ĐÁNH GIÁ TÍNH PHÙ hợp SINH học của THỦY TINH THỂ NHÂN tạo sản XUẤT tại VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG I HC Y H NI NG TH HUYN NHUNG ĐáNH GIá TíNH PHù HợP SINH HọC CủA THủY TINH THể NHÂN TạO SảN XUấT TạI VIệT NAM Chuyờn ngnh : Mô phôi thai học Mã số : 62720102 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Phòng đào tạo sau đại học Bộ môn Mô – phôi thai học, Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lời cho em trình học tập hoàn thành luận văn Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Ngơ Duy Thìn, giảng viên Bộ mơn Mơ – phơi thai học, Trường Đại học Y Hà Nội PGS TS Ngơ Duy Thìn người thầy ln tận tình hướng dẫn, bổ sung cho em kiến thức chuyên ngành cần thiết cho em nhiều lời khuyên, nhiều gợi ý hữu ích để giải khó khăn gặp phải trình học tập làm luận văn Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô, anh chị bác sĩ, kỹ thuật viên, y công môn Mô – phôi, bạn nội trú chuyên ngành ln sẵn sàng giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu tạo điều kiện giúp đỡ em q trình hồn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô hội đồng bảo vệ đề cương luận văn thạc sĩ có ý kiến đóng góp đáng quý để em hoàn thiện luận văn Cuối cùng, em xin cảm ơn bạn bè, gia đình ln bên cạnh, động viên em trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, Ngày tháng năm 2018 Đặng Thị Huyền Nhung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Đánh giá tính phù hợp sinh học thủy tinh thể sản xuất Việt Nam” đề tài nhánh nằm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu chế tạo thủy tinh thể nhân tạo Việt Nam” thực Các kết công bố đề tài hoàn toàn trung thực, cho phép Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu chế tạo thủy tinh thể nhân tạo Việt Nam” chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT & THUẬT NGỮ WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới RAAB Rapid Assessment of Avoidable Blindness Đánh giá nhanh bệnh gây mù phòng tránh IOLs Intraocular lenses Thủy tinh thể HE Hematoxylin Eosin NIH National Institute of Health Viện nghiên cứu sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ PCO Posterior Capsule Opacities Mờ đục bao sau ISO International Organization for Standardization Tổ chức tiêu chuẩn hóa quốc tế PMMA Polymethyl methacrylate MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đục thủy tinh thể 1.1.1 Thủy tinh thể 1.1.2 Định nghĩa đục thủy tinh thể 1.1.3 Nguyên nhân đục thủy tinh thể .4 1.1.4 Điều trị đục thủy tinh thể 1.2 Vật liệu sinh học .6 1.2.1 Đại cương vật liệu sinh học 1.2.2 Các loại vật liệu sinh học 1.2.3 Các yêu cầu vật liệu sinh học 1.2.4 Tính phù hợp sinh học vật liệu sinh học 1.2.5 Tính phù hợp mơ vật liệu sinh học .10 1.2.6 Độc tính tồn thân vật liệu sinh học .12 1.3 Thủy tinh thể nhân tạo 13 1.3.1 Lịch sử đời thủy tinh thể nhân tạo 13 1.3.2 Vật liệu chế tạo thủy tinh thể nhân tạo 14 1.3.3 Các kiểu dáng thủy tinh thể nhân tạo 15 1.4 Các nghiên cứu giới nước vật liệu thủy tinh thể nhân tạo 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu: 20 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 2.3 Cỡ mẫu nghiên cứu: .21 2.4 Thiết kế nghiên cứu 21 2.5 Quy trình nghiên cứu 22 2.5.1 Chuẩn bị dụng cụ, thuốc hóa chất 22 2.5.2 Các bước tiến hành 22 2.5.3 Kĩ thuật làm tiêu mô học sử dụng nghiên cứu 24 2.6 Chỉ tiêu đánh giá 25 2.7 Xử lý số liệu 26 2.8 Đạo đức nghiên cứu .26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27 3.1 Tình trạng chung thỏ 27 3.2 Tính phù hợp mơ vật liệu thủy tinh thể nhân tạo 27 3.2.1 Tình trạng đại thể vùng cấy ghép vật liệu thủy tinh thể nhân tạo 27 3.2.2 Tình trạng vi thể vùng cấy ghép vật liệu phôi thủy tinh thể nhân tạo 30 3.3 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến số sinh hóa, huyết học thỏ 37 3.3.1 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến chức tạo máu thỏ 37 3.3.2 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến mức độ hủy hoại tế bào gan thỏ 40 3.3.3 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến chức gan thỏ thực nghiệm 41 3.3.4 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến chức thận thỏ thực nghiệm .43 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 44 4.1 Động vật thực nghiệm 44 4.2 Mơ hình nghiên cứu .46 4.3 Vật liệu nghiên cứu 47 4.4 Kết nghiên cứu 48 4.4.1 Tính phù hợp mơ vật liệu thủy tinh thể nhân tạo 48 4.4.2 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo lên số sinh hóa, huyết học .54 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phép thử đánh giá ban đầu để xem xét khả phù hợp sinh học vật liệu Bảng 3.1 Tổng hợp kết đại thể sau ghép thủy tinh thể nhân tạo 29 Bảng 3.2 Độ dày lớp mô liên kết xơ hình thành bao quanh vật liệu thủy tinh thể nhân tạo 35 Bảng 3.3 Tổng hợp kết vi thể mô liên kết da sau ghép 37 Bảng 3.4 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến 38 Bảng 3.5 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến 39 Bảng 3.6 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến 40 Bảng 3.7 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến 42 Bảng 3.8 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến albumin 42 Bảng 3.9 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến cholesterol máu thỏ 43 Bảng 4.1 Mơ hình động vật để đánh giá thể thiết bị y tế 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đục thủy tinh thể Hình 1.2 Các kiểu dáng thiết kế thủy tinh thể nhân tạo 16 Hình 2.1 Vật liệu nghiên cứu .20 Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 21 Hình 2.3 Lấy máu tĩnh mạch rìa tai thỏ 22 Hình 2.4 Quy trình cấy ghép vật liệu thủy tinh thể nhân tạo vào 24 Hình 3.1 Hình ảnh đại thể vùng mơ cấy ghép vật liệu thủy tinh thể nhân tạo 28 Hình 3.2 Hình ảnh mô da thỏ vật liệu thủy tinh thể nhân tạo nằm mô da .28 Hình 3.3 Phơi thủy tinh thể nhân tạo trước sau cấy ghép tuần .29 Hình 3.4 Hình ảnh tiêu vùng mô ghép vật liệu thủy tinh thể nhân tạo 30 Hình 3.5 Vùng mơ da thỏ nơi cấy ghép vật liệu thủy tinh thể nhân tạo 31 Hình 3.6 Mô liên kết xơ bao quanh vật liệu thủy tinh thể nhân tạo nghiên cứu thủy tinh thể nhân tạo chứng sau ghép tuần 32 Hình 3.7 Mơ liên kết chân bì da gần vị trí cấy ghép vật liệu thủy tinh thể nhân tạo nghiên cứuvà thủy tinh thể nhân tạo chứng 33 Hình 3.8 Lớp mơ liên kết xơ bao quanh vật liệu thủy tinh thể nhân tạo nghiên cứu thủy tinh thể nhân tạo chứng sau ghép tuần .34 Hình 3.9 Mơ liên kết chân bì da gần vị trí cấy ghép vật liệu thủy tinh thể nhân tạo nghiên cứu thủy tinh thể nhân tạo chứng 36 Hình 3.10 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến hemoglobin 38 Hình 3.11 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến hematocrit 39 Hình 3.12 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến hoạt độ AST 40 Hình 3.13 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến hoạt độ ALT 41 Hình 3.14 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến .43 Hình 4.1 Sơ đồ biểu diễn phản ứng viêm cấp tính mạn tính thể vật liệu lạ .50 Hình 4.2 Kết vùng mô sau cấy ghép thủy tinh thể nhân tạo 30 ngày 53 48 chia thành hai giai đoạn giai đoạn cấp tính giai đoạn mạn tính Giai đoạn cấp tính q trình viêm cấp tính kéo dài từ vài đến vài ngày với đặc trưng ban đầu thay đổi tính thấm thành mạch làm cho protein ngồi mạch máu Các protein với protein mô tạo thành lớp protein bao quanh vật liệu (hình 4.1 A) Cùng với xâm nhập tế bào viêm mà đặc trưng giai đoạn bạch cầu đa nhân trung tính (hình 4.1 B) Tiếp sau giai đoạn mạn tính chi phối gia tăng nguyên bào sợi đại thực bào (hình 4.1 C, 4.1D) Các đại thực bào hợp lại để tạo thành tế bào đa nhân khổng lồ bao quanh vật liệu sinh học Song song với trình nguyên bào sợi tổng hợp nên collagen tạo thành màng liên kết xơ bao quanh vật liệu, cô lập vật liệu, hạn chế tiếp xúc vật liệu với mô xung quanh Tuy nhiên màng liên kết xơ khơng thiết nói lên vật liệu khơng có tính phù hợp sinh học [47] 49 Hình 4.1 Sơ đồ biểu diễn phản ứng viêm cấp tính mạn tính thể vật liệu lạ [47] Tóm lại, mức độ đáp ứng mô vật liệu phụ thuộc vào chất vật liệu sinh học mức độ chấn thương mơ q trình cấy ghép Tuy nhiên kết cuối dẫn đến lắng đọng collagen quanh vật liệu dạng màng liên kết xơ [46], [49] Do đó, kỹ thuật thường quy sử dụng để đánh giá mức độ phản ứng thể vật liệu sinh học đánh giá phân bố collagen xung quanh vật liệu độ dày màng liên kết xơ số hiệu để đánh giá mức độ phản ứng thể [46] Trong nghiên cứu đánh giá vật liệu thủy tinh thể nhân tạo sau cấy ghép vào mô da thỏ tuần nhận thấy vật liệu thủy tinh 50 thể nghiên cứu Công ty Cổ phần nhà máy thiết bị y học vật liệu sinh học không gây biến đổi khác toàn thân, đại thể hay đặc điểm vi thể vật liệu thủy thể nhân tạo chứng – thủy tinh thể nhân tạo sử dụng rộng rãi thực hành lâm sàng Về hình ảnh đại thể: Vùng mô da thỏ sau cấy thủy tinh thể nhân tạo tuần hoàn tồn bình thường Khơng có tượng biến đổi hình thái, màu sắc, cấu trúc mô, không thấy tượng hoại tử mô Vùng mô xung quanh vật liệu phát triển hồn tồn bình thường Điều phần nói lên chấp nhận thể động vật vật liệu ghép – vật lạ thể Qua quan sát không thấy tượng thải ghép, đùn đẩy vật liệu phần chứng minh tính an tồn vật liệu khả phù hợp sinh học vật liệu thể sống Về vi thể: Vật liệu không gây biến đổi cấu trúc mơ liên kết chân bì da Trên hình ảnh vi thể mẫu bệnh phẩm sau cấy ghép vật liệu thủy tinh thể nhân tạo tuần, nhận thấy xuất tế bào viêm vị trí tiếp xúc vật liệu ghép, chủ yếu tương bào lympho bào với số lượng Đây tế bào đặc trưng cho trình viêm mạn tính với số lượng cho thấy phản ứng viêm gần kết thúc bắt đầu bước sang giai đoạn hình thành mơ hạt liền sẹo Đánh giá sau ghép tuần, tiêu gần không thấy xuất tế bào viêm Sự giảm nhanh số lượng tế bào viêm chứng minh khả hòa hợp tốt vật liệu mô cấy ghép Tại nơi tiếp xúc trực tiếp với vật liệu có xuất nguyên bào sợi mạch máu tân tạo Đặc biệt giai đoạn sau ghép tuần, quan sát thấy nhiều mạch máu tân tạo mơ liên kết chân bì da màng liên kết xơ bao quanh vật liệu Theo Anderson, dấu hiệu đặc trưng q trình hình thành mơ hạt q trình tích 51 cực tổng hợp collagen để hình thành mô liên kết xơ bao quanh cô lập vật liệu ghép Đây giai đoạn cuối phản ứng chữa lành vết thương vật liệu cấy ghép [18] Mặc dù vật liệu ghép có tính phù hợp sinh học với thể không gây tượng thải ghép tiếp xúc với mô, vật liệu ghép đóng vai trò vật lạ thể phản ứng lại cách hình thành mơ liên kết xơ bao quanh vật liệu Lớp mô liên kết xơ đóng vai trò hàng rào bảo vệ thể, cách ly tương tác vật liệu với mô chỗ cấy ghép [46] Theo thời gian nghiên cứu, có phân tử nhỏ vật liệu vượt qua lớp màng liên kết xơ để tương tác với mô xung quanh, phân tử tương tác không gây tổn thương với mơ làm cho mơ nhận biết thích nghi với có mặt vật liệu [46] Kết giảm phản ứng mô với vật liệu, giảm q trình tích lũy collagen xung quanh vật liệu Theo Ngơ Duy Thìn cộng sự, lớp mơ liên kết xơ bao quanh vật liệu ghép mỏng dần theo thời gian q trình lành hóa vết thương thể chấp nhận sống chung với vật liệu ghép, thích nghi với có mặt vật liệu ghép [50] Trong kết nghiên cứu chúng tôi, lớp mô liên kết bao quanh vật liệu sau ghép tuần mỏng rõ rệt so với thời điểm tuần sau ghép (bảng 3.2) Trong lớp mô liên kết bao quanh vật liệu thời điểm tuần thành phần tế bào chủ yếu tế bào sợi, giảm đáng kể số lượng nguyên bào sợi Điều chứng minh trình tăng sinh, tổng hợp collagen để hình thành lớp mơ liên kết xơ kết thúc bước sang giai đoạn hòa hợp vật liệu với mơ thể Từ nhận thấy thể dần thích nghi, chấp nhận diện mẫu vật liệu thủy tinh thể nhân tạo thể, mẫu vật liệu thủy tinh thể nhân tạo không gây tác động xấu với thể sống cụ thể với vùng mô tiếp xúc trực tiếp Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Virginie Bertrand cộng (2014) Ông tiến hành ghép vật liệu thủy tinh 52 thể nhân tạo vào mô da thỏ đánh giá vi thể vùng mô cấy ghép sau 30 ngày tiêu nhuộm ba màu Masson – Goldner Kết cho thấy số mạch máu tế bào liên quan đến phản ứng viêm phát phần mô tiếp xúc với vật liệu sinh học Và có lớp mơ liên kết xơ bao quanh vật liệu ghép Trên tiêu nhuộm Masson – Goldner, thấy rõ hai vùng riêng biệt lớp mô liên kết xơ (hình 4.2) Một lớp tế bào tiếp xúc trực tiếp với vật liệu sinh học lớp sợi phía liên tiếp với mơ liên kết chân bì da [25] Hình 4.2 Kết vùng mơ sau cấy ghép thủy tinh thể nhân tạo 30 ngày (Nhuộm Masson – Goldner) [25] Trước đó, từ năm 1982, Jennette cộng tiến hành đánh giá phản ứng mô da thỏ sau cấy ghép thủy tinh thể nhân tạo tuần Kết cho thấy, mơ vị trí cấy ghép vật liệu có diễn đáp ứng viêm phản ứng xơ hóa Tuy nhiên phản ứng viêm đặc trưng hệ thống bạch cầu thực bào đơn nhân, khơng có tăng cường phản ứng viêm thứ cấp Điều cho thấy thủy tinh thể nhân tạo có tính phù hợp sinh học cao [30] 53 Thủy tinh thể nhân tạo loại vật liệu sinh học đặc biệt, môi trường tiếp xúc trực tiếp với vật liệu sinh học môi trường bên nhãn cầu Do đó, để đánh giá xác phản ứng mô chỗ với vật liệu cần tiến hành ghép thủy tinh thể nhân tạo vào mắt để đánh giá Tuy nhiên trình cấy ghép vào mắt cần bác sĩ có chuyên môn cao nhãn khoa dụng cụ chuyên dụng Hơn nữa, qua nghiên cứu Jennette (1982) Buchen (2001) cho kết luận phản ứng mô da hay mô vật liệu thủy tinh thể diễn sớm phản ứng mắt với vật liệu Vì sử dụng mơ hình ghép da để tiên lượng cho phản ứng ghép mắt [30], [31] Mơ hình nghiên cứu chúng tơi khơng phản ánh tồn phản ứng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo cấy ghép người cần thiết để đánh giá tính an tồn, khả phù hợp mơ vật liệu trước đưa vào sử dụng lâm sàng Vì vậy, kết nghiên cứu tính phù hợp mô thủy tinh thể nhân tạo thử nghiệm mơ hình động vật có ý nghĩa tiên lượng ứng dụng lâm sàng 4.4.2 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo lên số sinh hóa, huyết học Với vật liệu sinh học chế tạo, trước đưa vào ứng dụng lâm sàng cần chứng minh tính an toàn người sử dụng Do vậy, vật liệu thủy tinh thể nhân tạo Công ty Cổ phần nhà máy thiết bị y học vật liệu sinh học cần tiến hành đánh giá độc tính Trong phạm vi đề tài, tiến hành đánh giá ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo lên số sinh hóa huyết học thỏ trước sau ghép vật liệu thủy tinh thể nhân tạo vào mô da thỏ ngày tuần Từ đánh giá phần độc tính cấp bán cấp vật liệu 54 Ảnh hưởng vật liệu thủy tinh thể nhân tạo đến chức tạo máu thỏ Máu tổ chức quan trọng máu liên quan mật thiết với phận, quan thể [51] Về mặt bệnh lý, máu chịu ảnh hưởng tất quan thể đồng thời bị ảnh hương phản ánh tình trạng riêng quan tạo máu Đặc biệt máu quan tạo máu nhạy cảm với độc tính vật liệu, có ảnh hưởng gây biến đổi số lượng chất lượng tế bào máu ngoại vi Kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy khơng có biến đổi bất thường số lượng hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit số lượng tiểu cầu sau ngày tuần cấy ghép vật liệu vào mô da thỏ (hình 3.10; 3.11; bảng 3.4; 3.6) Tuy nhiên, thời điểm sau ghép vật liệu ngày tuần, lô nghiên cứu lô chứng nhận thấy số lượng bạch cầu giảm có ý nghĩa (p0,05) so với trước cấy ghép so với ghép vật liệu chứng (bảng 3.7; 3.8; 3.9) Để đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan, người ta thường tiến hành định lượng hoạt độ enzym có nguồn gốc tư gan huyết AST (Aspartat aminotransferase) ALT (Alanin aminotransferase) hai loại enzym sử dụng rộng rãi đánh giá tổn thương tế bào gan Khi vật liệu gây độc gan làm hoạt độ hai enzym tăng lên ALT enzym đặc hiệu tổn thương gan, có bào tương đặc biệt tế bào gan Trong đó, AST khu trú nhiều ty thể tổn thương mức độ tế bào AST giải phóng ngồi tăng cao huyết tương Vì tổn thương gan, hoạt độ ALT thường tăng cao AST [53], [54] Trong nghiên cứu này, kết hoạt độ AST khơng có thay đổi thời điểm trước sau cấy ghép (hình 3.12) Tuy nhiên thời điểm 56 sau ghép tuần, hoạt độ ALT tăng lên có ý nghĩa so với trước cấy ghép (p