Định lượng acid alpha lipoic trong chế phẩm bằng kỹ thuật von ampe

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TÔ THU BA MÃ SINH VIÊN: 1301024 ĐỊNH LƯỢNG ACID ALPHA LIPOIC TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT VON - AMPE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TÔ THU BA MÃ SINH VIÊN: 1301024 ĐỊNH LƯỢNG ACID ALPHA LIPOIC TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT VON - AMPE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Vũ Đặng Hồng Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích độc chất Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Khoá luận thực Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội Với lòng biết ơn kính trọng sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Vũ Đặng Hoàng – Giảng viên Bộ mơn Hóa phân tích độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, dành nhiều thời gian, cơng sức, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, anh/chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình bảo tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng ban, thầy tồn thể cán cơng nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội trực tiếp giảng dạyvà giúp đỡ em suốt trình học tập hoạt động trường Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè động viên khuyến khích em q trình học tập thời gian em thực đề tài Hà Nội, tháng 05 năm 2016 Sinh viên Tô Thu Ba MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Kỹ thuật cực phổ 1.1.1 Kỹ thuật cực phổ sóng vng (Square wave Polarography) .3 1.2 Acid alpha lipoic CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng – nguyên liệu thiết bị 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2 Nguyên liệu thiết bị 13 2.1.2.1 Nguyên liệu 13 2.1.2.2 Dụng cụ 13 2.1.2.3 Máy móc thiết bị .13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3 Xử lý kết thực nghiệm 14 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15 3.1 Thực nghiệm, kết 15 3.1.1 Chuẩn bị hóa chất 15 3.1.1.1 Pha đệm vạn (đệm Britton – Robinson) .15 3.1.1.2 Pha đệm borat 15 3.1.1.3 Pha đệm phosphate 0,1M pH 9,0 15 3.1.1.4 Pha dung dịch đệm amoni 0,1M pH 9,0 15 3.1.2 Chuẩn bị mẫu 16 3.1.2.1 Pha mẫu chuẩn .16 3.1.2.2 Pha dung dịch Co2+ gốc .16 3.1.3 Xây dựng phương pháp định lượng ALA kĩ thuật cực phổ sóng vng…………………………………………………………………………… 16 3.1.3.1 Cơ chế phản ứng khử cực ALA điện cực giọt thủy ngân treo 16 3.1.3.2 Lựa chọn điều kiện phân tích 18 3.1.3.3 Thẩm định phương pháp 26 3.2 Ứng dụng phương pháp cực phổ sóng vng để định lượng ALA chế phẩm 30 3.2.1 Xử lý mẫu………………………………………………………………… 30 3.2.1.1 Viên nang mềm 30 3.2.1.2 Viên nén .30 3.2.2 Kết định lượng 31 3.3 Ứng dụng phương pháp cực phổ sóng vng để sơ khảo sát ALA nước tiểu .32 3.3.1 Định lượng ALA nước tiểu 32 3.4 Bàn luận 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril ALA Alpha Lipoic Acid Acid alpha lipoic C Concentration Nồng độ E Electric Potential Điện HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao I Current intensity Cường độ dòng điện RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SWP Square wave polarography Cực phổ sóng vuông UV Ultraviolet Tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các tính chất lý hóa chung ALA Bảng Các phương pháp định lượng ALA Bảng Các chế phẩm mẫu tự tạo có chứa ALA nghiên cứu 12 Bảng Các thông số máy đo cực phổ von – ampe vòng……………………… 16 Bảng Các thông số máy đo cực phổ sóng vng 19 Bảng 3 Các thông số máy không thay đổi khảo sát phép đo cực phổ sóng vng .23 Bảng Kết đo SWP ALA 30nM có mặt Co2+ 30µM theo mơ hình 24 Bảng Kết đo cường độ dòng điện I(nA) đệm tương ứng 25 Bảng Kiểm tra tính thích hợp hệ thống 26 Bảng Điều kiện đo cực phổ sóng vng 27 Bảng Kết khảo sát tuyến tính kỹ thuật cực phổ sóng vng ALA 27 Bảng Kết kiểm tra độ độ lặp phương pháp 29 Bảng 10 Kết định lượng ALA chế phẩm thị trường 32 Bảng 11 Kết đo cực phổ sóng vng ALA nước tiểu phương pháp thêm đường chuẩn .33 Bảng 12 Kiểm tra độ lặp độ phép đo cực phổ sóng vng định lượng ALA nước tiểu 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Tế bào đo cực phổ Hình Dòng khử catod i1 dòng oxy hóa anod i2 cực phổ sóng vng Hình Cơng thức cấu tạo ALA Hình Các cực phổ đồ von – ampe vòng dung dịch ALA 0,2µM đệm vạn 0,1M pH ≥7,95…………………………………………………………… 17 Hình Các cực phổ đồ Von – ampe vòng dung dịch Co2+ 5µM đệm vạn 0,1M từ pH ≥7,95 17 Hình 3 Các cực phổ đồ von – ampe vòng dung dịch ALA 0,2µM có mặt Co2+ 5µM đệm vạn 0,1M pH 7,95 (a); 8,36 (b); 8,95(c); 9,91 (d) 10,88 (e) 18 Hình 12 Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn 30 Hình 13 Cực phổ đồ ALA dịch nang chế phẩm Ubiheal 100mg 31 Hình 14 Cực phổ đồ ALA vỏ nang chế phẩm Ubiheal 100mg 31 Hình 15 Cực phổ đồ ALA chế phẩm Thiogamma® 600mg .32 Hình 16 Cực phổ đồ sóng vng nước tiểu khơng có nước tiểu có ALA .33 Hình 17 Đồ thị biểu diễn phương pháp thêm đường chuẩn để định lượng ALA nước tiểu 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Alpha lipoic acid (ALA) – hay gọi acid thiotic, hợp chất organosulfur có nguồn gốc từ acid caprylic ALA phát nhà enzyme học Irwin Gunsalus (Đại học Illinois – Hoa Kỳ) vào năm 1948 đặc điểm hóa sinh chất Lester J.Reed (Đại học Texas – Hoa Kỳ) nghiên cứu vào năm 1951 [9] ALA chất chống oxy hóa mạnh có khả tiêu diệt gốc tự bảo vệ tế bào khỏi tác hại mơi trường nhiễm, nhờ giúp trẻ hóa bề mặt làm trắng sáng da [4] Cơ chế chống oxy hóa ALA tương tự vitamin E C, mạnh nhiều lần Ngoài ra, ALA giúp hồi phục hoạt tính chống oxy hóa vitamin E, vitamin C, coenzym Q10, glutathione, kích thích chế sản xuất glutathione nội sinh Kết nghiên cứu cho thấy vai trò tích cực ALA giảm thiểu nguy bệnh tim mạch [28]; ngăn ngừa cải thiện biến chứng thần kinh bệnh nhân đái tháo đường [12]; ngăn chặn suy thoái não [17] Trong tự nhiên ALA tổng hợp ty thể tế bào, đóng vai trò coenzyme cho pyruvate dehydrogenase ketoglutarate dehydrogenase Tuy nhiên, lượng ALA thể người sản xuất thấp giảm dần theo tuổi Do ALA thường bổ sung từ thực phẩm (thịt đỏ, thận, tim, gan, rau bina, cải xanh, đậu Hà Lan, cải mầm brussel, cám gạo, nấm men) thực phẩm chức Để định lượng ALA chế phẩm, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) quy định dùng Dược điển Mỹ Hiện nay, Dược điển Việt Nam IV chưa có chuyên luận chế phẩm có chứa ALA Với mong muốn đề xuất phương pháp phân tích để định lượng ALA chế phẩm sơ khảo sát nước tiểu sở có trang bị máy cực phổ, đề tài thực với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp định lượng ALA chế phẩm kỹ thuật von – ampe (cực phổ sóng vng) Ứng dụng phương pháp xây dựng để định lượng ALA số chế phẩm lưu hành thị trường sơ khảo sát mẫu nước tiểu tự tạo CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Kỹ thuật cực phổ Phân tích von – ampe nhóm kỹ thuật điện hóa biểu diễn phụ thuộc cường độ dòng diện vào điện tiến hành điện phân dung dịch phân tích [1] Cực phổ kĩ thuật von – ampe (điện cực công tác giọt thủy ngân) nhà bác học người Tiệp Khắc, J Heyrovsky phát minh năm 1922 Điện cực nhỏ giọt thủy ngân tạo thành từ bầu đựng thủy ngân chảy qua mao quản dài khoảng 10 cm, đường kính khoảng 0,05 mm Thời gian nhỏ giọt điều chỉnh chiều cao bầu thủy ngân dao động khoảng – giây, với đường kính giọt thủy ngân 0,1 – mm Dòng điện qua điện cực dao động khoảng – 100 μA (hình 1.1) Hình 1 Tế bào đo cực phổ Cơ sở phép đo cực phổ dựa phản ứng oxy hóa khử chất phân tích dung dịch điện li điện cực giọt thuỷ ngân theo phản ứng: Ox + ne → Kh Bảng Kết kiểm tra độ độ lặp phương pháp Thu hồi(%) (Trung bình ±SD) Nồng độ (nM) SWP HPLC 24 (n=3) 99,8 ± 0,5 99,5 ± 0,6 30 (n=6) 102,0 ± 1,5 101,0 ± 1,7 36 (n=3) 98,7 ± 0,3 99,0 ± 0,5 Song song tiến hành định lượng ALA mẫu tự tạo phương pháp HPLC (tham khảo USP 38) với điều kiện sau: - Cột: C18 (4,6-mm × 250 mm, 5µm) - Pha động: Acetonitril - đệm (0.68g/L KH2PO4), chỉnh pH 3,0 acid photphoric) (45 : 55) - Thể tích tiêm: 20 µL - Tốc độ dòng: 1,8 ml/phút - Detector: 220 nm Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu trắng thêm chuẩn trình bày hình 3.12 3.13 Hình 11 Sắc ký đồ mẫu trắng 29 Hình 42 Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn So sánh độ hai phương pháp: SWP HPLC test t với độ tin cậy 95% cho thấy hai phương pháp có độ xác tương đương (p < 0,05) 3.2 Ứng dụng phương pháp cực phổ sóng vng để định lượng ALA chế phẩm 3.2.1 Xử lý mẫu 3.2.1.1 Viên nang mềm Phần dịch thuốc nang: Lấy toàn dịch viên nang vào bình định mức 100ml, thêm 50ml methanol, lắc siêu âm khoảng 15 phút, thêm nước vừa đủ, lắc đều, siêu âm khoảng phút Pha loãng dung dịch đệm đệm borat 0,15M pH 8,5 đến nồng độ định lượng (~30nM) Phần vỏ nang: Cho toàn vỏ viên nang vào bình định mức 100ml, thêm 50ml methanol,lắc, siêu âm khoảng 15 phút, thêm nước cất vừa đủ, lắc đều, siêu âm 5phút Pha loãng dung dịch đệm đệm borat 0,15M pH 8,5 đến nồng độ định lượng (~30nM) 3.2.1.2 Viên nén Cân xác 10 viên thuốc cân phân tích, nghiền mịn Cân xác lượng bột thuốc tương ứng với 10,3mg ALA cho vào bình định mức 50ml, thêm 25ml 30 methanol, lắc, siêu âm khoảng 15 phút, thêm nước cất vừa đủ Lọc, loại bỏ 10 – 20ml dịch lọc đầu Pha loãng dịch lọc đệm borat 0,15M pH 8,5 đến nồng độ định lượng (~30nM) 3.2.2 Kết định lượng Tiến hành định lượng phương pháp đường chuẩn, sử dụng kỹ thuật cực phổ sóng vng với điều kiện trình bày bảng 3.7 Kết định lượng trình bày bảng 3.10 hình 3.14, 3.15, 3.16 -400 -350 Mẫu dịch nang Ubiheal 100mg -300 -250 -150 DD điện ly I(nA) -200 -100 -50 E(V) -0.1 -0.6 -1.1 -1.6 Hình 53 Cực phổ đồ ALA dịch nang chế phẩm Ubiheal 100mg -350 DD điện ly -300 Mẫu vỏ nang Ubiheal 100mg -200 -150 I(nA) -250 -100 -50 E(V) -0.1 -0.6 -1.1 -1.6 Hình 64 Cực phổ đồ ALA vỏ nang chế phẩm Ubiheal 100mg 31 -350 -300 Mẫu Thiogamma® -250 DD điện ly I(nA) -200 -150 -100 -50 E(V) -0.1 -0.6 -1.1 -1.6 Hình 75 Cực phổ đồ ALA chế phẩm Thiogamma® 600mg Bảng 10 Kết định lượng ALA chế phẩm thị trường Chế phẩm Hàm lượng % so với nhãn (trung bình ± SD, n = 6) Ubiheal 100mg 103,9 ± 1,1 Ubiheal 200mg 101,5 ± 0,2 Lyodura 97,2 ± 1,4 Thiogamma 100,2 ± 0,6 Puritan’s Pride 101,5 ± 0,2 3.3 Ứng dụng phương pháp cực phổ sóng vng để sơ khảo sát ALA nước tiểu 3.3.1 Định lượng ALA nước tiểu Xác định nồng độ ALA nước tiểu phương pháp thêm đường chuẩn Đem đo cực phổ kỹ thuật xung vi phân sóng vng với dung dịch nước tiểu pha loãng 1000 lần Lần lượt thêm V µl dung dịch chuẩn ALA vào dung dịch trên, tiến hành đo cực phổ Kết thể bảng 3.11 hình 3.17 ; hình 3.18 32 -450 nước tiểu có ALA -400 -350 -250 nước tiểu khơng có ALA I(nA) -300 -200 -150 -100 -50 E(V) -0.1 -0.6 -1.1 -1.6 Hình Cực phổ đồ sóng vng nước tiểu khơng có nước tiểu có ALA Bảng 11 Kết đo cực phổ sóng vng ALA nước tiểu phương pháp thêm đường chuẩn V(µl) C(nM) I(nA) Peak(V) 0 -108,8 -1,331 10 -143,2 -1,286 20 10 -178,5 -1,286 30 15 -215,8 -1,271 40 20 -254,4 -1,271 50 25 -287,0 -1,286 60 30 -323,8 -1,286 33 -350 y = -7.2036x - 107.87 R² = 0.9997 -300 I(nA) -250 -200 -150 -100 -50 nM -20 -10 10 20 30 40 Hình 97 Đồ thị biểu diễn phương pháp thêm đường chuẩn để định lượng ALA nước tiểu Từ đồ thị , ta tính nồng độ ALA nước tiểu điểm giao đường chuẩn với trục hoành: 15,0nM Kết khảo sát độ độ lặp phép định lượng trình bày bảng 3.12 Bảng 12 Kiểm tra độ lặp độ phép đo cực phổ sóng vng định lượng ALA nước tiểu Nước tiểu STT Nước tiểu +2,5nM Nước tiểu +7,5nM Tìm lại Thu hồi Tìm lại Thu hồi Tìm lại Thu hồi (nM) (%) (nM) (%) (nM) (%) Lần 15,0 100,0 17,8 101,6 22,2 98,7 Lần 15,3 102,0 18,1 103,4 22,7 100,9 Lần 15,2 100,1 17,6 100,6 22,6 100,4 TB 15,17 100,7 17,8 101,8 22,5 100,0 SD 0,1 0,9 0,2 1,2 0,2 0,9 0,8% 0,9% 0,2% 1,1% 1,0% 0,9% RSD Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) cho phép định lượng ALA nước tiểu tính theo cơng thức: LOD = 3,3 × (Sy/S) 34 LOQ = 10 × (Sy/S) Trong đó: Sy S độ lệch chuẩn hệ số chắn độ dốc đường chuẩn mô tả mối quan hệ tuyến tính nồng độ ALA (15 – 45 nM) nước tiểu với cường độ dòng đo được: y = – 5,5745 ALA – 59,561 (R2 = 0,9967) Kết cho thấy LOD LOQ phép định lượng ALA nước tiểu 2,7 8,1 nM 3.4 Bàn luận Thông thường, khử hydro cực giọt thủy ngân xảy cực giọt thủy ngân áp khoảng – 1,5V so với điện cực so sánh Tuy nhiên, sóng khử cực hydro xảy vùng < – 1,5V có mặt số chất hữu (sóng hydro xúc tác – catalytic hydrogen wave) [13] Các nghiên cứu gần sử dụng sóng khử cực xúc tác để định lượng kim loại mẫu khác [11, 18, 22] Trong khóa luận này, chế phản ứng điện phân ALA cực giọt thủy ngân treo nghiên cứu với chế độ quét von-ampe vòng Hình 3.1 3.2 cho thấy (i) sóng cực phổ tương ứng với phản ứng oxy hóa khử thuận nghịch ALA (biến đổi từ liên kết disulfide sang dithiol ngược lại) pH 9,91; (ii) khơng có sóng cực phổ đặc trưng cho ion Co2+ khoảng pH khảo sát từ 7,95 đến 10,88 Ngược lại, sóng khử cực xuất cực phổ đồ von – ampe vòng dung dịch ALA 0,2µM có mặt 5µM Co2+ (hình 3.3) Theo lý thuyết sóng hydro xúc tác, q trình tạo sóng hydro ALA xảy theo ba giai đoạn: (i) proton hóa ALA (do phân tử ALA có dị nguyên tử S cặp điện tử tự do); (ii) ion hydro phức hợp vừa tạo thành nhận điện tử để tạo thành gốc tự ALA bề mặt giọt thủy ngân; (iii) hai gốc tự ALA (kém bền) kết hợp lại để giải phóng phân tử hydro ALA + H+ → (ALA)H+ (i) (ALA)H+ + e → (ALA)H● (ii) 2[(ALA)H●] → ALA-ALA + H2 Q trình xảy ion phức tích điện dương Co2+ ALA [27] theo tỉ lệ 1:2 tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng trao đổi điện tử bề mặt giọt thủy 35 ngân Kết phù hợp với nghiên cứu trước thực Shunitz Tanaka Hitoshi Yoshida [23] Mối quan hệ tuyến tính pic pH đệm biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính E = – 0,0891 pH – 0,52, với R2 = 0,999 (hình 3.4) Trong khóa luận này, việc lựa chọn điều kiện phân tích cho phép đo cực phổ sóng vng bắt đầu khảo sát loại dung dịch đệm (hình 3.5 3.6) nồng độ Co2+ (hình 3.7) sử dụng Kết cho thấy cực phổ đồ sóng vng ALA 30nM cho pic nhọn đều, cường độ dòng thấp với đệm borat nồng độ 0,15M pH 8,5 Tiến hành thực nghiệm sử dụng thiết kế nhân tố toàn phần (bảng 3.4) cho thấy điều kiện tối ưu phép định lượng cực phố sóng vng điện cực giọt thủy ngân cho ALA xác định Thời gian tích góp Bước Biên độ xung Tần số Thế tích góp 20 s 0,015 V 0,03V 60Hz –0,6 V Khoảng Thời gian cân Thời gian sục khí Tốc độ khuấy Kích cỡ giọt ÷ –1,6 V 5s 60 s 2000 vòng/phút Trên sở điều kiện phân tích lựa chọn trên, phép định lượng ALA chế phẩm thẩm định theo tiêu chí khoảng tuyến tính (bảng 3.8 hình 3.10, 3.11), độ (bảng 3.9) Kết khảo sát (bảng 3.8) với dung dịch chuẩn ALA 30nM cho thấy thông số lựa chọn máy cực phổ Computrate 797 VA hoàn toàn thỏa mãn yêu cầu tính thích hợp hệ thống (bảng 3.6) Cực phổ đồ sóng vng dung dịch ALA cho thấy mối tương quan chặt chẽ cường độ dòng đo nồng độ ALA khoảng 15 ÷ 45nM (R2= 0.9972) (3.11) Cực phổ đồ sóng vng mẫu placebo đệm borat khơng xuất píc khoảng xuất sóng hydro xúc tác ALA 36 (–1,1 ÷ –1,6) Phương pháp định lượng ALA chế phẩm có độ lặp (RSD < 2%) độ khoảng 98 - 102% đạt yêu cầu cho phép phân tích hoạt chất chế phẩm (bảng 3.9) theo qui định ICH [10] Ngồi ra, , khơng có sai khác có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% kết định lượng phương pháp cực phổ sóng vng xây dựng so với phép định lượng HPLC [25] (bảng 3.9) Áp dụng phương pháp xây dựng để xác định hàm lượng ALA chế phẩm viên nang, viên nén lưu hành thị trường cho thấy hàm lượng thực tế ALA chế phẩm khảo sát đạt khoảng 99 ÷ 102% so với hàm lượng ghi nhãn Các điều kiện cực phổ sóng vng lựa chọn áp dụng để định lượng ALA mẫu nước tiểu kỹ thuật thêm đường chuẩn (bảng 3.11, hình 3.18) với độ độ lặp tương ứng 100,7% tìm lại RSD = 0,9% (bảng 3.12) Phép định lượng có giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) tương ứng 2,7 8,1 nM., đáp ứng yêu cầu định lượng nồng độ ALA nước tiểu khoảng nồng độ 15 ÷ 45nM Phương pháp đạt yêu cầu độ chọn lọc theo yêu cầu nước tiểu không xuất pic xảy vị trí sóng hydro xúc tác, xuất pic có mặt ALA nước tiểu [26] Nồng độ ALA nước tiểu thu sau uống 600mg/ngày khóa luận thấp nhiều so với công bố tác giả Jen Teichert (giả thiết khoảng 12,4% ALA xuất nguyên dạng qua nước tiểu vòng 24h) [24] 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Trong khóa luận giải vấn đề sau: 1- Lựa chọn điều kiện thích hợp để định lượng ALA kỹ thuật cực phổ sóng vuông sau - Dung dịch điện ly nền: đệm borat 0,15M, pH 8,5 - Thông số kỹ thuật phép đo: Thời gian tích góp Bước Biên độ xung Tần số Thế tích góp 20 s 0,015 V 0,03V 60Hz –0,6 V Khoảng ÷ –1,6 V Thời gian cân 5s Thời gian sục khí 60 s Tốc độ khuấy 2000 vòng/phút Kích cỡ giọt 2- Xây dựng phép định lượng ALA chế phẩm với khoảng nồng độ tuyến tính 15 ÷ 45nM thỏa mãn yêu cầu độ lặp (RSD