Nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời strychnin và brucin trong bột mã tiền chế và hoàn hydan bằng phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Về các phương pháp đinh lượng alcaloid trong mã tiền và trong các chế phẩm đông dược có chứa mã tiền,trong các tài liệu đã tham khảo chứng tôi thấy: Hầu hết các Dược điển Dược điển Việt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRUỜNG ĐẠI HỌC • • Dược • HÀ NỘI •

D S Phạm Thị Giảng

NGHIÊN CỨU ĐịNH TÍNH , ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI• * • •

HOÀN HYDAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC K Ý LỎNG

HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Kiểm nghiêm dược phẩm và độc chất học

Mã số : 30205

CÔNG TRÌNH TỐT NGHIỆP THẠC s ĩ DUỢC HỌC

Người hưởng dẫn khoa hoc:

PGS.TS Trịnh Văn Quỳ

TS Phan Túy

Hà Nội - 1999

Đ ề tài này được ứiực hiện tại Viện Kiểm nghiệm - Bộ Y tế, dưới sự hướng dẫn của PGS TS Trịnh Văn Quỳ- Giám đốc Viện Kiểm nghiệm và TS Phan Tuý, cấn bộ giảng dạy bộ môn Hoắ đại cương - Vô Cơ-Hoá lý của Trường Đại học Dược Hà nội.

Đ ể hoàn thành đ ề tài này, chúng tồi đã nhận được sự chỉ dẫn tận tình của PGS.TS Trịnh Văn Quỳ, TS.Phan Tuý.

Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi cũng nhận được những ý kiến đóng góp quí báu của PGS.Phạm Gia H u ệ, PGS TS Trần Tử An ,TS Trịnh Văn Lẩu, PGS TS Phạm Quang Tùng và PGS.TS Bùi Kim Liên cùng các ửiầỵ,cô giáo Đồng ửiời chúng tôi cũng luôn nhận được sự giúp đỡ nhiệt thử của cấc bạn đồng nghiệp tại cắc phòng Đông Dược, phòng Thuốc chuẩn và phòng Vật lý-Đo lường của Viện Kiểm nghiệm.

Nhân dịp này, chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với sự giúp

đỡ quý báu của các ứiẩỵ,cô giáo và các bạn đồng nghiệp.

Ds Phạm Thị Giảng

1 3 - M ột số phương pháp đã được áp dụng để chiết xuất

1 4 - M ột số phương pháp đã được áp dụng để định

lượng alcaloid toàn phần, strychnin và

2.1 Đối tượng nghiên cứu. 21

2.2.1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất strychnin và brucin

từ nguyên liệu bột mã tiền chế và hoàn Hydan 22

2.2.1.1 Khảo sát phương pháp chiết theo Dược điển Trung Quốc

1997, Dược điển Việt Nam n, tập 3 và phương pháp của

2.2.1.2 Phương pháp đề xuất chiết strychnin và brucin từ bột mã

2.2.2 Xây dựng phương pháp HPLC để phân tích định tính và

đinh lượng đồng thời strychnin và brucin trong bột mã

2.2.2.2 Xây dựng phương pháp định tính và đinh lượng đồng

thời strychnin và brucin trong bột mã tiền chế và hoàn Hydan 24

3.2.1 Nghiên cứu phương pháp chiết strychnin và brucin từ bột

3.2.1.1 Khảo sát phương pháp chiết theo Dược điển Trung Quốc

3.2.1.2 Khảo sát phương pháp chiết theo Dược điển Nhật 1996 30

3.2.2 Xây dựng phương pháp xác đinh đồng thời strychnin và

3.2.2.1 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký để định tính và đinh lượng

đồng thời strychnin và bracin trong mã tiền chế

3.2.2.2 Xây dựng phương pháp định tính và đinh lượng đồng thời

strychnin và brucin trong mã tiền chế và hoàn Hydan 45 3.2.2.3 Áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để đinh lượng

đồng thời strychnin và brucin trong hoàn Hydan 54

CTD -V TYT : Công ty Dược -Vật tư y tế.

PHẦN MỞ ĐẦU

Vị thuốc mã tiền từ lâu đã được dùng trong cả tây y và đông y Vị thuốc này cũng được đưa vào một số Dược điển của các nước như: Dược điển Trung Quốc 1997, Dược điển Nhật 1996, Dược điển Anh 1980 .Để giảm độ độc của vị thuốc này, trong y học cổ truyền người ta chỉ dùng dưới dạng mã tiền đã chế biến (Mã tiền chẽ) Có nhiều cách chế biến như: chế vói dầu vừng hoặc dầu lạc, rang với cát, chế với cam thảo Mã tiền chế là thành phần chính trong nhiều chế phẩm thuốc uống, trong các chế phẩm đó, có hoàn Hyđan của Công ty Dược phẩm tỉnh Thanh Hóa được Bộ Y tế cấp số đăng ký cho phép sản xuất và lưu hành trên thị trường Hoàn Hỵdan được người tiêu dùng ưa chuông trong điều trị các bệnh thấp khớp ,viêm dây thần kinh và đau nhức xương.

Trong hoàn Hydan có bột mã tiền chế chứa các alcaloid, trong đó strychnin

là thành phần chính có tác dụng nhưng độc tính cao Bên cạnh đó, brucin, một alcaloid rất độc cũng chiếm một tỷ lệ lớn sau strychnin và rất dễ gây ngộ độc khi dùng thuốc Vì vậy, việc xác đinh chính xác hàm lượng cả strychnin và brucin trong nguyên liệu mã tiền chế với dầu vừng cũng như ừong hoàn Hydan là vấn

đề cần quan tâm ứong công tác tiêu chuẩn hoá và kiểm tra chất lượng để thuốc vừa có hiệu lực chữa bệnh lại vừa an toàn cho người bệnh.

Trước đây, trong tiêu chuẩn cơ sở của vị thuốc mã tiển chế với dầu vừng cũng như tiêu chuẩn cơ sở của hoàn Hydan, phương pháp định lượng chỉ mói dừng lại ở mức độ xác đinh hàm lượng alcaloid toàn phần Trong những năm gần đây, Công ty Dược - Vật tư y tế Thanh Hóa đã nghiên cứu xây dựng phương pháp quang phổ tử ngoại để đinh lượng strychnin nhưng chưa đề cập tới việc xác đinh hàm lượng brucin nên chưa kiểm soát được độ an toàn của thuốc Mặt khác, trong hoàn Hydan ngoài bột mã tiền chế bằng dầu vừng còn có các thành phần khác như: cao đặc Hy thiêm, cao đặc Ngũ gia bì chân chim có chứa các hoạt chất khác làm cho kết quả thu được bằng phương pháp quang phổ không ổn đinh.

Vì vậy hiện nay, trong tiêu chuẩn chất lượng xin cấp số đăng ký sản xuất

và lưu hành mặt hàng này, Công ty vẫn sử dụng phương pháp đinh lượng alcaloiđ toàn phần Riêng nguyên liệu bột mã tiền chế bằng dầu vừng, ngoài việc đinh lượng alcaloid toàn phần, ứong tiêu chuẩn cơ sở còn định lượng strychnin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại nhưng chưa có phương pháp định lượng brucin.

Về các phương pháp đinh lượng alcaloid trong mã tiền và trong các chế phẩm đông dược có chứa mã tiền,trong các tài liệu đã tham khảo chứng tôi thấy: Hầu hết các Dược điển (Dược điển Việt nam I tập 1 , Dược điển Pháp IX tập 1 và Dược điển Liên Xô X ) đều định lượng alcaloid toàn phần bằng phương pháp trung hòa sau khi chiết các alcaloid bằng dung môi thích hợp hoặc định lượng riêng strychnin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại (Dược điển Anh 1980; Dược điển Trung Quốc 1988, 1997; Dược điển Việt Nam n tập 3) Trong Dược điển Nhật 1996 ,strychnin trong mã tiển chưa chế được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sau khi chiết strychnin bằng ether Nói chung các Dược điển đều chưa đề cập tới việc định lượng brucin ữong mã tiền nói chung cũng như trong mã tiền chế bằng dầu vừng nói riêng.Một số tài liệu khác trong những năm gần đây đã đề cập đến việc định lượng strychnin và bnicin trong mã tiền chưa chế, mã tiền chế cũng như trong các chế phẩm đông dược có chứa mã tiền bằng phương pháp quang phổ , HPLC.Tuy nhiên trong các tài liệu

mà chúng tôi đã tham khảo, chưa có tác giả nào nêu lên qui trình chiết xuất và đinh lượng đồng thòi strychnin và brucin trong mã tiền chế bằng dầu vừng cũng như trong hoàn Hydan bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Sau khi tham khảo các tài liệu và căn cứ vào tình hình thực tế của công tác kiểm tra chất lượng thuốc hiện nay, đặc biệt là đối với các chế phẩm thuốc có chứa dược liệu độc, chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời strychnin và bmcin ứong bột mã tiền ch ế và ữong hoàn Hỵdan bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Mục tiêu của công trình tốt nghiệp:

Xây dựng phương pháp chiết và đinh tính, định lượng đồng thời strychnin

và brucin đủ tin cậy nhằm góp phần vào công tác tiêu chuẩn hoá chất lượng vị thuốc mã tiền chế dầu vừng cũng như hoàn Hydan.

- Nội dung của công trình tốt nghiệp.

+ Khảo sát chọn phương pháp chiết thích hợp để chiết hoàn toàn strychnin và brucin từ bột mã tiển chế dầu vừng và từ hoàn Hydan.

+ Xây dựng chương trình sắc ký để đinh tính và định lượng đồng thời strychnin

và brucin trong các dịch chiết thu được từ các dịch chiết ữên trên.

- Ý nghĩa khoa học của công trình tốt nghiệp.

+Góp phần triển khai và ứng dụng một kỹ thuật tiên tiến và chính xác vào công tác kiểm ưa chất lượng thuốc đông dược có chứa dược liệu độc nói chung và hoàn Hydan nói riêng.

- Ý nghĩa thực tiến của công ừình tốt nghiệp.

+Kết quả của công trình tốt nghiệp là cơ sở về mặt khoa học để xây dựng phương pháp định tính , định lượng strychnin và brucin trong chuyên luận mã tiền của Dược điển Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.

+Giúp Công ty Dược-Vật tư y tế Thanh Hoá nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng hoàn Hydan nhằm đảm bảo an toàn và hiệu lực của chế phẩm này.

«L «£» -L* -X- alt ^ jli *Lf + 1 ? jli

»7* »x» 'T * •T* •T* T * *T* •T* ' I s v *T* ' 1' 1 '

Trong y học cổ truyển, người ta chỉ sử dụng mã tiền đã chế biến (Mã tiền chế) Có nhiều phương pháp chế biến khác nhau, ữong đông y hay sử dụng các phương pháp sau đây:

- C hế với dầu vừng, dầu lạc.

Đây là phương pháp phổ biến nhất; trong phương pháp này cũng có nhiều cách làm khác nhau Thông thường là ngâm hạt mã tiền trong nước vo gạo khoảng 36 giờ cho mềm, lấy ra loại bỏ vỏ ngoài và mầm ,thái mỏng, sấy khô, tẩm ướt bằng dầu vừng để qua đêm, sau đó sao vàng đậm cho hết dầu vừng rồi cho vào lọ kín Hoặc sau khi sấy khô cũng có thể đem rán với dầu vừng cho đến khi nổi lên thì vớt ra, dùng giấy bản thấm hết dầu, sấy khô và cho vào lọ kín

[4 ],[2 2 1

- Rang với cắt.

Ngâm hạt mã tiền trong nước 36 giờ đến khi mềm, bỏ vỏ ngoài và cây mầm oếu có Sấy khô, sau đó cho vào cát nóng rang đến màu vàng đậm hơi phồng lên, lấy ra sàng loại cát, xát sạch và tán thành bột mịn Bột được bảo quản trong lọ kín [ 4 ].

- C hế với cam thảo.

Ngâm hạt mã tiền vào nưóe vo gạo một ngày đêm, vớt ra, rửa sạch và cho vào nổi nấu với cam thảo ứong 3 giờ theo công thức: lOOg hạt mã tiến cho vào 400ml nước và 20g cam thảo Lấy dần hạt mã tiền ra, bóc vỏ khi còn nóng Đun dầu vừng cho sôi, sau đó bỏ hạt mã tiền vào đến khi thấy hạt nổi lên thì vớt ra ngay, thái nhỏ, sấy khô và đóng lọ kín [4],[7].

Công ty Dược - Vật tư y tế Thanh Hóa đã áp dụng cách chế biến mã tiền bằng dầu vừng.

Sau khi chế biến; độc tính và hàm lượng alcaloid toàn phần cũng như hàm lượng strychnin, brucin đều giảm và mức độ giảm khác nhau tùy theo phương pháp chế biến [2],[21],[29]. Người ta thấy rằng, trong các loại mã tiền chế, hàm lượng alcaloid toàn phần cũng như hàm lượng strychnin, bracin giảm so với mã tiền chưa c h ế , trong đó mã tiền chế với dầu vừng giảm nhiều nhất [21].

Tắc dụng, độc tính và công dụng.

Người ta cho rằng tác dựng của mã tiền là do tác dụng của strychnin Nó tác dụng vào tất cả các cơ quan như: dạ dày, hệ thần kinh, tim Tác dụng nhiều hay ít tùy theo liều lượng Vái Hếu thích hợp, nó kích thích dây thần kinh và điều hòa sự hoạt động của thần kỉnh, đăc biệt là tủy sống, có tác dụng làm tăng huyết

áp do co mạch ngoại vi Mã tiền còn có tác dụng khai vị, giúp tiêu hóa, giảm đau, tiêu sưng [3 ] ,[4], [10]. Mã tiền là vị thuốc rất độc,với liều cao nó gây co giật, co cứng kiểu uốn ván, có thể chết do liệt hô hấp[20],[40]. Mã tiền chưa chế được bảo quản theo chế độ thuốc độc bảng A, trong khi đó mã tiền chế được bảo quản theo chế độ thuốc độc bảng B [9].

Mã tiền chưa chế được dùng làm nguyên liệu để chiết xuất strychnin và bracin hoặc thường chỉ dùng ngoài làm thuốc xoa bóp chữa nhức mỏi chân tay

do thấp khớp, đau dãy thần kinh dưới dạng cồn thuốc

Y học cổ truyền dùng mã tiền chế để điều trị đau nhức, sưng khớp, đau dây thần kinh, suy nhược thần kinh, bại liệt, nhược cơ, tiêu hóa kém Dùng với liều:

Người lán: - Liều thường dùng uống: 0,05g/ lần

và 0,15g /ngày.

- Liều tối đa uống : 0,1 Og /lần

và 0,30g / ngày.

Trẻ em dưới 2 tuổi không được dùng.

Từ 2 tuổi trở lên dùng mỗi lần 0,003g cho mỗi tuổi [4], [7], [10], [16], [17], [19], [30], [32].

Trong Dược điển Trung Quốc, người ta qui định, không dùng mã tiền chưa chế, không được dùng quá liểu qui đinh Jkhông được dùng trong thời gian dài và chống chỉ định đối với người có thai [42], [43],

1.2 Vài nét về một số alcaloid chính của mã tiền.

1.2.1 Strychnin.

Strychnin là strychnidin - 10-on, có công thức phân tử :C21H22N20 2 [36],

[471 [48]. Strychnin có thể tổn tại dưới dạng base hoặc các dạng muối hydroclorid [36], dạng sulfat [ 44], [19 7 và dạng nitrat [14 ]. Hai dạng sulfat và niừat hay được dừng trong ngành Dược Strychnin có công thức cấu tạo (I).

(D

Độ tan. Strychnin ở dạng muối dễ tan trong nước, tan được ứong ethanol và không tan trong các đung môi hữu cơ Ngược lại, dạng base lại không tan trong nước, tan được trong các dung môi hữu cơ Strychnin base tan ở tỷ lệ 1/5 ừong cloroform, 1/150 trong ethanol và 1/260 trong methanol , tan rất ít trong ether.Strychnin có pKt = 6,0 và PK2 = 11,7.

Đặc tứứi phổ hấp thụ tử ngoại.

Trong dung dịch nước - acid, phổ hấp thụ tử ngoại của strychnin có cực đại tại X = 254nm với A (l% ,lcm ) = 373 và trong dung dịch nước - kiềm, phổ hấp thụ tử ngoại của strychnin có 2 cực đại tại 255nm và 278nm [36],

Strychnin thường được dùng dưới dạng thuốc tiêm để chữa tê liệt dây thần kinh cơ, suy nhược cơ năng, mỏi mệt, mới ốm dây, kém ăn Có tác dụng làm giải ngộ độc thuốc ngủ barbituric [4],[5],[6],[22] Strychnin là thuốc độc bảng A, được dùng dưới dạng uống và tiêm với liều tối đa [ 9 ] sau đây:

Do độc tính cao nên strychnin còn được dùng làm thuốc diệt chuột [20], [36], [40].

1 2.2 Brucĩn.

Brucin là 10,11-Dimethoxystrychnin, có công thức phân tử: C23H26N20 4 [30], [36] Brucin có thể tồn tại dưới dạng base hoặc các dạng muối hydroclorid, sulfat, nitrat Ở dạng base khan có nhiệt độ nóng chảy ở 178°c và dạng base hydrat chảy ở khoảng 105°c Brucin có công thức cấu tạo (n).

ƠD

Độ tan.

Brucin ở dạng muối dễ tan ứong nước, tan 1/105 trong ethanol và không tan ừong các dung môi hữu cơ Dạng base là bột kết tinh trắng, rất đắng và không tan trong nước, tan được ưong các dung môi hữu cơ lg brucin base tan trong 0,8ml methanol, trong 1,3ml ethanol, trong 5ml cloroform, trong 25 ml ethyl acetat và ứong 187ml ether.Brucin có pKj = 6,04 và pKj = 11,7

Tấc dụng và cô n g dung.

Brucin có tác dụng kích thích thần kinh trung ương tương tự strychnin

vậy, bmcin hầu như ít được dùng làm thuốc mà chủ yếu dùng làm thuốc thử trong phân tích [21], [30], [39], [40], [47], [48].

1.3 Một số phương pháp đã được áp dụng để chiết xuất

strychnin và brucin từ bột mã tiền.

Muốn đinh lượng được chính xác hàm lượng alcaloid toàn phần nói chung cũng như strychnin và bnicin nói riêng trong bột mã tiền, vấn đề đầu tiên cần phải quan tâm là chọn phương pháp chiết thích hợp Phương pháp chiết lỏng - rắn thường được áp dụng để chiết các hoạt chất từ dược liệu Ở giai đoạn này, cách

xử lý mẫu là rất quan trọng vì mẫu phân tích thường chứa một hỗn hợp phức tạp các chất có bản chất hóa học rất khác nhau Vì vậy cách xử lý trước khi chiết bằng pha lỏng cũng rất khác nhau nhưng nói chung có một số giai đoạn sau:

- Nghiền nhỏ mẫu dược liệu để tăng diện tích tiếp xúc với dung môi Độ mịn của dược liệu ảnh hưởng đến hiệu xuất chiết Tuy nhiên tùy theo từng dược liệu mà chọn độ mịn thích họp vì có trường hợp độ mịn tăng là táng lượng hoạt chất cần chiết nhưng đồng thòi cũng làm tăng lượng tạp chất gây trở ngại cho quá ứình định lượng.

- Loại tạp chất trước khi chiết Ví du như loại chất béo bằng ether dầu hỏa, loại màu bằng than hoạt [1],

Các phương pháp chiết trong những tài liệu mà chứng tôi đẵ tham khảo được có thể phân thành ba cách sau:

1.3.1 Chiết bằng cách ngâm hoặc lắc siêu âm.

- Qui trình chiết theo Dược điển Tiệp khắc năm 1987 [14 ] (Dung m ôi: ether- cloroform và tài liệu[52]( dung môi cloroform).

Thêm 3,0ml đung dịch natri carbonat IM, lắc manh 1 giờ 3,000g dược liệu đã +20g ether ^

lắc manh

Lọc lớp ether-cloroform qua

giấy lọc khô Lấy 20g dịch lọc

bốc hơi trên cách thuỷ còn 3ml

1.3.2-C hiết gián đoạn.

- Qui ữình chiết theo Dược điển Nhật [50] (Dung môi ỉà ether).

1.3.3 Chiết liên tục.

Phương pháp này được áp dụng ừong Dược điển Anh [35] để đinh lượng strychnin trong bột mã tiền Qui trình chiết có thể tóm tắt như sau:

1.4 M ột số phương pháp đã được áp dụng để định lượng alcaloid toàn phần, strychnin và brucin hoặc strychnin trong bột mã tiền.

Sau khi chiết được alcaloid từ bột mã tiền bằng các phương pháp trên, người ta tiến hành đinh lượng alcaloid toàn phần, strychnin hoặc đinh lượng đồng thời strychnin và brucin bằng một ứong các phương pháp sau đây:

1 4.1 Phương pháp chuẩn độ acid - kiềm.

Các alcaloid trong bột mã tiền có tính base có khả năng tạo thành muối với các acid vô cơ, nên người ta đã tiến hành định lượng alcaloid toàn phần bằng phương pháp trung hòa [11],[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18],[44] với chỉ thị là methyl đỏ theo nguyên tắc sau đây:

B + HA( cho dư) = [BH]A + HA (dư)

HA (dư) + NaOH = Na A + H20 Trên cơ sở của phương pháp này, một số tác giả đã áp đụng để định lượng alcaloid toàn phần trong một số chế phẩm đông dược chứa bột mã tiển chế như viên Kim mã [25], hoàn Hydan [12].

Cũng có thể xác đinh hàm lượng strychnin trong hỗn hợp các alcaloid đã được tinh chế bằng cách đùng hỗn hợp acid sulfuric 5%, acid nitric 50% và natri nitrit để phá hủy brucin Sau đó chuyển strychnin sang dạng base, chiết bằng cloroform, bốc hơi cloroform Thêm một lượng chính xác acid sulfuric 0,1N để hòa tan cắn và chuẩn độ acid dư bằng natri hydroxyd 0,1N [16], [17], [18], [19], [21], [44].

Để xác đinh hàm lượng bracin, có tác giả dựa vào nguyên tắc nêu trong Dược điển Pháp [4 4 ] để đinh lượng alcaliod toàn phần, sau đó phá hủy brucin và tiến hành đinh lượng strychnin Hàm lượng brucin có trong dược liệu là hiệu số giữa hàm lượng alcaloid toàn phần và hàm lượng strychnin [21]. Tất nhiên phương pháp này không thể chính xác vì trong alcaloid toàn phần ngoài strychnin và bracin còn có các alcaloid khác.

Phương pháp trung hòa yêu cầu lượng mẫu thử quá lán khoảng lOg bột mã tiến, tương ứng với gần 1000 viên hoàn Hy dan, sai số lớn và kết quả thu được không cho biết chính xác hàm lượng strychnin và brucin Do vậy phương pháp này chủ yếu áp dụng để định lượng alcaloid toàn phần ứong bột mã tiền chế và chưa chế.

1.4.2 Phương pháp đo quang phổ tử ngoại.

Hiện nay, phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại hay được dùng để định lượng strychnin trong bột mã tiền Phương pháp này dựa trên định luật Lambert - Beer là mật độ quang của dung dịch một chất ở một bước sóng nào đó tỉ lệ thuận với nồng độ và bề dày của lớp dung dịch đem đo:

D = k l.c Trong đó: k là hệ số hấp thụ

c là nồng độ.

1 là bề đày của lớp dung dịch đem đo.

Trong trường hợp c tính theo nồng độ phần trăm (kl/tt), 1 tính bằng cm thì

hệ số hấp thụ k được gọi là hệ số hấp thụ riêng, ký hiệu là E (l% ,lcm ) và lúc này

ta có:

D = E (l% ,lc m ) c.l

Đối với dung dịch có hai thành phần mà tại các bước sóng cần đo tuân theo đinh luật Lambert - Beer và mật độ quang có tính cộng tính, thì mật độ quang của dung dịch tại 1 bước sóng đã cho bằng tổng mật độ quang của từng thành phần ở bước sóng đó Trong trường hợp dung dịch chứa strychnin, brucin được đo ở hai bước sóng 262nm và 300nm trong cốc lcm , ta sẽ có hệ phương trình bậc nhất 2 ẩn số:

A 262 = E s262(l% ,lc m ).C s + E b262(l% ,lcm ).C b

A300 = E s300(l% ,lc m ).C s + E b300(l% ,lcm ).C b

Trong đó: - Es262(l% ,lcm ) tại A,=262nm và Es300(l% ,lcm ) tại x=300nm của strychnin đã biết trước

- Eb262(l% ,lcm ) tại A,=262nm và Eb300(l% ,lcm ) tại ^=300nm của brucin đã biết trước.

- A262 là mật độ quang của dung dịch đo được tại Ằ-=262nm.

- A300 là mật độ quang của dung dịch đo được tại A-=300nm.

Giải hệ phương trình bậc nhất 2 ẩn số trên ta sẽ tính được Cs và Cb (hàm lượng phần trăm của strychnin và brucin) trong dung dịch đem đo.

Sau khi chiết hoàn toàn strychnin và brucin ứong bột mã tiền, người ta dựa vào nguyên tắc trên để tiến hành đinh lượng strychnin trong dịch chiết bằng cách

đo mật độ quang ở hai bước sóng 262nm và 300nm [19], [26], [27], [28], [34], [42], [43].

Với phương pháp này lượng mẫu thử sử dụng ít hơn nhiều so với phương pháp trung hòa và chủ yếu dùng để đinh lượng strychnin trong mã tiền chưa chế,

mã tiền chế Một số tác giả cũng đã áp dụng phương pháp này để định lượng strychnin trong chế phẩm đông dược có chứa mã tiển như: viên nén Vifotin[28],

hoàn Hydan/2Ố/ Tuy nhiên trong các tài liệu trên, người ta mới áp dụng phương pháp này để đinh lượng strychnin còn brucin chưa được đề cập tới Trong tài liệu

[27] người ta đã dựa vào nguyên tắc nêu trên để định lượng đồng thời strychnin

và brucin trong bột mã tiền chưa chế Song đối vói các chế phẩm đông dược có chứa một lượng nhỏ bột mã tiền cùng với các dược liệu khác như hoàn Hydan thì việc đinh lượng đồng thời strychnin và brucin bằng phương pháp quang phổ tử ngoại sẽ gặp nhiều khó khăn.

Ngoài ra người ta còn sử dụng phương pháp sắc ký lóp mỏng kết hợp với phương pháp đo quang để đinh lượng strychnin và brucin trong các chế phẩm đông dược Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: sau khi chiết strychnin và brucin ừong các chế phẩm, tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng với chương trình sắc

ký thích hợp để tách strychnin và brucin rồi đo mật độ quang của các vết trực

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (H PLC).

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp phân tích hóa lý dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc, nhưng không hoà lẫn vào nhau: pha tĩnh (trong cột hiộu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Pha động cùng vói mẫu thừ được bơm qua cột dưới áp xuất cao và các chất cần phân tích di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau tùy theo ái lực của chúng vói hai pha dẫn đến sự tách giữa các chất Sự tách này đạt được là do quá trình phân bố, hấp phụ hoặc trao đổi ion

Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện gọi là detector Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp Detector hay được sử dụng nhất là detector ƯV Đường cong rửa giải sau một quá trình sắc ký được gọi là sắc ký đổ, nó thường có dạng như hình 1.

t0 (Thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống tách.

tR (Thời gian lưu): Thời gian cần thiết kể từ khi chất được bơm vào cột cho đến khi đạt được nồng độ cực đại của nó, xuất hiện ở thời điểm cuối của hộ thống tách.

t ’R (Thời gian lưu thực) = tR - 10.

ôt (Độ lệch chuẩn): Độ rộng nửa píc tại các điểm uốn tương ứng

coa 5 : Độ rộng píc ở nửa chiều cao = 2,354 5t

cob : Độ rộng đáy pic.

Hình 1 Cẩc thông số thời giãn của sắc đồ (pic) được mô tả trên hình vẽ.

Thời gian lưu tfc là thông tin về mặt định tính của sắc đồ Nó là một hằng

số đối với một cấu tử đã cho khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi Để đặc trưng cho một chất, thuận lợi hơn, người ta đùng hệ số dung lượng k’ Thường tính k' theo công thức:

k' = — = Í ã HI s — ỈR.-1 Ợ)

^0 ^0 ^0 Trong thực tế các giá trị k' giữa 2 và 5 là tốt nhất; các giá trị k' lớn hơn chỉ dẫn đến sự doãng pic, độ nhậy thấp và thời gian phân tích kéo dài.

Hai chất chỉ được tách ra nếu chúng có giá trị k' khác nhau và được đánh giá thông qua độ chọn lọc a :

a = ặ = V ^ L (k’2> k ’,) (2)

Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết ưên cột (N) Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức:

R = ^ R' ~ hk. 1 = z lĩìl

®4.1 + ab,2 ^0,3.1 + ^0,5.2

(4 )

Độ phân giải phụ thuộc vào các thông số k2 {hệ số dung lượng của cấu tử

ra sau), độ chọn lọc a và số đĩa lý thuyết N của cột thông qua công thức:

để chiết các alcaloid từ bột mã tiền và từ các thuốc đông dược có chứa mã tiền rồi tiến hành đinh lượng strychnin hoặc cả strychnin và bracin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Trong các tài liệu mà chúng tôi đã tham khảo, các tác giả đã nêu lên một số chương trình sắc ký sau đây để phân tích các alcaloid của bột mã tiền.

Chương trình sắc ký của PGS Phạm Gia Huệ và cộng sự [38] nghiên cứu tối ưu hóa pha động với qui trình sắc ký sau đây để tách 8 alcaloid của hạt mã tiền: Cột sắc ký: Nucleosil C8 (5|im,15cm X 4,6mm)

Pha động: Acetonitril 10% - Tetrahydrofuran 10% - dung dịch đệm

Để đinh lượng strychnin trong bột mã tiền chưa chế, Dược điển Nhật [50]

cũng đầ nêu qui trình sắc ký gồm các điểu kiện sau đây:

Cột sắc ký : Cột thép không gỉ có kích thước 15cm X 4mm

được nhồi bởi silicagel đã octadecylsilan hóa

có kích thước 5fiin.

Pha động : Hòa tan 6,8g kali dihydro phosphat trong nưóe vừa đủ

1000ml, sau đó ừộn với acetonitril và triethylamin theo tỉ lệ (45:5:ltt/tt) và điếu chỉnh đến pH =3.0 với acid phosphoric.

Nhiệt độ c ộ t : Nhiệt độ phòng Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu

strychnin khoảng 17 phút.

Detector UV: Ở bước sóng 210 nm.

Cũng có tác giả [34] đã nêu lên chương trình sắc ký sau đây để định lượng strychnin trong mã tiền:

Cột có kích thướe 30cm X 3,9mm được nhồi Porasil (10fim).

Pha động : cloroform có 1 % diethylamin -cyclohexan(3:2).

Tốc độ dòng : 0,5ml/phút Detector U Y 280nm Một chương trình sắc ký khác được áp dụng để định lượng strychnin trong thuốc đông dược Shenjin Dan [41] cố mã tiền chế:

C ộ t : Ultrasphere - Cyano ( 5|im , 15cm X 4,6mm ) Pha động : Methanol - nước - acid acetic-triethylamin

(1960 : 31: 6 :3 tt/tt) Tốc độ dòng : lml/phút

Detector u v 254nm Robert Verpoorte và cộng sự [45] đã đưa ra chương trình sắc ký với các điều kiện sau đây để tách các alcaloid của bột mã tiền :

Cột sắc ký : Merckosorb Si 60 (30cm X 2,0mm, 5 ụjn) Detector ư v 254nm

Pha động 1 : Ether ethylic chứa ì % diethylamin

(tốc độ dòng : 2,0ml/phút) Pha động 2 : Ether ethylic - methanol (1 :1 )

(tốc độ dòng : l,15ml/phút) Zhou Guisheng , Liu Naiqing , Sun Xingong và cộng sự [54] đã xác định hàm lượng strychnin trong hạt mã tiền bằng phương pháp HPLC với chương trình sắc ký sau đây :

Cột Zorbax Sil (lOjom, 150mm X 4,6mm) Pha động : Methanol 0,1 mmol/I - acid acetic 0,1 mmol/1 - amoni

acetat (80:15:5) Detector u v 254nm

Xu, L H ; Lu , J [52] đã nghiên cứu định lượng strychnin và bmcin bằng phương pháp HPLC với chương trình sau đây :

Cột Platinum Silica ( 15cm X 4,6mm).

Pha động : N- Hexan-Diclomethan - Methanol- Amoniac đặc

(950:950:100:7).

Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút Bước sóng xác định : 254nm.

Villar , A ; Rios , J L ; Gonzalez , J M [SlJsử dụng chương trình sau: Cột Silica A ( 25cmx 2,6mxn).

Pha động : Qoroíorm-methanol-dietìiylamm hoặc ether -methanol-

diethylamin với tốc độ từ 0,5-l,5ml/phút Hoặc có thể dùng pha đảo với cột HC ODS /Sil ( 25cmx 2,6mm), pha động là methanol có hoặc không có 0,1 % diethylamin Tốc độ dòng : 0 ,5 -1 ,5 ml/phút.

Bước sóng phát hiện : 254nm.

Ngoài các phương pháp đã nêu trên, còn có thể định lượng strychnin trong

mã tiền bằng các phương pháp khác như: phương pháp so màu, phương pháp cân, phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan, hay phương pháp sắc ký khí [4], [21], [36].

Sau khi tham khảo các tài liệu và xuất phát từ tình hình thực tế về các phương pháp định lượng strychnin và brucin trong bột mã tiền cũng như các chế phẩm đông dược có chứa bột mã tiền là một dược liệu độc, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời strychnin và brucin trong bột m ã tiền ch ế và trong hoàn Hydan bằng phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)"

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u

2 1 Đối tượng nghiên cứu.

- Mẫu Mj là bột mã tiền chế (phương pháp chế dầu vừng) đạt chất lượng theo tiêu chuẩn cơ sở, do Công ty Dược -Vật tư y tế (CTD-VTYT)Thanh Hoá cung cấp.Mảu này dùng để khảo s á t, xây dựng phương pháp HPLC để định tính

và đinh lượng đồng thời strychnin và brucin ừong bột mã tiền chế.

- Mẫu M2 là bột hoàn Hyđan tự tạo, được chế theo công thức hoàn Hyđan của CTDVTYT Thanh Hoá từ các nguyên liệu đạt tiêu chuẩn chất lượng đã đăng

ký do Công ty cung cấp.Mẫu M2 có các thành phần như sau:

-Cao đặc ngũ gia bì chân chim 0,005g

Hỗn hợp trên được trộn đều, sấy khô, tán mịn, rây qua rây có cỡ mắt rây 0,2mm.

Mẫu M2 được dùng để khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khác ữong hoàn Hydan tới quá trình đinh tính và định lượng đồng thời strychnin và brucin bằng phương pháp HPLC.

Trong quá trình nghiên cứu, hai mẫu Mj và M2 được tiến hành song song Sau đó so sánh kết quả để đánh giá sự ảnh hưởng của các thành phần khác tới quá trình chiết xuất, đinh tính và định lượng strychnin và bracin trong hoàn Hydan.

- 3 mẫu hoàn Hydan do CTDVTYT Thanh Hoá sản xuất,đang lưu hành trên thị tnròng có các số kiểm so á t: + 421198

+ 451298

+

010199-Tiến hành định tính và định lượng đồng thời strychnin và brucin trong 3 mẫu này bằng phương pháp HPLC đã xây dựng

2 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu.

2 2 1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất strychnin và brucin từ nguyên liệu bột mã tiền chế và hoàn Hydan.

2 2 1 1 Khảo sất phữơng pháp chiết theo Dược điển Trang Quốc 1997, Dơợc điển Việt Nam n , tập 3 và phương pháp của Dược điển Nhật 1996 trên mẩu Mj và M2

2 2 1 2 Phơơng pháp đ ề xuất chiết strychnin và bm ciũ từ bột mã tiền ch ế

và bột hoàn Hydan tự tạo M2 (xem sơ đồ chiết xuất).

a- Đối vói bột mẵ tiền ch ế (mẫu M j):

Cân chính xác khoảng 0,15g bột mã tiền chế đã được nghiền mịn và rây qua cỡ rây 0,2mm vào một bình nón nút mài dung tích 100ml Thêm l,5g bột nhôm oxyd trung tính, trộn đều Làm ẩm hỗn hợp bằng 0,5ml dung dịch amoniac đậm đặc, ừộn kỹ Đậy kín và để yên 20 phút Chiết 4 lần, mỗi lần dùng 25ml hỗn hợp cloroform - methanol ( 3 : 1 ) bằng cách lắc siêu âm 45 phút Gộp các dịch chiết và làm bay hơi trên cách thuỷ tới cạn Cắn được hoà tan và chuyển hết vào bình đinh mức 25ml bằng methanol và thêm methanol đến vạch Lắc đều rồi lọc qua giấy lọc thường, sau đó lọc qua giấy lọc cỡ 0,45ịj.m được dung dịch thử

b - Đối vói mẫu hoàn Hydan tự tạo (mẫu M J:

Cân chính xác một lượng bột mẫu hoàn Hydan tự tạo (mẫu M2) có chứa khoảng 0,15g bột mã tiền chế đã được nghiền mịn và rây qua cỡ rây 0,2mm vào một bình nón nút mài dung tích 100ml Thêm 4,0g bột nhôm oxyd trung tính, trộn đều Làm ẩm hỗn hợp bằng l,5m l dung dịch amoniac đậm đặc Trộn kỹ rồi đậy bình ,để yên 20 phút Chiết 4 lần, mỗi lần 25ml hỗn hợp cloroform - methanol ( 3 : 1 ) bằng cách lắc siêu âm 45 phút Gộp các dịch chiết và làm bay hơi trên cách thuỷ tới cạn Dùng methanol để chuyển hết cắn vào bình định mức

2 2 2 Xây dựng phương pháp HPLC để phân tích định tính và định lượng đồng thời strychnin và brucin ứong bột mã tiền chế và hoàn Hydan.

2 2 2 1 Khảo sát điều kiện sắc ký.

Trên cơ sở cột có sẵn :Lichrosorb RP8 (5|im; 250 X 4mm), chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương trình sắc ký thích hợp.

a - Khảo sát chọn pha động và tốc độ dòng thích hợp cho phép tách đồng thời strychnin và brucin ra khỏi hỗn hợp phân tích-

b - Khảo sát chọn bước sóng xác đinh đổng thời strychnin và brucin.

c - Chương trình sắc ký đã chọn.

Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách strychnin và brucin trong dịch chiết từ mẫu Mj và M2 như : pha động và tốc độ dòng, bước sóng phát hiện, chúng tôi đã chọn một chương trình sắc ký vód các điều kiện sau đây cho phép tách được strychnin và brucin:

jLil-* Nhiệt độ phân tích: Nhiột độ phòng.

2 2 2 2 Xây dựng phữơng pháp định tính và định lượng đồng thời strychnin

và brucin tirong bột m ã tiền ch ế và hoàn Hydan.

a - Kiểm ùna độ tính khiết của pic strychnin và brucin thu được trên sắc ký

đồ của dich chiết mẫu thử bằng máy HPLCkết nối detector diode array.

b - Xây dựng phươngphẩp định tính đồng thời sữychnin và brucin.

Sử đụng máy HPLC: Hewlett Packard 1100 - detector diode array để định tính đồng thời strychnin và brucin dựa vào việc so sánh các thông số: thời gian

lưu tR và phổ hấp thụ tử ngoại-khả kiến thông qua hệ số match của mẫu chuẩn và mẫu thử.

c - Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời strychnin và brucừi.

Để đinh lượng đồng thòi hai thành phần chính là strychnin và bracin trong bột mã tiền chế và hoàn Hydan bằng phương pháp HPLC, chúng tôi tiến hành:

+ Khảo sát độ Ổn định của hệ thống sắc ký

+Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ strychnin và brucin với diện tích pic trên sắc ký đồ.

+ Khảo sát độ lặp lại của phương pháp.

+ Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm.

Trên cơ sở đó,chọn nồng độ đinh lượng của mẫu chuẩn và thử nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát và tiến hành đinh lượng bằng cách so sánh diện tích pic mẫu chuẩn và mẫu thử được thực hiện trên cùng điều kiện sắc ký, từ đó tính ra hàm lượng strychnin và brucin trong các chế phẩm cần phân tích theo công thức: * Đối với bột mã tiền chế.

Trong đó: Sị., sc: Là diộn tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn

mc : Lượng cân chuẩn (mg).

Cc : Hàm lượng chuẩn (%).

mT : Lượng cân mẫu thử (mg).

ìn v : Khối lượng trung bình viên (mg).

b : Độ ẩm của nguyên liệu (%).

2 2 3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả.

2.2 3 1 - Đánh giá hiệu quả chiết.

Để đánh giá hiộu quả ch iết, dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng trên bản silica gel G tráng sẵn Merck với hệ dung m ô i: methanol - amoniac (95:5), phát hiện bằng thuốc thử Dragendorff.

2 2 3 2 - Định tính.

- Thời gian lưu và hình dạng pic của từng chất trên sắc ký đồ của mẫu thử

và mẫu chuẩn phải như nhau.

- Phổ hấp thụ tử ngoại- khả kiến của các pic thu được của mẫu thử phải trùng với phổ hấp thụ của các chất chuẩn tương ứng dựa trên hệ số match Hệ số match là hệ số toán học nói lên mức độ tương tự của hai phổ được đem so sánh

Hệ số match được biểu thị bằng công thức toán học sau:

n : Là số điểm so sánh.

E : Tổng các số liệu.

Khi hệ số match =1000 có nghĩa là hai phổ giống nhau hoàn toàn.

Khi hệ số match > 950 thì chỉ ra rằng hai phổ tương tự nhau.

Khi hệ số match từ 900 đến 950 chỉ ra rằng hai phổ có những điểm tương

tự nhau, nhưng khi kết luận cần cân nhắc cẩn thận.

Khi hệ số match nhỏ hơn 900 có nghĩa là hai phổ khác nhau [24].

2 2 3 3 Định lượng.

CHƯƠNG 3

TH Ị/C NGHIỆM , K Ế T QUẢ VÀ B À N LUẬN

3 1 Dụng cụ, hoá chất và nguyên vật liệu

3 1 1 Dụng cụ.

- Máy lắc siêu âm Branson 5200 ( U.S.A.).

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hewlett Packard 1100- Detector

UVhoặc diode array được nối với máy tính Vectra 500, máy in Laser Jet 6L.

- Cân phân tích.

- Bản mỏng Silicagel G (bản tráng sẵn của Merck).

Nồi cách thuỷ.

- Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết.

- Máy quang phổ ƯV-VIS

3 1 2 Hoá chất, nguyên vật liệu

- Chuẩn làm việc strychnin base.

- Chuẩn làm việc brucin base.

- Amoniac đậm đặc: PA.

- Cloroform: PA.

- Methanol: PA.

- Ether ethylic: PA.

- Pha động cho sắc ký lớp mỏng:Methanol-amoniac đậm đặc(95:5).

- Thuốc thử Dragendorff (TT).

Nhôm oxyd trung tính cỡ hạt đến 200jj.m.

- Các dược liệu khác và tá dược có trong hoàn Hydan.

- Dung dịch đệm pH = 2,75 Hoà tan 32,6g kali dihydrophosphat trong 250ml nước, điều chỉnh pH = 2,75 bằng acid phosphoric.

3 2 Thực nghiệm, kết quả và bàn luận.

3 2 1 Nghiên cứu phương pháp chiết strychnin và brucin từ bột

mã tiền chế và hoàn Hydan.

3.2 1 l.K hảo sát phương pháp chiết theo Dược điển Trung Quốc 1997 và Dược điển Việt Nam n , tập 3.

a-Chiết bằng cách ngâm lanh.

Cân chính xác khoảng 0,4g bột mẫu Mj hoặc một lượng bột mẫu M2 có chứa khoảng 0,4g bột mã tiền chế vào một bình nón nút mài dung tích 100ml Thêm chính xác 20ml cloroform và 0,3ml amoniac đậm đặc vào mỗi bình Đậy chặt bình, cân Ngâm trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó cân lại, bổ sung khối lượng mất đi bằng cách thêm cloroform ,lắc đều, lọc lấy dịch chiết.Dượe điển Trung quốc 1997 và Dược điển Việt Nam n tập 3 chi chiết một lần như ữên , sau đó lấy chính xác lOml dịch chiết đem tinh chế và định lượng strychnin bằng phương pháp đo quang.

Để thăm dò xem cách chiết một lần như ừên đối với bột mã tiền chưa chế

có phù hợp với bột mã tién chế với dầu vừng và hoàn Hydan hay không, đồng thời với cách chiết như vậy đã chiết được hoàn toàn strychnin và brucin trong hai mẫu nghiên cứu Mị , Ms chưa, chúng tôi tiến hành khảo sát như sau:

Bã còn lạị sau khi chiết lần 1 được chiết thêm lần thứ 2 và lần thứ 3 theo phương pháp chiết như lần 1 Dịch chiết 2 được cô đặc 2 lần và dịch chiết 3 được

cô đặc 5 lần Chấm riêng biệt 30|J.1 mỗi dịch chiết và dung dịch chuẩn có chứa 0,04mg strychnin và 0,024m g brucin trong lml methanol lên bản mỏng Silicagel

G Triển khai sắc ký vói hệ dung môi methanol-amoniac (95 : 5) đến khi dung môi đi được 2/3 bản mỏng, để khô bản mỏng ở nhiệt độ phòng rồi phun thuốc thử Dragendorff.

Kết quả thực nghiệm cho thấy ứên sắc ký đồ của dịch chiết 2 và 3 vẫn xuất hiện vết strychnin và brucin Điều đó chứng tỏ bã dược liệu sau khi chiết lần

1 và lần 2 vẫn còn một lượng đáng kể strychnin và brucin.Như vậy, phương pháp chiết này không phù hợp cho mã tiền chế dầu vừng và hoàn Hydan

b - Chiết bằng cắch lắc siêu âm một lấn.

Tiến hành giống như phương pháp ngâm lạnh nhưng thay phương pháp ngâm lanh bằng cách lắc siêu âm 40 phút sau đó lọc được dịch chiết 1 Lấy 10ml dịch lọc này đem tinh chế và tiến hành đinh lượng strychnin bằng phương pháp

đo quang Để đánh giá khả năng chiết 1 lần bằng cách lắc siêu âm đã chiết được hoàn toàn strychnin và brucin trong mẫu nghiên cứu hay chưa, chúng tôi đã tiến hành thử như đã mô tả ỏr mục a (chiết bằng cách ngâm lạnh) Kết quả sau khi phân tích bằng sắc ký lớp mỏng các dịch chiết lần 2 và dịch chiết lần 3 đã cô đặc như ứên cho thấy rằng ừong các dịch chiết lần 2 và lần 3 vẫn còn vết strychnin

và brucin.

Mặt khác, khi theo dõi quá trình chiết theo phương pháp của Dược điển Trung Quốc 1997 và Dược điển Việt Nam n, tập 3, chúng tôi nhận thấy rằng ừong quá trình chiết bột dược liệu thường bị bết vón lại mà không phân tán đều trong dung môi, có thể đó là do đặc điểm của bột mã tiền chế bằng dầu vừng Do

đó, sự tiếp xúc giữa mẫu thử với dung môi bị hạn chế và ảnh hưởng không tốt đến hiệu quả của quá trình ch iết.

Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi thấy rằng phương pháp chiết xuất alcaloid ghi trong DĐ Trung Quốc 1997 và DĐ Việt Nam n , tập 3 thích hợp với bột mã tiền chưa chế nhưng không thích hợp với bột mã tiền chế bằng dầu vừng

và bột hoàn Hydan.

3 2 1 2 Khảo sát phương pháp chiết theo Dược điển Nhật 1996.

Cân chính xác khoảng 1,00g mẫu Mị đã tán nhỏ và sấy khô ở 60°c trong 8 giờ cho vào Ống ly tâm, làm ẩm bằng lml amoniac đậm đặc, thêm 20ml ether Lắc trong 15 phút và ly tâm.Gạn lấy phần chất lỏng trong.Lặp lại thao tác này 3 lần nữa Dịch chiết ether của các lần chiết được để riêng và làm bay hơi trên cách thuỷ đến khô Hoà tan cắn trong methanol và tiến hành xác định bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng như mục 3.2.1.1 Kết quả thu được cho thấy lượng strychnin và brucin chiết được hầu như không đáng kể ngay cả ở dịch chiết lần l,ứong khi đó trên sắc ký đồ của các lần chiết có chứa một lượng đáng kể các alcaloid khác có ứong mã tiền.

Theo phương pháp này, lượng bột mã tiền cần thiết để thử là l,00g, tương đương gần 100 viên hoàn Hydan, như vậy không thể đem chiết trong ống ly tâm được.Do đó, phương pháp chiết này không thể thực hiện được cho viên hoàn Hydan.

Từ kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi có thể kết luận rằng phương pháp chiết alcaloid theo Dược điển Nhật 1996 chỉ áp dụng cho bột mã tiền chưa chế mà chưa thích hợp cho việc chiết xuất strychnin và brucin trong bột mã tiển chế bằng dầu vừng và bột hoàn Hydan.

3 2 1 3 Khảo sát điền kiện chiết thích hợp

a- Khảo sẩt dung m ôi chiết xuất.

Chứng tôi đã tiến hành khảo sát trên một số dung môi mà Dược điển các nước và các tài liệu thường sử dụng để chiết alcaloid của mã tiền Các dung môi đó là:

Dung môi 1 : Cloroform.

Dung môi 2 : Methanol Dung môi 3 : Hỗn hợp cloroform -methanol ( 3 : 1 ) Dung môi 4: Hỗn hợp ether - cloroform (3 : 1).

Quá trình khảo sát đựơe tiến hành trên 2 mẫu Mj và M2 theo qui trình sau:

Cân chính xác 4 mẫu thử Mj , mỗi mẫu khoảng 0,150g vào 4 bình nón nút mài dung tích lOOml đã được đánh số thứ tự từ 1 đến 4 Tiến hành chiết theo phương pháp đã nêu ở mục 2.2.1.2a nhưng thay dung môi chiết bằng các dung môi sau:

Bình 1: 25ml dung môi 1.

Bình 2: 25ml dung môi 2.

Bình 3: 25ml dung môi 3.

Bình 4: 25ml dung môi 4.

Tiến hành chiết 4 lần Gộp dịch chiết các lần lại với nhau theo từng bình Bốc hơi dịch chiết ưên cách thuỷ tới cạn Dùng methanol để hoà tan và chuyển hết cắn vào 4 bình đinh mức 25ml tương ứng, thêm methanol đến vạch Lắc đểu rồi lọc qua giấy lọc thường, sau đó lọc qua giấy lọc cỡ 0,45jj.m (các đung dịch thử Mj).

Chuẩn bị như trên với 4 mẫu thử M2 và tiến hành chiết theo mục 2.2.1.2b

(các dung dịch thử M2).

Tiến hành chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) các dung dịch thử với chương trình sắc ký như đã nêu ở mục 2.2.2.1c so sánh với dung dịch chuẩn chứa 0,04mg strychnin và 0,024mg brucin ưong lml methanol.

Kết quả được trình bày ở các hình 2a, 2b,2c,2d và 2e là các sắc ký đồ thu được của mẫu chuẩn và các dịch chiết từ mẫu thử M2 bằng các dung môi khác nhau Qua kết quả trên thấy rằng:

Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn có hai pic: strychnin (tR= 11.46) và brucin (tR=16,03) Chiết bằng dung môi 1 và 3, sắc ký đồ thu được cho hai píc có thời gian lưu và hình dạng giống với các pic strychnin và brucin Chiết bằng dung môi 2 và 4, sắc ký đồ thu được ngoài hai píc có thời gian lưu và hình dạng giống với các pic strychnin và brucin còn có hai píc khác có thời gian lưu khoảng 13,5

và 18,0 Hơn nữa, thông qua diện tích píc thu được cũng thấy rằng trong cùng một điều kiện chiết, dung môi 3 cho phép chiết được lượng hoạt chất nhiều nhất ( Bảng I). Từ kết quả trên, chúng tôi sử dụng dung môi 3 tiến hành chiết một mẫu trắng tự tạo gồm các thành phần của hoàn Hydan nhưng không có bột mã tiền chế Kết quả thu được ghi ở Hình 2f cho thấy rằng chiết bằng dung môi này các thành phần khác trong hoàn Hydan không ảnh hưởng tới chiết xuất và định lượng strychnin , brucin trong hoàn Hydan.

VWD1 A, W avelength=265 nm (G IANG\S-B00044.D)

Ợ Ì f-p

H ình 2 b : Sắc ký đổ của dịch chiết mẫu thử M2 với dung môi 1, stiycbnin(tR= l1,273) và

brucin(tg=15,990)

Last changed

c :\HPCHEM\1\METH0DS\GIANG.M 8/26/99 9:00:36 AM by Lien (modified after loading)

Hình 2 c: Sắc ký đồ của dịch chiết mẫu thử M2 với dung môi 2, strychnin (tR= l 1,106)

và brucm ( tg=15,968) và hai pic khấc có tg=l3,433 và 18,072

Hình 2 d : Sắc ký đồ của dịch chiết mẫu thử M2 với dưng môi 3,

strychnin(tR= l1,532) và brucỉn(tR= 16,064)