Xác định hàm lượng một số flavonoids trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - - HOÀNG QUỲNH TRANG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ FLAVONOIDS TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC- CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ HỒNG HẢO PGS.TS NGUYỄN THỊ MINH TÚ HÀ NỘI – 2014 Luận văn thạc sĩ Hồng Quỳnh Trang LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan luận văn kết nghiên cứu làm việc tôi, kết quả, số liệu luận văn trung thực, thực tế nơi nghiên cứu Hà Nội, tháng 03 năm 2014 Tác giả luận văn Hồng Quỳnh Trang Học viêc cao học khóa 2011B I Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang LỜI CẢM ƠN Lời cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài viết luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy Viện Công nghệ Sinh Học – Công nghệ thực phẩm, cho em kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban giám hiệu trường Đại học kỹ thuật Y tế Hải Dương, khoa Y học dự phòng – Y tế cộng cộng labo xét nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi để học tập hồn thành đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Th.s DS Cao Cơng Khánh anh chị labo Hóa – Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp đỡ nhiều q trình làm thực nghiệm Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn tơi Hà Nội, năm 2014 Học viên Hồng Quỳnh Trang II Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID 1.1.1 Khái niệm Flavonoid [4] 1.1.2 Phân loại Flavonoid 1.1.3 Tính chất flavonoid [4] .4 1.1.4 Tác dụng sinh học Flavonoid .5 1.2 Giới thiệu flavonoids nghiên cứu 1.3 Một số phản ứng định tính flavonoid .9 1.4 Các phương pháp xác định Flavonoid 10 1.4.1 Phương pháp phân miễn dịch phóng xạ(radioimmunoassay – RIA) 10 1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng 11 1.4.2.1 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng với dectecter UV-VIS 11 1.4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng siêu cao áp[28] 14 1.4.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS [32] .14 1.5 Phương pháp HPLC .16 1.5.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng 16 1.5.2 Phân tích định tính định lượng HPLC [1, 7] 18 1.6 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 19 1.6.1 Mục tiêu 19 1.6.2 Nộidung 19 III Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Hóa chất dụng cụ nghiên cứu 20 2.2.1 Thiết bị 20 2.2.2 Dụng cụ 20 2.2.3 Hóa chất 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu .22 2.3.2 Phương pháp phân tích 22 2.3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 22 2.4 Thẩm định phương pháp phân tích [5] 25 2.4.1 Tính đặc hiệu chọn lọc .26 2.4.2 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 26 2.4.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .29 2.4.4 Xác định độ lặp lại (độ xác) 31 2.4.5 Xác định độ 32 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 3.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 35 3.2 Tối ưu điều kiện xác định Flavonoid thiết bị HPLC 35 3.2.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng xác định 35 3.2.2 Lựa chọn pha tĩnh để tách chất flavonoids .35 3.2.3 Khảo sát lựa chọn tốc độ pha động 36 3.2.4 Khảo sát lựa chọn nhiệt độ buồng cột: 36 3.2.5 Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu: .37 3.2.6 Khảo sát pha động 38 3.2.7 Khảo sát chương trình gradient 42 3.3 Khảo sát trình xử lý mẫu : .45 3.3.1 Phương pháp xử lý mẫu xác định chất Flavonol Aglycon .47 IV Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang 3.3.2 Phương pháp xử lý mẫu xác định chất Isoflavon .47 3.4 Đánh giá phương pháp phân tích: 48 3.4.1 Độ đặc hiệu chọn lọc bước sóng phân tích 48 3.4.2 Đánh giá độ lặp lại hệ thống 49 3.4.3 Khảo sát lập đường chuẩn 51 3.4.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 52 3.4.5 Độ lặp lại phương pháp: 54 3.4.6 Độ phương pháp 57 3.5 Áp dụng phân tích số mẫu thực tế: .59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 79 V Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT ACN Acetonitrile Acetonitril GC Gas chromatography Sắc ký khí AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa Chemists học phân tích thức EU European Union Châu Âu HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography IUPAC International Union of Pure and Liên minh quốc tế hóa học Applied Chemistry ứng dụng LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantity Giới hạn định lượng MeOH Methanol metanol RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối THF Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SPE solid phase extraction Chiết pha rắn UV Ultraviolet Tử ngoại VIS Visible Vùng ánh sáng nhìn thấy R Recovery Độ thu hồi S/N Signal to noise ratio Tỷ lệ tín hiệu nhiễu ppm Parts per million Nồng độ phần triệu USP United States Phamacopeia Dược điển Mỹ USFDA United States Food and Drug Cục dược phẩm thực phẩm Administration Mỹ VI Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học số flavonoid xác định đề tài Bảng 1.2: Các phương pháp phân tích flavonoid HPLC 12 Bảng 2.1: Danh mục chất chuẩn 21 Bảng 2.2: Nồng độ dung dịch chuẩn gốc chất 21 Bảng 2.3 Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) .32 Bảng 2.4: Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 33 Bảng 2.5: Quy định độ thu hồi hội đồng châu Âu 33 Bảng 3.1: Danh mục pha động khảo sát .39 Bảng 3.2: Mối quan hệ hàm lượng flavonoid (mg/viên) viên nén Ginkgo Intensiv với thể tích methanol dùng để chiết mẫu .46 Bảng 3.3 Mối quan hệ hàm lượng isoflavonoid (mg/g) bột đậu nành với dung môi dùng để chiết 48 Bảng 3.4: Các phương trình hồi quy tuyến tính mối tương quan diện tích pic nồng độ flavonoid .51 Bảng 3.5: LOD LOQ flavonoid .53 Bảng 3.6: Độ lặp lại phương pháp 54 Bảng 3.7: Kết phân tích độ thu hồi, độ lặp lại 55 Bảng 3.8: Kết phân tích độ thu hồi, độ lặp lại 55 Bảng 3.9: Độ lặp lại Daizdein 56 Bảng 3.10: Độ lặp lại Genistein 56 Bảng 3.11: Độ phương pháp 57 Bảng 3.12: Độ thu hồi Daizdein 59 Bảng 3.13: Độ thu hồi Genistein 59 VII Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc chung flavonoid .3 Hình 1.2: Cấu trúc chung euflavonoid Hình 1.3: Cấu trúc chung isoflavonoid Hình 1.4: Cấu trúc chung neoflavonoid Hình1.5 : Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 19 Hình 2.1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến 23 Hình 2.2 Đồ thị tương quan tín hiệu đo nồng độ chất phân tích 27 Hình 2.3 Đường chuẩn mẫu thực .28 Hình 2.4: Xác định LOD cách tính S/N 30 Hình 3.1: Sắc đồ phân tích chất flavonoid cột ODS Inersil 36 Hình 3.2: Sắc đồ phân tích chất flavonoid với tốc độ 0,9ml/min .36 Hình 3.3: Sắc đồ phân tích chất flavonoid với nhiệt độ buồng cột 450C 37 Hình 3.4 Sắc đồ phân tích flavonoid với thể tích tiêm mẫu 50µl 38 Hình 3.5: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm (A): ACN (B) acid acetic 0,1%; 40 Hình 3.6: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm 40 (A): ACN (B): acid acetic 0,1%; 1%TCA 40 Hình 3.7: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm (A): methanol (B): acid acetic 0,1%; 1%THF .41 Hình 3.8: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp flavonoid với pha động gồm (A): methanol (B): acid formic 0,1%; 1%THF 41 Hình3.9: Sắc đồ tách hỗn hợp flavonoid cột C18 tốc độ dịng 1ml/phút theo chương trình Gradient 43 Hình 3.10 Sắc đồ tách hỗn hợp flavonoid cột C18 tốc độ dòng 1ml/phút theo chương trình Gradient 43 Hình 3.11 Sắc đồ tách hỗn hợp flavonoid cột C18 tốc độ dịng 1ml/phút theo chương trình Gradient 44 Hình 3.12: Đường chuẩn EGCG .51 VIII Luận văn thạc sĩ Hồng Quỳnh Trang Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn LOD flavonoid bước sóng 360nm 52 Hình 3.14: Sắc đồ chạy chuẩn LOD flavonoid bước sóng 260nm 53 Hình 3.15 Quy trình phân tích mẫu thực 60 IX Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ • KẾT LUẬN: Sau hoàn thành đề tài này, sở nghiên cứu khảo sát điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng kỹ thuật HPLC để xác định đồng thời hàm lượng số flavonoid thực phẩm thực phẩm chức năng, thu kết sau: Xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng số flavonoid thực phẩm thực phẩm chức gồm có 02 nội dung: - Q trình xử lý mẫu: phù hợp với loại đối tượng mẫu + Phương pháp chiết trực tiếp: Cân 0,5-1g mẫu vào ống ly tâm 50ml Thêm khoảng 30ml methanol 80%/nước, lắc đều, rung siêu âm 15 phút, ly tâm với tốc độ 6000vịng/5phút Gạn lấy phần dịch vào bình định mức 50ml, phần cặn chiết lần với 15ml dung môi chiết Gộp dịch chiết định mức dung mơi chiết, lọc qua màng lọc 0,45µm, phân tích HPLC + Phương pháp xử lý mẫu xác định chất Flavonol Aglycon: Cân 1-2g mẫu vào ống ly tâm 50ml, thêm 35 ml dung dịch Ethanol:H2O:HCl đặc (50:20:8) Thủy phân 60 phút nhiệt độ 900C, để nguội ly tâm 6000 vòng/phút phút, gạn lấy phần dịch phía Thêm 10 ml methanol vào phần cặn, lắc phút đem ly tâm, gộp phần dịch cho vào bình định mức 50ml, định mức methanol Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm, phân tích HPLC + Phương pháp xử lý mẫu xác định chất Isoflavon: Cân 1-2g mẫu vào ống ly tâm 50ml, thêm 35 ml dung dịch acetonitril:HCl 4N (8:2) Thủy phân 800C/2 giờ, để nguội ly tâm 6000 vòng/phút phút, gạn lấy phần dịch phía Thêm 10 ml dịch chiết vào phần cặn, lắc phút đem ly tâm, gộp phần dịch cho vào bình định mức 50ml, định mức acetonitril Lọc qua màng lọc 0,45 µm, phân tích HPLC - Các điều kiện chạy máy HPLC: + Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm) tiền cột + Pha động: Kênh (A): methanol kênh (B): 0,68 g natri format pha lít nước dùng cho HPLC, dùng acid formic điều chỉnh pH=3,0 Thêm 10ml dung dịch 66 Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang THF Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm + Nhiệt độ cột: 400C; tốc độ dịng: 1,1ml/phút ; thể tích tiêm mẫu: 50µl + Detector PDA với bước sóng 260nm 360nm, quét phổ từ 200-400nm Phương pháp xác định khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn cho flavonoid, xác định LOD, LOQ flavonoid, có độ chọn lọc, độ lặp lại, độ thu hồi tốt, đáp ứng yêu cầu AOAC Áp dụng quy trình phân tích để xác định hàm lượng chất flavonoid mẫu thực phẩm thực phẩm chức lấy ngẫu nhiên thị trường cho kết tốt Các mẫu có nguồn gốc đậu nành qua kiểm tra đánh giá cho thấy hàm lượng Flavonoids tương đối cao hợp chất chống oxi hóa tự nhiên tốt cho sức khỏe người nên sử dụng thường xuyên Đối với mẫu thực phẩm chức qua kiểm tra cho thấy hàm lượng chất phù hợp với công bố nhà sản xuất Từ kết thu được, nhận thấy phương pháp nghiên cứu xây dựng đề tài phù hợp để xác định hàm lượng số flavonoid thực phẩm thực phẩm chức • KIẾN NGHỊ: Nghiên cứu thực số flavonoid nhiều flavonoid khác mà nghiên cứu chưa đề cập tới Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, tìm phương pháp xácchông định hàm lượng chất khác thuộc nhóm flavonoid nhiều đối tượng phân tích Kết phân tích thực tế cho thấy, chất Flavonoid thường bền không ổn định nên hàm lượng chúng không sản phẩm loại đối tượng mẫu Vì để đảm bảo chất lượng sản phẩm cần ý không trình sản xuất mà trình lưu thông phân phối bảo quản Các kết phân tích mẫu lấy ngẫu nhiên thị trường kết khảo sát ban đầu nhóm nghiên cứu, cần tiếp tục phân tích thêm nhiều mẫu để có kết khái quát hàm lượng flavonoid chất lượng sản phẩm 67 Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tiếng Việt Trần Tử An (2007), Hóa Phân tích II, NXB Y học, Hà Nội, tr.123-144, 168186 Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, khoa Hoá học, Trường ĐHKHTN Hà Nội Nguyễn Văn Ri (2004), Chuyên đề phương pháp tách chất, khoa Hoá học, Trường ĐHKHTN Hà Nội Ngô Văn Thu (2007), Dược liệu học, tập(1), NXB Y học, Hà Nội, tr.259-289 Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc Gia (2011), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội B Tiếng Anh AR Tapas, DM Sakarkar, and RB Kakde (2008), "Flavonoids as Nutraceuticals: A Review", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 7(3), pp 1089-1099 Calderon-Montaño JM, Burgos-Moron E, Perez-Guerrero C, LopezLazaro M (2011), "A review on the dietary flavonoid kaempferol", Mini Rev Med Chem, 11(4), pp 298-344 Chan Hun Jung et al, Cho, Chul Hyung, Kim, Chang Jong (2007), "Anti-asthmatic action of quercetin and rutin in conscious guinea-pigs challenged with aerosolized ovalbumin", Arch Pharmacal Research, 30(12), pp 1599-1607 Chunying Luo, Xiaoli Zou, Yuanqian Li, Chengjun Sun, Yan Jiang, Zhiyun Wu (2011), "Determination of flavonoids in propolis-rich funcitional foods by reversed phase high performance liquid chromatography with diode array detection” Food Chemistry, 127pp.314-320 Crystal Smith, Kevin A Lombard, Ellen B Peffley, Weixin Liu (2003) 68 Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang 10., "Genetic Analysis of Quercetin in Onion (Allium cepa L.) Lady Raider", The Texas Journal of Agriculture and Natural Resource, 16, pp 24-28 11 Fang Fang, Jing-Ming Li, Qiu-Hong Pan, Wei-Dong Huang (2005), "Determination of red wine flavonoids by HPLC and effect of aging", Food Chemistry, 101, pp 428-433 12 Gertrude Rodney, Ann L.Swanson, L.M.Wheeler, Grant N.Smith, and Cecilia S.Worrel (1949), "The effect of a series of flavonoids on hyaluronidase and some other related enzymes", The Journal of Biological Chemistry, 183, pp 739-746 13 Guardia et al., Juarez, AO, Pelzer, LE (2001), "Anti-inflammatory properties of plant flavonoids Effects of rutin, quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat", Il Farmaco, 56(9), pp 683- 687 14 Hao Chen, Yuegang Zuo, Yiwei Deng (2001), "Separation and determination of flavonoids and other phenolic compounds in cranberry juice by high-performance liquid chromatography", Journal of Chromatography A, 913, pp 387-395 15 J.González-Gallego, S Sánchez-Campos y M J Tón (2007), "Antiinflammatory properties of dietary flavonoids", Nutrición Hospitalaria, 22(3), pp 287-293 Jay M Patel (2008), "A Review of Potential Health Benefits of Flavonoids", Lethbridge Undergraduate Research Journal, 3(2), pp 381386 17 Jeffrey B Harborne, Christine A Williams (2000), "Review Advances in flavonoid research since 1992", Phytochemistry, 55, pp 481-504 18 Johnson; Kelley, KW, Johnson, RW (2008), "Luteolin reduces IL-6 production in microglia by inhibiting JNK phosphorylation and activation of AP-1", Proc Natl Acad Sci U.S.A, 105(21), pp 7534- 7539 19 Jun Chen, Yue Song, Ping Li (2007), "Capillary high-performance 69 Luận văn thạc sĩ liquid Hoàng Quỳnh Trang chromatography with mass spectrometry for simultaneous determination of major flavonoids, iridoid glucosides and saponins in Flos Lonicerae", Journal of Chromatography A, 1157, pp 217-226 20 Jun Seong Park, Ho Sik Rho, Duck Hee Kim, and Ih Seop Chang (2006), "Enzymatic Preparation of Kaempferol from Green Tea Seed and Its Antioxidant Activity", J Agric Food Chem, 54(8), pp 2951- 2955 21 M Careri, L Elviri, A Mangia (2000), "Spectrophotometric and coulometric detection in the high-performance liquid chromatography of flavonoids and optimization of sample treatment for the determination of quercetin in orange juice", Journal of Chromatography A, 881, pp 449-460 22 Messina M, Wu AH (2009), "Perspectives on the soy-breast cancer relation.", Am J Clin Nutr, 89(5), pp 1673-1679 23 Metodiewa et al (1997), "Evidence for antiradical and antioxidant properties of four biologically active N,N-Diethylaminoethyl ethers of flavaone oximes: A comparsison with matural polyphenolic flavonoid rutin action”, IUBMB life, 41(5), pp 1067-1075 24 Min Yea, Yan Lib, Yuning Yanc, Huwei Liub, Xiuhong Jic (2002), "Determination of flavonoids in Semen Cuscutae by RP-HPLC", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 28, pp 621-628 25 Navarro-Núđez et al, Palomo, M Martínez, C Vicente, V Castillo, J Benavente-García, O Diaz-Ricart (2008), "Apigenin Inhibits Platelet Adhesion and Thrombus Formation and Synergizes with Aspirin in the Suppression of the Arachidonic Acid Pathway", J Agric Food Chem, 56(9), pp 2970-2976 26 Nöthlings U et al (2007), "Flavonols and pancreatic cancer risk", American Journal of Epidemiology, 166(8), pp 924-931 27 PTLM Karin Janssen, Ronald P Mensink, Frank JJ Cox, Jan L Harryvan, Robert Hovenier, Peter CH Hollman, and Martijn B Katan (1998), 70 Commented [L34]: Format chưa Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang "Effects of the flavonoids quercetin and apigenin on hemostasis in healthy volunteers: results from an in vitro and a dietary supplement study", The American Journal of Clinical Nutrition, 67, pp 255-262 28 Sari H Häkkinen et al, (1999), "Content of the Flavonols Quercetin, Myricetin, and Kaempferol in 25 Edible Berries", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(6), pp 2274-2279 29 Sun Jun-ming, Sun Bao-li, Han Fen-xia, Yan Shu-rong, Yang Hua and Akio Kikuchi (2011), "Rapid HPLC Method for Determination of 12 Isoflavone Components in Soybean Seeds", Agricultural Sciences in China, 10(1), pp 70-77 30 T B Ng, Julia M L Ling, Zheng-Tao Wang, Jin Na Cai and Guo Jun Xu (1996), "Examination of Coumarins, Flavonoids and Polysaccharopeptide for Antibacterial Activity” Gen Pharmac, 27(7), pp.1237-1240 31 Zhang Ting-Ting, Zhou Jin-Song and Wang Qiang (2010), "HPLC Analysis of Flavonoids from the Aerial Parts of Bupleurum Species", Chinese Journal of Natural Medicines, 8(2), pp 107-113 32 Zhanyi Zhao, Lulu Dong, Feng Lin, Yanli Wu (2010), "Simultaneous characterization and quantification of flavonoids in Euonymus alatus (Thunb.) Siebold from different origins by HPLC-PAD-MS", Arabian Journal of Chemistry, 32(2), pp 261-267 71 Commented [L35]: Format? Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang Phụ lục A: Xây dựng đường chuẩn khoảng tuyến tính 800000 700000 Commented [L36]: Phải có tiêu đề: PHỤ LỤC đến phụ lục y = 28867x + 2815.4 R2 = 0.9998 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 10 20 30 Hình A.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng EGCG khoảng 0,4-20ppm 1400000 y = 41354x + 8192.6 R2 = 0.9997 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 10 20 30 40 Hình A.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng Rutin khoảng 0,6-30ppm 72 Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 y = 79704x - 27565 R2 = 0.9998 10 15 20 25 Phụ lục A.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ Myricetin 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 y = 53486x + 12779 R2 = 0.9995 10 20 30 40 khoảng 0,4-20ppm Phụ lục A.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ Daidzein khoảng 0,6-30ppm 3000000 y = 82303x - 21544 R2 = 0.9996 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 10 20 73 30 40 Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang Phụ lục A.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ Quercetin khoảng 0,64-32ppm 2500000 2000000 y = 98500x - 13233 R2 = 0.9996 1500000 1000000 500000 0 10 15 20 25 Phụ lục A.6 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ Luteolin khoảng 0,4-20ppm 3500000 y = 132599x + 8435.5 R2 = 0.9998 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 10 15 20 25 30 Hình A.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ Genistein khoảng 0,5-25ppm 2500000 2000000 y = 105009x - 7576.7 R2 = 0.9998 1500000 1000000 500000 0 10 15 20 25 Hình A.8 Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích nồng độ Kaemferol khoảng 0,4-20ppm 74 80 0.0 2.5 5.0 50 40 7.5 mAU 260nm,4nm (1.00) 70 60 10.0 12.5 75 15.0 15.0 17.5 20.0 17.5 20.0 Hình B2 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp mức nồng độ C2 KAEMPFEROL/22.059/879151 12.5 GENISTEIN/19.551/1628596 10.0 LUTEOLIN/18.774/862710 7.5 QUERCETIN/17.641/1289975 125 KAEMPFROL/21.978/1814539 GENISTEIN/19.480/3324472 LUTEOLIN/18.700/1661723 QUERCETIN/17.576/2533890 DAIDZEIN/15.809/1607005 MYRICETIN/13.504/1318067 RUTIN/11.246/1383925 150 DAIDZEIN/15.852/841581 5.0 EGCG/9.466/726429 mAU 260nm,4nm (1.00) MYRICETIN/13.534/669499 2.5 RUTIN/11.253/716221 75 ECG/8.731/492486 100 EGCG/9.467/358258 0.0 ECG/8.726/250469 Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang Phụ lục B: Sắc đồ phân tích hỗn hợp chuẩn 50 25 -25 22.5 Hình B1 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp mức nồng độ C1 30 20 10 -10 22.5 Luận văn thạc sĩ 15.0 KAEMPFEROL/22.118/336583 17.5 GENISTEIN/19.604/644107 20.0 QUERCETIN/17.700/455577 22.5 LUTEOLIN/18.833/295251 ECG/8.744/116362 25.0 EGCG/9.488/152073 27.5 DAIDZEIN/15.901/310490 30.0 MYRICETIN/13.585/237827 mAU 260nm,4nm (1.00) 32.5 RUTIN/11.283/277700 Hoàng Quỳnh Trang 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 -2.5 -5.0 -7.5 -10.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 KAEMPFEROL/22.218/74984 LUTEOLIN/18.952/71458 GENISTEIN/19.705/172580 5.0 QUERCETIN/17.809/109522 DAIDZEIN/15.989/92213 7.5 MYRICETIN/13.661/52592 ECG/8.769/38529 10.0 EGCG/9.518/39907 mAU 260nm,4nm (1.00) RUTIN/11.327/76518 Hình B3 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp mức nồng độ C3 20.0 22.5 2.5 0.0 -2.5 -5.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình B.4 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp mức nồng độ C4 76 Commented [L37]: Sao sắc đồ xấu Luận văn thạc sĩ Hoàng Quỳnh Trang Phụ lục C Sắc đồ mẫu thêm chuẩn xác định độ lặp lại độ thu hồi mAU 260nm4nm (1 00) 80 70 60 50 40 30 20 10 -10 -20 -30 -40 -50 -60 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 Hình C.1 Sắc đồ mẫu trắng Phụ lục D Sắc đồ phân tích mẫu thực 4500 mAU 260nm,4nm (1.00) 4000 3500 3000 2500 2000 1000 500 /13.496/4582590 /11.965/4066727 1500 -500 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Hình D.1 Sắc đồ phân tích mẫu bột đậu nành 4500 mAU 260nm,4nm (1.00) 4000 3500 3000 2500 /11.952/4161410 1500 1000 500 /13.543/10580755 2000 -500 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 Hình D.2 Sắc đồ phân tích mẫu bột đậu nành 77 17.5 Luận văn thạc sĩ 4500 Hoàng Quỳnh Trang mAU 260nm,4nm (1.00) 4000 3500 3000 2500 2000 /11.990/764359 1000 500 /13.525/1233809 1500 -500 0.0 2.5 10.0 7.5 5.0 15.0 12.5 17.5 Hình D.3 Sắc đồ phân tích mẫu sữa đậu nành Commented [L38]: Nếu pic to ko cần thiết zoom lại để nhìn pic chất phân tích rõ mAU 4500 260nm,4nm (1.00) 4000 3500 3000 2500 2000 /11.995/995756 1000 500 /13.552/2069982 1500 -500 0.0 2.5 5.0 10.0 7.5 12.5 15.0 17.5 /11.938/23510996 1400 1300 1200 /13.495/18314513 Hình D.4 Sắc đồ phân tích mẫu sữa đâu nành mAU 254nm,4nm (1.00) 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 -100 -200 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 Hình D.5 Sắc đồ phân tích mẫu bột mầm đậu nành 78 Luận văn thạc sĩ DAIZDEIN/11.953/2238359 mAU 260nm,4nm (1.00) 125 100 GENISTEIN/13.506/2200529 Hoàng Quỳnh Trang 75 50 25 -25 0.0 5.0 2.5 15.0 12.5 10.0 7.5 Hình D.6 Sắc đồ phân tích mẫu bột mầm đậu nành 80 mAU 360nm, 4nm (1 00) 60 50 40 KAEMPFEROL/19.502 QUERCETIN/16.282 70 30 20 10 -10 0 10 15 20 Hình D.7 Sắc đồ phân tích mẫu Ginkob mAU 360nm4nm (1 00) 800 750 700 650 600 550 500 400 350 300 250 KAEMPFEROL/20.829 QUERCETIN/16.735 450 200 150 100 50 0 10 15 20 Hình D.8 Sắc đồ phân tích mẫu Nattoinfo 79 Luận văn thạc sĩ 35 Hoàng Quỳnh Trang mAU 360nm4nm (1 00) QUERCETIN/17.409 30 25 20 KAEMPFEROL/21.981 15 10 -5 -10 -15 0 15 10 20 Hình D.9 Sắc đồ phân tích mẫu Atzopic 80 ... chức năng, tiến hành thực đề tài ? ?Xác định hàm lượng flavonoids thực phẩm kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao HPLC” với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời số flavonoid thực. .. cầu kỹ thuật phân tích cao Mặt khác thực phẩm chức có mặt nồng độ lớn phù hợp với tách sắc ký lỏng sử dụng dectecter PDA Do vậy, tiến hành xác định hàm lượng số Flavonoid thực phẩm thực phẩm. .. pháp HPLC 1.5.1 Nguyên tắc chung sắc ký lỏng Sắc ký lỏng trình tách xảy cột tách với pha tĩnh chất rắn chất lỏng pha động chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng- lỏng) Mẫu phân tích chuyển lên cột