần còn lại chứa nhánh dài ngắn khác không cân đôi ITS-2 của cả loài (H taichui, H pumilio, C lingua Eu costaricensis) đều cấu trúc nhánh “kẹp tóc” chính mô hình chung gọi dạng “bốn ngón tay” (four finger) bảo tồn ITS-2 của H taichui co thêm nhánh phụ được hình thành chủ yếu từ bắt cặp cấu trúc lặp nhỏ co ITS-2 của loài 3.2.4 Kết phân tích phương thức sử dụng nucleotide tương đồng đơn vị mã hóa ribosome Bơn đơn vị so sánh: gen 18S, 28S, 18S+28S phần mã hoa rTU (tạm gọi rTU*) Sư dụng nhiều nhất G, tiếp đến T ít nhất A C, tạo nên công 17 thức: G >> T > A≈ C Tổng thể A+T sư dụng ít G+C cho giá trị lệch âm rất thấp A+T; lệch dương không cao G+C cả đơn vị so sánh Mức độ tương đồng của H taichui với loài SLRN rất cao, 18S rRNA: 98,94%/H pumilio; 97,80%/C lingua; 97,69%/Eu costaricensis; 28S rRNA: 97,39%/H pumilio; 96,02%/C lingua; 95,60%/Eu costaricensis; 18S+28S rRNA: 97,92%/H pumilio; 96,63%/C lingua; 96,32%/Eu costaricensis; rTU*: 97,30%/H pumilio; 95,52%/C lingua; 95,07%/Eu costaricensis (Bảng 3.8) Bảng 3.8 Mức độ tương đồng nucleotide (%) của từng gen 18S, 28S, 18S+28S rRNA rTU của loài SLRN họ Heterophyidae, H taichui, H pumilio, C lingua, Eu costaricensis STT Tên chủng/loài (GenBank) Htai-QT3-VN (KX815126) Hpum-HPU8-VN (KX815125) Clin-Kartesh-RU (MW361240) Ecos-Fuku-JP (AB521797) Gen 18S rRNA 98.94 Gen 28S rRNA 97.39 97.80 98.01 97.69 97.64 98.83 96.02 95.13 95.60 94.65 97.52 18S rRNA + 28S rRNA Phần mã hóa rTU Htai-QT3-VN (KX815126) Hpum-HPU8-VN 97.92 97.30 (KX815125) Clin-Kartesh-RU 96.63 96.12 95.52 94.91 (MW361240) Ecos-Fuku-JP 96.32 95.68 97.97 95.07 94.47 97.45 (AB521797) Ghi chú: Htai-QT3-VN: Loài Haplorchis taichui chủng QT3, Việt Nam; Hpum-HPU8-VN: loài Haplorchis pumilio chủng HPU8, Việt Nam; Clin-Kartesh-RU: loài Cryptocotyle lingua, chủng Kartesh của Nga; Ecos-Fuku-JP: loài Euryhelmis costaricensis, chủng Fuku của Nhật Bản Sô đăng ký Ngân hàng gen (GenBank) được cung cấp mỡi lồi Tỷ lệ đồng nhất cao nhất thấp nhất giữa loài SLRN được bôi đậm tô màu 3.2.5 Phân tích phả hệ H taichui H pumilio dựa toàn phần gen 28S rRNA cộng hợp (18S+28S rRNA) Hình 3.14 trình bày phả hệ của 34 chủng/28 loài kể cả H taichui H pumilio dựa phân tích ch̃i gen 28S rRNA tồn phần (~3,8–3,9 kb) Bảy nhom của họ tập hợp phân gồm: i) Phân Troglotremata 18 (các họ Paragonimidae, Nanophyetidae, Collyriclidae); ii) Phân Opisthorchiata (các họ Opisthorchiidae, Heterophyidae): iii) Phân Echinostomata (các họ Echinostomatidae, Fasciolidae) tách biệt rõ ràng Tuy nhiên, họ Heterophyidae, nhom của hai loài C lingua Eu costaricensis sắp xếp vị trí “đồng vị”/“chị em” với nhom họ Opisthorchiidae, đẩy nhom của hai loài H taichui H pumilio nằm vị trí “lệch vị” Hình 3.14 Cây phả hệ xác định mơi quan hệ lồi phả hệ dựa phân tích ch̃i gen 28S rRNA tồn phần (~3.8–3.9 kb) của SLRN H taichui H pumilio của Việt Nam loài sán khác Ghi chú: Các loài H taichui H pumilio của Việt Nam (đánh dấu hình tròn đong khung) cùng với Cryptocotyle lingua Euryhelmis costaricensis cùng họ Heterophyidae loài sán khác đại diện họ (Nanophyetidae; Paragonimidae; Collyriclidae; Opisthorchiidae; Echinostomatidae Fasciolidae) họ Schistosomatidae (ngoại hợp) Cây phả hệ được xây dựng chương trình MEGA X, ”tiếp cận cực đại” (Maximum likelihood (ML)), với hệ sô tin tưởng bootstrap 1000 lần lặp lại (Kumar et al., 2018) Mũi tên chỉ nút chính phân định Liên họ Opisthorchioidea Ở mỗi chuỗi, bắt đầu ký hiệu tên lồi, tiếp theo ký hiệu chủng qc gia phân lập (nếu co), sau đo gen 28S với sô nucleotide so sánh (trong ngoặc) cuôi cùng sô đăng ký Ngân hàng gen (nếu co), liệt kê Bảng PL2.5 Hệ sô tin tưởng (bootstrap) được ghi mỗi nhom phân nhánh Vạch ngang cuôi hình (0.02) biểu thị sai khác nucleotide (2/100 nucleotide) mỗi nhánh Hình 3.15 trình bày phả hệ của 23 chủng/17 loài kể cả H taichui H 19 pumilio dựa phân tích chuỗi gen 18S+28S rRNA toàn phần (~5,8–5,9 kb) Ngoài nhom ngoại hợp, năm nhom của họ tập hợp phân bộ: phân Opisthorchiata (các họ Opisthorchiidae, Heterophyidae): phân Echinostomata (các họ Echinostomatidae, Fasciolidae Philophthalmidae) hai nhom phân tách biệt rõ ràng Tuy nhiên, họ Heterophyidae, nhom của hai loài C lingua Eu costaricensis co xu hướng sắp xếp vào giữa gần với nhom họ Opisthorchiidae, đẩy nhom của hai loài H taichui H pumilio vị trí “lệch vị” Hình 3.15 Cây phả hệ xác định mơi quan hệ lồi phả hệ dựa phân tích chuỗi gen cộng hợp 18S+28S rRNA toàn phần (5.846–5.870 bp) của SLRN H taichui H pumilio của Việt Nam loài sán khác Ghi chú: Các loài SLRN H taichui H pumilio của Việt Nam (đánh dấu hình tròn) loài sán khác đại diện họ (Heterophyidae, Opisthorchiidae, Fasciolidae, Philophthalmidae, Echinostomatidae) họ Schistosomatidae (ngoại hợp) Cây phả hệ được xây dựng chương trình MEGA X, ”tiếp cận cực đại” (maximum likelihood (ML), với hệ sô tin tưởng (bootstrap) 1000 lần lặp lại (Kumar et al., 2018) Khung vuông bôi màu phân định hai phân Opisthorchiata Echinostomata Ở mỗi chuỗi, bắt đầu ký hiệu tên lồi, tiếp theo ký hiệu chủng qc gia phân lập, sau đo sô đăng ký Ngân hàng gen (nếu co) liệt kê Bảng PL2.6 Hệ sô tin tưởng (bootstrap) 20 được ghi mỗi nhom phân nhánh Vạch ngang cuôi hình (0.01) biểu thị sai khác nucleotide (1/100 nucleotide) mỗi nhánh CHƯƠNG IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ Đề tài đã thực thành công nội dung nghiên cứu, đáp ứng mục tiêu đề Luận án đã xây dựng, hoàn thành cung cấp kết quả nghiên cứu đã đạt được, đo co sô điểm nổi bật mà chúng cho đã gop phần đong gop cho nghiên cứu gen học mtDNA rTU của loài SLRN noi riêng sán noi chung Kết quả của luận án từng bước đáp ứng nhu cầu cần thiết về nghiên cứu xác định lồi, chẩn đốn, dịch tễ học, phả hệ, tiến hoa di truyền quần thể còn thiếu chi Haplorchis họ Heterophyidae cũng mơi quan hệ lồi/ho ̣/phân phả hệ tiến hoa phân tư Luận án cũng đã cung cấp dữ liệu mtDNA rTU co giá trị cho dữ liệu gen/hệ gen sán thế giới 4.1 Về nghiên cứu hệ gen ty thể sán ruột nhỏ Haplorchis taichui + Trong nghiên cứu này, mtDNA hoàn chỉnh của H taichui Nishigori, 1924 (chủng QT3 của Việt Nam) đã được giải trình tự mô tả đầy đủ đặc điểm gen học H taichui co kích thước mtDNA trung bình (15.120 bp); H taichui (mẫu Lào, 15.131 bp; KF214770) loài Metagonimus yokogawai (mẫu Hàn Quôc, 15.258 bp; KC330755) họ Heterophyidae Dữ liệu mtDNA của H taichui chúng cung cấp rất co giá trị cho nghiên cứu ứng dụng tiếp theo + Sự sắp xếp trật tự gen, vùng giao gen vùng NCR được xác định bảo tồn cao, đa sơ lồi sán lá, ngoại trừ họ Schistosomatidae Hai gen rRNA ty thể co cấu trúc bậc hai phức tạp, điển hình của RNA tham gia ribosome Trật tự sắp xếp tRNAGly tRNAGlu thay đởi tùy lồi, co thể đảo vị trí vùng NCR Hai mươi môt (21) tRNA co cấu trúc bậc hai hình “lá sồi” (cloverleaf), phân phôi hướng của “cánh tay” (arm) hoạt động vận chuyển amino acid; chỉ co tRNA Ser1 bị khuyết thiếu cánh tay DHU Khuyết thiếu cánh tay DHU tRNA thường gặp sô sán khác Fasciola hepatica, F jacksoni, Fascioloides magna, Echinostoma miyagawai Ech revolutum Cấu trúc lặp liền kề (TRU) mtDNA của H taichui nét đặc trưng của loài SLRN cũng điển hình đa hình (polymorphism) thường gặp rất nhiều loài SLRN họ 21 Echinostomatidae/Echinochasmidae loài sán họ khác + H taichui (Việt Nam Lào) “thiên vị” về sư dụng A+T nhiều G+C (A+T > G+C) mtDNA, tương tự sô loài sán họ Fasciolidae) họ Opisthorchiidae, khoảng 60%, khác xa ít nhiều so với loài sán máng Schistosoma spp thuộc họ Schistosomatidae (sư dụng đến 70% A+T) Do đo, giá trị độ lệch (skewness) cũng thiên về lệch âm Sư dụng nhiều nhất thuộc về mã Phe-TTT) Leu-TTG, ít nhất Gln-CAA, Arg-CGC; M yokogawai còn thêm Thr-ACA/ACC, thường gặp mtDNA sán đã công bô + Phân tích phả hệ dựa gen ty thể đơn lẻ, cộng hợp hay 12 PCG, đều cho thấy H taichui (Việt Nam Lào) được sắp xếp cùng M yokogawai nhom, đo nhom họ Heterophyidae Nhom họ co quan hệ gần nhất (vị trí “đồng vị”/“chị em”(sister)) với nhom họ Opisthorchiidae Các vị trí phân loại của loài họ Heterophyidae, đo co H taichui hoàn toàn đã được khẳng định cách chắc chắn 4.2 Về nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome sán ruột nhỏ Haplorchis taichui H pumilio + Trong nghiên cứu này, phần mã hoa toàn phần của rTU (tạm ký hiệu rTU*) của hai loài SLRN của Việt Nam, H taichui (chủng QT3) H pumilio (chủng HPU8) đã được thu nhận mô tả đầy đủ đặc điểm gen vùng giao gen Độ dài rTU* của H taichui 7.268 bp; của H pumilio 7.416 bp) bao gồm toàn vùng DNA mã hoa cho 18S rRNA, vùng giao gen ITS1, vùng gen 5.8S rRNA, vùng giao gen ITS2 toàn vùng gen 28S rRNA đã được xác định so sánh với rTU* của hai loài hai loài C lingua Eu costaricensis cùng họ Heterophyidae co Ngân hàng gen Dữ liệu rTU của H taichui H pumilio vừa thu nhận rất co giá trị cho nghiên cứu ứng dụng tiếp theo + Cấu trúc bậc hai của 18S rNA chuỗi “đồng thuận” (consensus) bảo tồn giữa chủng cùng loài chi Haplorchis; của 28S rRNA phức tạp hình thành nhiều nhánh “kẹp toc (hairpin) phụ “vòm” (loop) tự do, đặc trưng theo loài co họ Heterophyidae Cấu trúc bậc hai của ITS-1 phức tạp, co vùng “cân đôi” “không cân đôi” phân phôi nhánh/vòm khác nhau; của ITS-2 co dạng 22 hình “bôn ngon tay” (four finger), bảo tồn loài sinh vật, nhiên H taichui co nhánh phụ + Tỷ lệ sư dụng loại nucleotide loài SLRN co thể nhận thấy theo mô hình tương tự nhau, nhiều nhất G, tiếp đến T ít nhất A C với tỷ lệ nhau, tạo nên công thức: G >> T > A≈ C; tổng thể A+T được sư dụng ít G+C (A+T < G+C) + Phân tích phả hệ sư dụng gen 28S rRNA cộng hợp 18S+28S rRNA, đều cho thấy cấp họ (family), họ Heterophyidae sắp xếp vị trí “chị em”/”sister” (monophyly) với họ Opisthorchiidae phân Opisthorchiata Phân Opisthorchiata tách biệt rõ ràng với phân Echinostomata (họ Echinostomatidae, Fasciolidae) phân Troglotremata (họ Paragonimidae, Nanophyetidae, Collyriclidae) Tuy nhiên, cấp độ loài (species) sự co mặt SLRN khác chi cùng họ khác (Cryptocotyle lingua Euryhelmis costaricensis) đã đẩy nhom loài Haplorchis spp sang vị trí “lệch vị” (paraphyly) với nhom họ Opisthorchiidae Cần thiết co thêm dữ liệu rTU của nhiều loài SLRN khác để làm sáng tỏ vị trí phân loài/họ Heterophyidae Opisthorchiata 4.3 Về đóng góp cung cấp sở liệu hệ gen ty thể đơn vị mã hóa ribosome Hiện nhu cầu áp dụng kỹ thuật SHPT bao gồm việc sư dụng chỉ thị trích xuất từ chuỗi DNA của mtDNA rTU/rDNA để phôi hợp với kiểm tra đặc điểm HTH phân loại, giám định, phát lồi, chẩn đốn, định type, dịch tễ phân tư, phả hệ, tiến hoa, nguồn gôc di truyền quần thể rất lớn được coi công cụ tin tưởng nhất Chúng đã thực đề tài cung cấp dữ liệu hoàn chỉnh của mtDNA từ loài SLRN Haplorchis taichui phần mã hoa rTU từ loài Haplorchis taichui Haplorchis pumilio ký sinh gây bệnh người Kết quả nghiên cứu gen học thu được từ SLRN loài H taichui H pumilio của Việt Nam đã bổ sung thêm hiểu biết ứng dụng SHPT mà sô nghiên cứu trước đã ghi nhận, đồng thời mở định hướng nghiên cứu SLRN họ Heterophyidae còn thiếu rất nhiều sở dũ liệu thế giới 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã nghiên cứu giải trình tự thu nhận toàn mtDNA của loài SLRN H taichui họ Heterophyidae, mẫu Việt Nam; đã xác định cấu trúc sắp xếp gen hệ gen, phân tích đầy đủ đặc điểm gen, tính tốn khoảng cách di trùn lồi họ Heterophyidae họ Opisthorchiidae xây dựng phả hệ SLRN với loài sán Toàn mtDNA hoàn chỉnh của loài H taichui co độ dài 15.120 bp (MG972809), chứa 36 gen, gồm 12 gen mã hoa protein, PCG (cox1–3; nad1–6 nad4L; cob atp6), gen ribosome ty thể, MRG (16S/rrnL 12S/rrnS), 22 gen vận chuyển amino acid (tRNA) vùng không mã hoa (NCR), chứa đơn vị cấu trúc lặp liền kề, TRU1–5/182 183 bp/mỗi chuỗi Tổng thành phần A+T G+C sư dụng theo mô hình (A+T > G+C), giá trị độ lệch (skew/skewness) sư dụng A+T thiên về lệch âm G+C lệch dương Sự “thiên vị” mã sư dụng nhiều nhất ít nhất; khoảng cách di truyền giữa loài SLRN họ Heterophyidae họ Opisthorchiidae cũng đã được xác định Đã phân tích mơi quan hệ về lồi xây dựng thành cơng phả hệ SLRN dựa chuỗi amino acid cộng hợp của PCG (cob+nad1+cox1) 12 PCG, xác định vị trí “đồng vị”/”chị em”(sister) (monophyly) của họ Heterophyidae với họ Opisthorchiidae Đã nghiên cứu giải trình tự thu nhận toàn phần mã hoa của rTU (ký hiệu rTU*) của SLRN Haplorchis taichui H pumilio, mẫu Việt Nam, xác định cấu trúc sắp xếp gen/vùng giao gen rTU*, phân tích đầy đủ đặc điểm gen/vùng giao gen, cấu trúc bậc hai, tính toán khoảng cách di truyền loài họ Heterophyidae họ Opisthorchiidae; xây dựng phả hệ SLRN họ Heterophyidae loài sán khác Vùng mã hoa rTU của H taichui co kích thước 7.268 bp của H pumilio co độ dài 7.416 bp, chứa gen 18S rRNA, 5.8S rRNA 28S rRNA hoàn chỉnh; vùng giao gen ITS-1 ITS-2, đặc biệt đã tìm thấy cấu trúc lặp (co TRU) ITS-1 loài H pumilio ITS-2 (co TRU) loài H taichui 24 Tỷ lệ sư dụng nucleotide theo mô hình (G >> T > A≈ C), tổng thể A+T G+C (A+T < G+C), giá trị độ lệch (skew/skewness) sư dụng A+T lệch âm rất thấp G+C co lệch dương không cao Mức dộ tương đồng nội loài giữa loài SLRN rất cao ngoại loài họ Heterophyidae họ Opisthorchiidae thấp Đã phân tích môi quan hệ về lồi xây dựng thành cơng phả hệ SLRN dựa gen 28S rRNA toàn phần (3,7–3,8 kb) cộng hợp 18S+28S rRNA (5,8–5,9 kb), xác định vị trí “đồng vị”/”chị em”(sister) của họ Heterophyidae với họ Opisthorchiidae KIẾN NGHỊ Ở họ Heterophyidae dữ liệu toàn mtDNA rTU còn rất thiếu, vậy, cần nghiên cứu giải trình tự thêm nhiều loài SLRN khác nhằm cung cấp sở dữ liệu gen học mtDNA rTU bao phủ chi khác để khai thác ứng dụng Do quan hệ loài phả hệ giữa họ Heterophyidae họ khác Liên họ Opisthorchioidea còn vấn đề phức tạp, nên việc nghiên cứu tiến hoa, phả hệ, nguồn gôc của Haplorchis spp loài SLRN khác cấp thiết, tiến tới làm sáng tỏ danh pháp, loài, họ, vị trí phân loại đề x́t phương thức phòng chơng bệnh lồi KST gây nên 25 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Lê Thị Việt Hà, Nguyễn Thị Khuê, Nguyễn Thị Bích Nga, Đồn Thị Thanh Hương, Đỡ Trung Dũng, Đồng Văn Quyền, Lê Thanh Hòa (2015) Đặc điểm gen học phân loại của loài sán ruột nhỏ (Haplorchis pumilio; H taichui; Stellantchasmus falcatus) thuộc họ Heterophyidae thu thập người Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ 31(4S): 63–71 Lê Thị Việt Hà, Nguyễn Thị Khuê, Đồng Văn Quyền, Lê Thanh Hòa (2019) Khoảng cách di truyền tương quan phả hệ của sán ruột (họ Heterophyidae) Việt Nam, Tạp chí Công nghệ Sinh học 17(1): 59–66 Le Thi Viet Ha, Nguyen Thi Khue, Dong Van Quyen, Thanh Hoa Le (2020) Phylogenetic analyses of ribosomal transcription units from Haplorchis taichui and H pumilio species of Heterophyidae (Platyhelminthes: Opisthorchiata) Vietnam Journal of Biotechnology 18(4): 643–652 Lê Thị Việt Hà, Nguyễn Thị Khuê, Đồng Văn Quyền, Lê Thanh Hòa (2021) So sánh đặc điểm hệ gen ty thể của sán ruột nhỏ Haplorchis taichui với Metagonimus yokogawai đơn vị mã hoa ribosome với H pumilio (họ Heterophyidae) Tạp chí Công nghệ Sinh học 19(1): 69–84 ... lưu hành Việt Nam, chúng tơi tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể đơn vị mã hóa ribosome số loài sán ruột thuộc họ Heterophyidae ký sinh gây bệnh người động vật Việt Nam? ?? Tính... của chúng được mô tả (Nguồn: Chai, 2019) 1.2 Đặc điểm hệ gen ty thể đơn vị mã hóa ribosome ứng dụng Đặc điểm hệ gen ty thể Hệ gen ty thể động vật, kể cả KST đa bào, vòng DNA khép kín,... Nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể loài sán ruột nhỏ Haplorchis taichui, phân tích đặc điểm gen xây dựng phả hệ Nghiên cứu giải trình tự đơn vị mã hóa ribosome của sớ lồi sán