Nghiên cứu và xác định một số steroid trong thực phẩm bằng kỹ thuật

Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh MỞ ĐẦU Ngày nay, sống nâng cao, đời sống vật chất tinh thần ngày cải thiện, người quan tâm tới sức khỏe nhiều Tuy nhiên, phải bắt nhịp với thời đại công nghiệp hóa khiến người bận rộn hơn, thời gian eo hẹp, đủ thời gian để chăm sóc chu đáo cho thân Như vậy, thực phẩm chức lựa chọn mà người hướng tới Nhưng thực tế nay, hiểu biết sử dụng thực phẩm chức hạn chế Theo định nghĩa Bộ Y tế, thực phẩm chức thực phẩm dùng để hỗ trợ chức phận thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng giảm bớt nguy bệnh tật Một số nhà kinh doanh sản xuất lợi dụng lòng tin người tiêu dùng nên thổi phồng mức tác dụng thực phẩm chức khiến không người coi thực phẩm chức “thần dược” chữa bách bệnh Corticosteroid nhóm chất có gốc steroid tuyến thượng thận thể sản xuất với tác dụng chống viêm mạnh, chống dị ứng ức chế miễn dịch Corticosteroid sản xuất với hàng loại hoạt chất khác sử dụng cho việc thay hocmone để xử lý biến chứng bệnh ung thư điều trị ung thư, sử dụng trường hợp viêm khớp nghiêm trọng Song, việc sử dụng điều trị corticosteroid cần có theo dõi chặt chẽ định bác sĩ, sử dụng sai mục đích liều lượng gây tác dụng phụ dẫn tới hậu nghiêm trọng Tuy nhiên, tác dụng thể mà nhà sản xuất kinh doanh gian lận, bổ sung corticosteroid vào thực phẩm chức nhằm kích thích tác dụng nhanh chóng sản phẩm mà không quan tâm tới tác hại tác dụng phụ dùng lâu dài sai mục đích Trong năm vừa qua, Việt Nam giới liên tiếp phát vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm: Thực phẩm chức tác Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh dụng giảm cân có bổ sung sibutramine; sản phẩm hỗ trợ điều trị xương khớp lại có gian lận chứa dexamethasone, piroxicam, furosemide; sản phẩm hỗ trợ tăng cường sinh lực kiểm tra lại phát hợp chất không cho phép sidenafil; sản phẩm hỗ trợ chức cho thể ghi nhãn công bố không thành phần chất lượng… Những loại thực phẩm chức bổ sung hoạt chất có tác dụng thuốc để gian lận hiệu tác dụng Đặc biệt, thời gian qua quan quản lý xử lý nhiều lô hàng thực phẩm chức nguồn gốc xuất xứ rõ ràng, không chất lượng công bố Do để giúp bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng hỗ trợ quan chức kiểm soát tốt vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm thực phẩm chức năng, tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định số steroid thực phẩm kỹ thuật sắc ký” với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định tính định lượng số steroid thực phẩm chức - Ứng dụng quy trình xây dựng cho phân tích số sản phẩm thực phẩm chức lưu hành thị trường Việt Nam Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan steroid 1.1.1 Khái niệm steroid [2] Steroid hợp chất chất béo hữu hòa tan có nguồn gốc tự nhiên tổng hợp, có công thức phân tử từ 17 nguyên tử cacbon xếp thành vòng, bao gồm sterol axit mật, nội tiết tố từ thượng thận, kích thích tố giới tính Steroid đa dạng phong phú, bao gồm tiền chất số loại vitamin vitaminD, sterol (ví dụ: Cholesterol) axit mật Các nhóm khác steroid bao gồm: corticosteroid, steroid đồng hóa, steroid androgenic, oestrogenic steroid, progestogenic steroid chống viêm Các loại steroid khác sử dụng chuỗi vòng khác gốc cacbon Steroid phổ biến loài thực vật động vật Ở người, steroid tiết từ buồng trứng tinh hoàn, vỏ não, tuyến thượng thận, thai Steroid phân tử lipid phức tạp hình thành dựa phân tử cholesterol có ảnh hưởng đến trình sinh học thể, trình tăng trưởng, trình sinh dục, chức sinh lý khác Hình 1.1: Cấu trúc khung steroid 1.1.2 Phân loại steroid [4] Các steroid phân chia thành nhóm sau theo tác dụng dược lý: - Steroid đồng hóa: Là nhóm chất hóa học tổng hợp tự nhiên hocmone steroid, giúp thúc đẩy tăng trưởng bắp phân chia tế bào, dẫn đến tăng trưởng mô xương, làm tăng kích thước xương sức khỏe Tất steroid Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh đồng hóa dẫn xuất từ hocmone sinh dục nam Steroid đồng hóa làm tăng cân cực nhanh, tăng trọng lượng cơ, tăng chất béo tự do, kích thước sợi trình luyện tập thể thao - Corticosteroid nhóm loại thuốc chống viêm tương tự kích thích tố Corticosteroid tuyến thượng thận thể tự sản xuất Corticosteroid quan trọng loạt hệ thống phản ứng sinh lý thể stress, phản ứng miễn dịch, hình thức viêm, chuyển hóa carbonhydrat, dị hóa đạm, điện máu phân cấp, hành vi người - Hocmone giới tính nhóm steroid hocmone sản xuất vỏ thượng thận Estrogen progesterone gọi hocmone giới tính nữ, adrogens hocmone sinh dục nam Hocmone dùng để phát triển trì đặc điểm giới tính thứ cấp sơ cấp, chuẩn bị cho việc mang thai, hay phát triển giao tử Phái nam có hocmone testosterone, nữ giới có estrogen progesterone - Prohocmones hay gọi chất tiền hocmone, chất hocmone, trở thành hocmone nam nữ gan dựa hoạt động enzym Tùy người nam hay nữ mà tạo thành hocmone nam hay nữ 1.1.3 Tính chất steroids [12,13] Steroid ester phức tạp rượu đa vòng sterol với axit béo cao phân tử, nhóm có cấu trúc tương tự nhau, có động vật thực vật Cấu trúc Steroid có khung cacbon pentacyclohexan Đa số steroid đun nóng với selen 3600C tạo hợp chất Diel có công thức phân tử C36H18 nên chúng định nghĩa “steroid hợp chất đun nóng với selen 3600C cho hợp chất hydrocacbon diel” Ở trạng thái thông thường, chúng chất rắn kết tinh, có tinh thể màu trắng, tan nước tan dung môi hữu diclomethan, triclomethan, ete Các steroid trạng thái tự hòa tan máu theo máu tới quan thể Steroid vào tế bào, thẩm thấu qua màng tế bào kết Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh hợp với protein tạo thành phức hợp lipoprotein dễ dàng hòa tan di chuyển đến quan thể thực chức 1.1.4 Tác dụng sinh học steroid [4, 12] Steroid phân loại thành nhiều nhóm khác tùy theo tác dụng sinh lý thể bao gồm: sterol, cholesterol, vitamin D, axit mật, steroid hocmone sopagenin Qua thấy tác dụng steroid phong phú đa dạng, có tác dụng chống viêm, tác dụng tính dục tác dụng sinh lý khác - Sterol chiết xuất từ động vật (zoosterol), thực vật (phytosterol) từ nấm (mycosterol) Một sterol quan trọng cholesterol, có mật, não, quan sinh dục nam Có vai trò quan trọng việc hình thành mô tế bào kích thích tố (gọi hocmone) Nó tiền chất để tổng hợp hợp chất steroid khác vitamin D, hocmone sinh dục - Vitamin D dẫn xuất steroid, thể tồn dạng tiền vitamin D, tác dụng ánh sáng tia tử ngoại dạng tiền vitamin chuyển hóa thành vitamin Vitamin D có tác dụng tăng cường hấp thụ canxi photphate, điều chỉnh photphate thận, thiếu vitamin D gây bệnh còi xương trẻ nhỏ loãng xương người lớn - Các axit mật có túi mật động vật, hình thành oxi hóa cholesterol Có vai trò việc tiêu thụ dầu mỡ Chúng tồn dạng muối kiềm, có khả nhũ hóa phân tử dầu mỡ để chất béo thấm vào ruột Sau axit mật hấp thu trở lại (đến 90%) - Các steroid hocmone sinh dục: Có tác dụng việc cải thiện chức thể vai trò hai giới tính nam nữ khác - Các steroid hocmone tuyến thượng thận: Có tác dụng điều khiển trao đổi chất, muối khoáng, nươc gluxit - Sapogenin nhóm glycozit hòa tan nước có đặc tính chung làm giảm sức căng bề mặt dung dịch Sapogenin thành phần có mặt số loại thuốc quý, cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị nhân sâm, cam thảo, Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh cỏ xước có tác dụng long đờm, tăng cường sinh lực, bồi bổ thể, giảm cholesterol máu, giảm đau nhức xương khớp 1.2 Giới thiệu số corticosteroid nghiên cứu Corticosteroid có chung cấu tạo ol – 21 – dion – 3,20 pregna – – en ngoại lệ Dưới số corticosteroid nghiên cứu Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học số corticosteroid xác định đề tài Khối ST Corticosteroid T Công thức lƣợng Tính chất phân tử phân tử vật lý (g/mol) Tinh thể Cortisone acetate 21-(acetyloxy)-17- C23H30O6 hydroxypregn-4- 402,49 g/mol ene-3,11,20-trione màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 220-2400C Hydrocortisone Tinh thể acetate màu trắng 11β)-11,17,21- C23H32O6 404,2 trihydroxypregn-4- tan tốt dung môi ene-3,20-dione 4- hữu amino Prednisone Dạng tinh thể bột 17,213 dihydroxypregna- C21H26O5 358,428 1,4-diene-3,11,20- mịn màu trắng, không mùi có vị trione đắng Công thức cấu tạo Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh Dạng bột kết prednisolone tinh (11β)-11,17,21- trắng, không trihydroxypregna1,4-diene-3,204 dione màu C21H28O5 360,444 mùi, nóng chảy o 235 C Ít tan nước, tan dung môi hữu Metyl Dạng bột prednisolone (6α, 11β)- 11,17,21- kết tinh màu C22H30O5 374,471 trắng, điểm trihydroxy-6- nóng chảy từ methyl-pregna-1,4- 262 – 264oC diene-3,20-dione Bethamethasone (8S,9R,10S,11S,13 S,14S,16S,17R)-9fluoro-11,17- Dạng tinh dihyroxy-17-(2- thể, bột màu hydroxyacetyl)- trắng, không 10,13,16- C22H29FO5 392,461 có mùi Nhiệt độ trimethyl6,7,8,9,10,11,12,13 nóng chảy ,14,15,16,17- 231-234oC dodecahydro-3Hcyclopenta[α]phen aanthren-3-one 1.3 Vai trò nhóm corticosteroid [3] Các corticosteroid phân loại thành hai dạng: mineralocorticoid glucocorticoid, dựa vào hoạt tính dược lý chúng Các miniralocorticoid Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh thay đổi cân nước - điện giải cách giúp tái hấp thu natri, tiết hydro kali ống thận xa, gây phù cao huyết áp Glucocorticoid có số tác dụng mineralocorticoid tham gia vào số chu trình chuyển hóa khác gồm: tái tạo đường, phân bố lại mỡ, chuyển hóa protein cân canxi  Kháng viêm ức chế miễn dịch: Glucocorticoid có tác dụng chống lại biểu trình viêm, làm giảm tác dụng ức chế chất trung gian gây viêm Cytokin, ecosanoid, giảm giải phóng histamin Làm giảm tập trung bạch cầu ổ viêm đại thực bào giảm hoạt tính thực bào Giảm chức viêm bào sợi, nên giảm sản xuất collagen glycosaminglycan; giảm hình thành mô liên kết Điều góp phần ức chế trình viêm mạn tính làm chậm lành vết thương Giảm sản sinh kháng thể Giảm thành phần bổ thể máu Nhờ tác dụng mà Glucocorticoid chữa phản ứng mẫn, kháng viêm, điều làm đáp ứng viêm có tính chất bảo vệ, làm giảm khả đề kháng nên dễ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm  Tác dụng chuyển hóa: Chuyển hóa glucid protein: glucocorticoid làm tăng đường huyết lúc đói để cung cấp glucose cho mô phụ thuộc glucose não tim nhờ tiến trình sau đây: Ở ngoại biên: Glucocorticoid làm giảm sử dụng glucose, tăng chuyển hóa protein (lúc đói), tăng chuyển hóa lipid, qua cung cấp acid amin glycerol cho tân tạo glucose gan Tại gan: Kích thích gan sản sinh glucose từ acid amin (sản phẩm chuyển hóa protid) glycerol (sản phẩm chuyển hóa lipid) đồng thời tích trữ glucose dạng glycogen  Tác dụng lên chất điện giải cân nước: Mineralocorticoid liều cao gây giữ natri nước, đồng thời gây đào thải K+, điều dẫn đến phù nhược Các dẫn xuất tổng hợp gây tác dụng Ngăn hấp thu calci ruột tăng đào thải qua thận nên giảm dự trữ calci thể Sự đào thải Ca++ qua thận làm tăng calci niệu Có thể trị calci niệu Mineralocorticoid lợi tiểu 1.4 Tình hình sử dụng Corticosteroid [13] Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh Corticosteroid nhóm thuốc sử dụng rộng rãi giới nhiều năm qua Hầu hết phận thể người có bệnh lý cần điều trị với nhóm thuốc này, qua đường tiêm truyền, đường uống dùng chỗ (bôi, xịt, hít, tra mắt) Corticosteroid thường coi dao hai lưỡi mà hai lưỡi sắc bén Người ta bắt đầu ứng dụng chiết xuất hoạt chất từ vỏ thượng thận để điều trị số trường hợp bệnh nặng nguy kịch, số bệnh nan y, thu lượm kết thật bất ngờ vượt mong đợi Và mẻ thuốc corticoid đời dạng nguyên thủy nhất, mang sứ mệnh cứu nguời, cortisone Năm 1949, Hench, Richstein Kendall dùng cortisone để điều trị cho phụ nữ 29 tuổi gần tàn phế chứng thấp khớp Thành công mở cho người bệnh thấp khớp niềm hy vọng lớn thời điểm đó, việc giúp cho người bệnh giảm bớt đau đớn đem họ trở với công việc thường nhật điều bất khả kháng Những đột phá điều trị viêm khớp đem lại cho êkíp Hench giải Nobel y học danh giá vào năm sau đó, năm 1950 Corticosteroid trở thành thần dược, labo tìm cách sản xuất dạng thuốc tiêm, để có tác dụng nhanh hơn, thay đổi cấu trúc hóa học để kéo dài thời gian tác dụng thuốc; nhà lâm sàng học tìm ứng dụng điều trị nhiều loại bệnh khác từ thấp khớp, hen suyễn, dị ứng, phù, mề đay, sốc thuốc, bệnh lý quan khác thận, da, mạch máu, có nguyên miễn dịch Trong số lớn trường hợp, corticoid cho thấy khả đa dạng hứa hẹn cho việc giải số bệnh lý mạn tính Tuy nhiên, việc sử dụng ạt đại trà làm cho người ta phát tác dụng phụ thuốc sớm Sau ngây ngất tác dụng tuyệt vời thuốc, người ta lại phải giật tác dụng phụ corticoid Những gương mặt sưng phù, thay đổi đáng kể hình thể mọc lông mặt, rạn da, gù lưng, nọng mỡ, vết thương nhiễm trùng nặng nề, gãy xương, Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh bộc phát số bệnh kèm làm cho giới chức ngành y phải đưa cảnh báo khẩn cấp cho việc sử dụng Corticosteroid Hiện nay, tình trạng lạm dụng loại thuốc cortisteroid diễn phổ biến không sở khám chữa bệnh tư nhân, thuộc nhiều tỉnh thành nước Rất nhiều người bệnh phải hàng ngày gánh chịu hậu khôn lường việc lạm dụng thuốc gây ra, có biến chứng nặng gây chết người tàn phế vĩnh viễn, bệnh ngày nặng thêm Hàng loạt biến chứng nguy hiểm liều corticod suy tuyến thượng thận, xuất huyết tiêu hóa, loãng xương, xẹp đốt sống, gù vẹo cột sống, tăng đường máu, tăng huyết áp, teo cơ, rối loạn tâm thần, trầm cảm, đục thủy tinh thể, suy giảm chức miễn dịch gây nhiễm trùng hội, chậm phát triển thể chất trẻ em… 1.5 Các phƣơng pháp xác định corticosteroid Xác định hàm lượng steroid thực phẩm nói chung thực phẩm chức nói riêng vấn đề quan tâm Rất nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu xác định nhóm hợp chất nhiều phương pháp khác đối tượng sữa, nước tiểu, huyết thanh…Dưới số phương pháp phổ biến tiến hành thực nghiệm 1.5.1 Phương pháp phân tích sinh học (enzyme-linked immunosorbent assay– ELISA) [11, 22] Hiện nay, ELISA (phương pháp phân tích miễn dịch liên kết enzyme) sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an toàn chất lượng sản phẩm sinh học Nguyên tắc chung dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, kháng thể gắn với enzyme hợp chất phát đo màu Tác giả M.Ebrahimi [22] kiểm tra 17, 20β-dihytroxy-4-pregenen-3-one sử dụng enzyme Acetylcholonesterase chất phát Nguyên lý phương 10 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU Mẫu (2-5g)/ống ly tâm 50 ml + 30 ml methanol Lắc vortex Rung siêu âm 30 phút Ly tâm, lọc dịch qua giấy lọc vào bình cô quay Cô quay gần khô khoảng ml Thêm khoảng 20 ml nước, qua cột SPE C18 - Hoạt hóa: ml n-hexan, ml MeOH, ml nước - Nạp mẫu: tốc độ nhỏ 1ml/phút - Rửa tạp: ml nước, ml nhexan - Rửa giải: 5ml MeOH Vial 1,8mL HPLC Hình 3.11 Quy trình phân tích mẫu thực 64 Bảng 3.10 Kết phân tích mẫu thực Metyl Hydrocortisone Cortisone acetate acetae (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) STT Tên mẫu Prednisolone Prednisone Hỗ trợ tăng cường sinh lực1 (-) (-) (-) Hỗ trợ tăng cường sinh lực (-) (-) Hỗ trợ tăng cường sinh lực (-) Tác dụng hỗ trợ mọc tóc prednisolone Betamethasone Mẫu bổ thận (-) (-) (-) (-) (-) (-) Mẫu bổ thận (-) (-) (-) (-) (-) (-) Hỗ trợ điều trị xương khớp (-) (-) (-) (-) (-) (-) Hỗ trợ điều trị xương khớp (-) 0,62 ppm (-) (-) (-) (-) Tác dụng phòng ngừa bệnh gout (-) (-) (-) (-) (-) (-) Kết phân tích: Trong mẫu phân tích, hầu hết không phát corticosteroid, riêng mẫu cốt thoái vương, thuốc có tác dụng hỗ trợ điều trị xương khớp phát thấy nồng độ prednison mức 0,62 ppm mẫu Mà thành phần không công bố nhãn sản phẩm Như vậy, có tượng gian lận thành phần thuốc thực phẩm chức yêu cầu có quản lý chặt chẽ quan chức 65 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trên sở kết thực nghiệm nghiên cứu để xác định hàm lượng số steroid số thực phẩm chức phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao kết nối detector UV-VIS, thu kết sau: Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao cho xác định corticosteroid bao gồm: - Khảo sát điều cho phân tích sắc ký: cột sắc ký HiQ SIL C18 (250 mm × 4,6 mm × µm); pha động kênh A dung dịch KH2PO4 20mM nước, kênh B acetonitrile; chương trình rửa giải gradient, phát định lượng λ = 254 nm - Khảo quy trình làm qua cột chiết pha rắn SPE C18: Mẫu chiết methanol, cô gần cạn hòa cặn nước trước qua cột; khảo dung môi rửa giải methanol thể tích rửa giải ml Xây dựng khoảng tuyến tính từ 0,3÷150 ppm, có hệ số xác định R2 > 0,99, phương pháp có giới hạn phát 64-78ppb, giới hạn định lượng corticosteroids tương ứng từ 0,210 - 0,257ppm, độ lệch chuẩn tương đối từ 2,62 – 7,21% độ thu hồi chất đạt từ 88,2 – 104,2% Tiến hành phân tích mẫu thực phẩm chức lưu hành địa bàn Hà Nội, phát có chất nghiên cứu mẫu Từ kết thu được, nhận thấy phương pháp phân tích có độ nhạy đạt yêu cầu, phân tích nhanh xác, áp dụng phân tích hợp chất corticosteroid với độ tin cậy cao Chúng tiếp tục mở rộng phương pháp phân tích đồng thời nhiều chất khác thuộc nhóm steroid Và tiếp tục mở rộng đối tượng phân tích, không phạm vi thực phẩm chức mà đối tượng sản phẩm thực phẩm bổ sung vi chất sữa Đối với đối tượng này, yêu cầu độ nhạy cao, hướng nghiên cứu mở rộng thực thiết bị đại sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối khối phổ 66 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Long Biên, hóa học phân tích định lượng, NXB khoa học kỹ thuật (2001) Dược lý học tập (2007), Y tế, nhà xuất Y học Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa học phân tích, phần 2, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Hóa dược tập (2007), Y tế, nhà xuất Y học Nguyễn Đức Huệ (2005), Các phương pháp phân tích Hữu cơ, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội Từ Văn Mặc (1995), phân tích hóa lý(1995): Các phương pháp phân tích công cụ (2005), Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Đặng Sĩ Kha (2007), “Khảo sát hàm lượng progesterone sữa kỹ thuật ELISA để chẩn đoán mang thai sớm, chặn động dục phối nhiều lần không đậu cho bò sữa công ty cổ phần sữa Long Thành hộ lân cận tỉnh Đồng Nai”, Công nghệ sinh học, Đại học Nông – Lâm TP Hồ Chí Minh Cao Minh Quang (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao, Nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 10 Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng hóa học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 11 Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 12 Trang mạng Web thehinh.com lợi ích steroid, 67 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh http://webthehinh.com/community/threads/6681/ 13 Trang mạng, tác hại steroids: http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/ttyh/bshkhkt/tachaicuacorticoid.htm Tiếng Anh 14 Adam Tolgyesi, Virender K.Sharma, Jeno Fekete (2011), “Development and validation of a method for determination of corticosteroids in pig fat using liquid chromatography - tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 879, 403 - 410 15 Carolina Ferranti, Fernanda Delli Quadri, Luca Palleschi, Camilla Marchiafava, Marzia Pezzalato, Elena Bozzetta, Maria Caramelli, Rosa Draisci (2011), “Studies on the presence of natural and synthetic corticosteroids in bovine urine”, Steroid, 76, 616 - 625 16 Chen Li-Qin, KANG Xue-Jun, YAN Yan, GU Zhong Ze, LU Zu-Hong (2012) “Packed-nanofiber solid-phase extraction column for determination of cortisol in hair samples”, Chinese journal of analytical chemistry, 40, 124-128 17 Eszter Desi, Agnes Kovacs, Zoltan Palotai, Aniko Kende (2008), “Analysis of dexamethasone and prednisolone residues in bovine milk using matrix solid phase dispersion-liquid chromatography with ultraviolet detection”, Microchemical Journal 89, 77-81 18 Jean-Philippe Antignac, Bruno Le Bizec, fabrice Monteau, Francois Andre (2002), “Study of natural and artifical corticosteroid phase II metabolites in bovine urine using HPLC-MS/MS”, Steroid, 87, 873 - 882 19 Lokinendi V.Rao, John R.petersen, Michael G.Bisell, Anthony O.Okorodudu, Amin A Mohammad (1999), “Development of a urinary free cortisol assay using solid-phase extraction-capillary electrophoresis”, Journal of Chromatography B, 730, 123-128 68 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh 20 Magali Hay, Piere Mormede (1997), “Improved determination of urinary cortisol and cortisone, or corticosterone and 11-dehydrocorticosterone by highperformance liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection”, Journal of Chromatography B, 702, 33-39 21 Meen-Woon Hsiao, S-T Lin (1997) “Separation of steroids by micellar electrokinetic capillary chromatography with sodium cholate”, Journal of chromatography science, vol 35 22 M.Ebrahimi “A rapid ELISA method for 17, 20β-dihydroxy-4-pregenen-3-one (17,20βP) hormone using Acetylcholinesterase as tracer”, Original artical 23 Qiang Fu, Minshan Shou, Dwight Chien, Robert Markovich, Abu M.Rustum (2010), “Development and validation of a stability- indicating RP-HPLC method for assay of betamethasone and estimation of its relates compounds ”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical analysis 51, 617-625 24 Robin Difrancesco, Valerie Frerichs, Julie Donnelly, Colleen Hagler, Jill Hochreiter, Kathleen M Tornatoer cortisol, dexamethasone, (2007), “Simultaneous determination of methylprednisolone, prednisone, prenisolone, mycophenolic acid and mycophenolic acid glucuronide in human plasma utilizing liquid chromatography – tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 859, 42-51 25 R.Simersky, J.Swaczynova, D.A.Morris, M.Franek, M.Strand (2007) “Development of an ELISA-based kit for on-farm determination of progesterone in milk”, Veterinarni Medicina, 52, 19-28 26 Tadamichi Tobita, Masamitsu Senarita, Akira Hara, Jun Kusakari (2007), “Determination of prenisolone in cochlear tissue”, Hearing research, 165, 30-34 27 Thermo Fisher Scientific, “Developing a GC-MS/Ms method for the analysis of steroid using mass frontier”, Austin, TX, USA, Application Note 10050 69 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh 28 Umeu Universitet (2009) “Derivatization of steroids for gas chromatography”, Chromatography D, 10p 29 Valerie A.Frerichs, Kathleen M Tornatore (2004), “Determination of the glucocorticoids prednisone, prednisolone, dexamethansone and cortisol in human serum using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography B, 802, 329-338 30 Wei Gao, Qiaozhen Xie, Jing Jin, Ting Qiao, Haiyang Wang, Liqin Chen, Huihua Deng, Zuhong Lu (2010), “HPLC-FLU detection of cortisol distribution in human hair”, Clinical Biochemistry , 43, 677-682 31 Yan Zhang, Hai-Long Wu, Yu-Jie Ding, A-Lin Xia, Hui Cui, Ru-Qin Yu (2006), “Simultaneous determination of cortisol and prednisolone in body fluids by using HPLC-DAD coupled with second-order calibration based on alternating trilinear decomposition ”, Journal of Chromatography B, 840, 116-123 70 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh Phụ lục A: Xây dựng đƣờng chuẩn khoảng tuyến tính Hình a.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ prednison khoảng 0,35 – 140 ppm Hình a.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ metyl prednisolon khoảng 0,34– 156ppm Hình a.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ betamethason khoảng 0,33– 134ppm 71 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh Hình a.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ hydrocortison acetate khoảng 0,32– 137ppm Hình a.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ cortison acetate khoảng 0,39– 158ppm 72 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh Phụ lục B: Sắc đồ phân tích hỗn hợp chuẩn Hình b.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp mức nồng độ 1ppm Hình b.2 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp mức nồng độ 10ppm Hình b.3 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp mức nồng độ 50ppm 73 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh Phụ lục C: Sắc đồ mẫu thêm chuẩn xác định độ lặp lại độ thu hồi Hình c.1 Sắc đồ mẫu thêm chuẩn mức độ thấp Hình c.2 Sắc đồ mẫu thêm chuẩn mức độ trung bình Hình c.3 Sắc đồ mẫu thêm chuẩn mức độ cao 74 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh Phụ lục D: Sắc đồ phân tích mẫu thực Hình d.1 Sắc đồ phân tích mẫu tác dụng tăng cường sinh lực1 không phát chất phân tích mV Detector A Ch1:254nm 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình d.2 Sắc đồ phân tích mẫu tác dụng tăng cường sinh lực không phát chất phân tích 75 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh Hình d.3 Sắc đồ phân tích mẫu tác dụng tăng cường sinh lực không phát chất phân tích mV Detector A Ch1:254nm 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình d.4 Sắc đồ phân tích mẫu tác dụng mọc tóc không phát chất phân tích mV Detector A Ch1:254nm 325 300 275 250 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình d.5 Sắc đồ phân tích mẫu bổ thận không phát chất phân tích 76 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh mV Detector A:254nm 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình d.6 Sắc đồ phân tích mẫu bổ thận không phát chất phân tích mV Detector A:254nm 40 35 30 25 20 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình d.7 Sắc đồ phân tích mẫu hỗ trợ điều trị xương khớp không phát chất phân tích 77 Luận văn thạc sĩ Vũ Thị Kim Oanh /3.563/1166355 mV Detector A:254nm 50 45 40 35 30 25 /2.917/32246 20 15 10 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình d.8 Sắc đồ phân tích mẫu hỗ trợ phòng ngừa bệnh Gout không phát chất phân tích Hình d.9 Sắc đồ phân tích mẫu hỗ trợ điều trị xương khớp phát chất phân tích prednisone 78 ... sinh thực phẩm thực phẩm chức năng, tiến hành đề tài Nghiên cứu xác định số steroid thực phẩm kỹ thuật sắc ký” với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định tính định lượng số steroid thực phẩm. .. Các phƣơng pháp xác định corticosteroid Xác định hàm lượng steroid thực phẩm nói chung thực phẩm chức nói riêng vấn đề quan tâm Rất nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu xác định nhóm hợp chất... thiệu số corticosteroid nghiên cứu Corticosteroid có chung cấu tạo ol – 21 – dion – 3,20 pregna – – en ngoại lệ Dưới số corticosteroid nghiên cứu Bảng 1.1 Cấu trúc hóa học số corticosteroid xác định